CC BY
121
№ 3 - 2014 г.
14.00.00 медицинские и фармацевтические науки
УДК 616-097:537.86
КОНСТРУИРОВАНИЕ ФАГМИДНОГО
ВЕКТОРА ДЛЯ ДИСПЛЕЯ ФРАГМЕНТОВ АНТИТЕЛ ЧЕЛОВЕКА
К. А. Иванова1. Д. В. Шаньшин12. Д. Н. Щербаков1
1ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (р.п. Кольцово, Новосибирская область) 2ФГБОУ ВПО «Алтайский государственный университет» (г. Барнаул)
В работе проведен теоретический дизайн искусственного гена, кодирующего элементы для встройки и экспрессии вариабельных доменов антител. Из фагмиды pBluescript II SK+ были удалены сайты рестрикции, препятствующие клонированию целевых нуклеотдиных последовательностей. С использованием олигонуклеотид-направленного мутагенеза была встроена нуклеотидная последовательность, соответствующая сайту рестрикции Age I. По встроенному сайту и сайту Sal I был клонирован синтезированный искусственный ген. Таким образом, была сконструирована и охарактеризована секвенированием и рестрикционным анализом векторная система для получения библиотек антител.
Ключевые слова: фаговый дисплей, антитела, фаговые библиотеки, фагмида.
Иванова Ксения Анатольевна — аспирант первого года очной формы обучения по специальности «молекулярная биология» отдела биоинженерии, Стажер-исследователь отдела биоинженерии ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», e-mail: ivanova_ka@vector.nsc.ru
Шаньшин Даниил Васильевич — студент 5-го курса ФГБОУ ВПО «Алтайский государственный университет», г. Барнаул, лаборант отдела биоинженерии ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», е-mail: Dan6091154224@mail.ru
Щербаков Дмитрий Николаевич — кандидат биологических наук, старший научный сотрудник отдела биоинженерии ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», e-mail: scherbakov_dn@vector.nsc.ru
Введение. Терапевтические препараты антител по объёму производства занимают на мировом фармацевтическом рынке второе место после вакцин. В клинической практике используется около 30-ти препаратов, предназначенных, главным образом, для лечения онкологических и хронических заболеваний. В стадии испытаний находятся ещё сотни производных антител [1]. Одним из основных методов поиска таких антител является технология фагового дисплея [2].
Технология фагового дисплея с использованием in vitro аффинной селекции позволяет
находить последовательности вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей антител, которые распознают мишень с высокой точностью. Принципы фагового дисплея — это конструирование обширной библиотеки антител и скрининг ее с целью поиска интересующего варианта. Библиотека создается путем клонирования генов вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей антител в составе конструкции на основе фагмидного вектора.
Цель работы: конструирование фагмидного вектора для дисплея фрагментов антител человека.
Материалы и методы. За основу конструкции взяли плазмиду pBluescript II SK+. Для теоретического дизайна искусственного гена использовали программу Vector NTI 8 (Life Technologies). Для удаления нуклеотидных последовательностей использовали рестриктазы Sfr274 I (шизомер Xho I) и Kpn I (НПО «Сибэнзим», г. Новосибирск). Для олигонуклеотид-направленного мутагенеза использовали рестриктазы AsiG I (изошизомер Age I), Hind III, Psi I и Pfu ДНК полимеразу (НПО «Сибэнзим», Новосибирск). «Затупление» концов проводили с помощью фермента Mung Bean нуклеаза (НПО «Сибэнзим», г. Новосибирск). Лигирование проводили лигазой Т4 фага (НПО «Сибэнзим», г. Новосибирск). Для клонирования синтетической последовательности гена использовали рестриктазы AsiG I (изошизомер Age I) и Sal I (НПО «Сибэнзим», г. Новосибирск).
Для получения компетентных клеток использовался кальциевый метод. В работе использовали E. coli штамм Dh5aF'. Клетки трансформировали продуктами лигирования и высевали на плотную селективную среду LB, содержащую 200 мг/мл ампициллина, для отбора трансформантов. Наработку клонов проводили на LB-бульоне с добавлением ампициллина 200 мг/мл.
Очистку ДНК проводили с помощью наборов GeneJET Gel Extraction Kit, GeneJET PCR Purification Kit, GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo scientific, Литва).
Секвенирование всех образцов было проведено в ЦКП «Геномика», г. Новосибирск. Все олигонуклеотиды, использованные в работе, были синтезированы в лаборатории ООО «Медиген», г. Новосибирск. Искусственная последовательность ДНК была синтезирована на автоматическом синтезаторе ABI З400 DNA/RNA Synthesizer («ДНК синтез», г. Москва).
Наличие делеции подтверждали при помощи аналитической П^ (рис. 1), для которой были рассчитаны праймеры P3 и P4 с помощью программы Vector NTI 8 (Life Technologies) (табл. 1), а также секвенированием.
Таблица l
Олигонуклеотидные последовательности, использованные в работе
Название Последовательность нуклеотидов
P1 S'-gataagcttgatatcgaattcctg-З'
P2 S'-ctcacatgttctttcctgcgttat-З'
P3 S'-aatacgactcactatagggcgaa-З'
P4 S'-accctcactaaagggaacaa-З'
Вектор 1 S'-ggaattgtgagcggataacaatttaccggtcacacaggaaacagctatgaccagt-З'
Вектор 2 S'-ccttaacactcgcctattgttaaaaccggtgtgtgtcctttgtcgatactggtac-З'
Примечание: сайты рестрикции: aagctt — Hind III; acatgt — Pci I; accggt — Age I
Для встройки нуклеотидной последовательности, соответствующей сайту рестрикции Age I, использовали метод олигонуклеотид-направленного мутагенеза. Для этого были рассчитаны 2 пары праймеров с помощью программы Vector NTI 8 (Life Technologies) (табл. 1).
Встройку синтетической последовательности гена проводили по сайтам рестрикции Age I и Sal I.
Результаты и обсуждение. Первым этапом работы был теоретический дизайн вектора, кодирующего элементы для встройки и экспрессии вариабельных доменов антител (рис. 1). Были подобраны гетеродимеризующиеся белковые домены, стабилизирующие конформацию вариабельных фрагментов антител как на поверхности фаговых частиц, так и в растворимой форме. Были подобраны лидерные последовательности, адресующие вариабельные фрагменты легкой и тяжелой цепей в разные компартменты клетки E. coli. В конструкцию были включены два сайта связывания рибосом — перед каждым доменом вариабельного фрагмента антител (рис. 1).
Astil Neol Xbal MluI Xlioí Salí
Рис. 1. Схема кассеты для клонирования и экспрессии вариабельных фрагментов антител
Col E1 ori — ориджин плазмиды Col E1; RBS — рибосомсвязывающий сайт; L — лидерная последовательность; VH, VL — последовательности, кодирующие вариабельные участки тяжелой и легкой цепей антител; ccP1, ccP2 — последовательности, кодирующие гетеродимеризующиеся домены белков; HisTag — гистидиновая метка; p3 — ген, кодирующий белок P3 бактериофага Ff; f1 ori — ориджин бактериофага Ff; Age I, Nco I, Xba I, Mlu I, Xho I, Sal I — сайты рестрикции
В результате экспрессии полученной конструкции образуется единая полицистронная матрица под контролем лактозного промотора, присутствующего в исходной плазмиде pBluescript II SK+. В ходе трансляции вариабельных фрагментов тяжелой и легкой цепей образуется отдельный продукт с каждого рибосомсвязывающего сайта, что достигается наличием стоп-кодонов.
Лидерная последовательность pelB, связанная с вариабельным фрагментом тяжелой цепи, адресует его белковый продукт в периплазматическое пространство клетки, изолируя от действия цитоплазматических протеаз, что повышает стабильность продукта, а также исключает преждевременную гетеродимеризацию белковых доменов и образование мини-антител до сборки фага. Аминокислотная лидерная последовательность g3 адресует продукт нуклеотидной последовательности, кодирующей фаговый белок P3 и вариабельный фрагмент легкой цепи к мембране — месту сборки фаговых частиц.
Следующим этапом было удаление сайтов рестрикции из полилинкера плазмиды pBluescript II SK+, препятствующих клонированию целевых нуклеотдиных последовательностей.
Для подтверждения результата была проведена аналитическая ПЦР (рис. 1), для которой были рассчитаны праймеры Р3 и Р4 с помощью программы Vector NTI 8 (Life Technologies) (табл. 1).
Рис. 2. Результат электрофоретического разделения в 1 % геле агарозы фрагментов ДНК, полученных после ПЦР при использовании пары олигонуклеотидных праймеров Р3 и Р4; 1 — ДНК-маркер, длина в п.н.; 2, 3 — pBluescript II SK+; 4 — клон Б5; 5 — клон Б6
Данные гель-электрофореза продуктов ПЦР показали успешное удаление ограничивающих встройку сайтов. Для окончательного подтверждения этих результатов было проведено определение нуклеотидной последовательности плазмиды pBluescript II SK+ W6.
Далее с использованием олигонуклеотид-направленного мутагенеза в плазмиду pBluescript II была встроена нуклеотидная последовательность, соответствующая сайту рестрикции Age I. Результат был подтвержден ПДРФ-анализом (рис. 2), а также определением нуклеотидной последовательности плазмидной ДНК отобранных клонов.
5001
Рис. 3. Результат электрофоретического разделения в 1 % геле агарозы фрагментов ДНК, полученных после проведения рестрикции ферментами Age I и Pci I; 1 — ДНК-маркер, длина в п.н.; 2 — 11 — клоны Б6; 12 — ДНК pBluescript II SK+, отрицательный контроль
По встроенному сайту и сайту Sal I была клонирована синтетическая нуклеотидная последовательность, кодирующая элементы для встройки и экспрессии вариабельных доменов антител.
Была сконструирована и охарактеризована секвенированием и рестрикционным анализом векторная система для получения библиотек антител.
Выводы. Таким образом, в результате выполнения работы проведен теоретический дизайн и сконструирована фагмидная векторная система для получения на ее основе комбинаторных библиотек мини-антител. Векторная конструкция включает в себя сайты рестрикционных эндонуклеаз для встройки последовательностей ДНК, кодирующих
вариабельные домены легкой и тяжелой цепей антител, а также регуляторные элементы, обеспечивающие эффективную экспрессию целевых генов.
Список литературы
1. Strategies and challenges for the next generation of therapeutic antibodies / A. Beck,
T. Wurch, C. Bailly, N. Corvaia // Nat. Rev. Immunol. — 2010. — Vol. 10 (5). — Р. 345-52.
2. Phage display derived therapeutic antibodies / H. Thie, T. Meyer, T. Schirrmann [et al.] // Curr. Pharm. Biotechnol. — 2008. — Vol. 9 (6). — Р. 439-46.
DESIGNING OF PHAGEMID VECTOR FOR THE DISPLAY OF FRAGMENTS OF HUMAN ANTIBODIES
K. A. Ivanova1, D. V. Shanshin12. D. N. Shcherbakov1
1FBSE SRC VB «Vector» (Koltsovo, Novosibirsk region) 2FSBEIHPE «Altai State University» (Barnaul)
Theoretical design of the artificial gene coding elements for a integration and expression of variable domains of antibodies is carried out in the work. The sites of restrictions interfering cloning of target the nucleotide sequences were removed from phagemid pBluescript II SK +. The nucleotide sequence corresponding to site of Age I restriction was built-in with usage of the oligonucleotide -directed mutagenesis. Synthesized artificial gen was cloned on the built-in site and Sal I site. Thus, the vector system for receiving libraries of antibodies was designed and characterized by sequencing and restrictive analysis.
Keywords: phage display, antibodies, phage libraries, phagemid.
About authors:
Ivanova Ksenia Anatolyevna — full-time post- graduate student of the 1st year of «molecular biology» bioengineering department, trainee-researcher of bioengineering department at FBSE SRC VB «Vector», e-mail: ivanova_ka@vector.nsc.ru
Shanshin Daniil Vasilyevich — student of the 5th course at FSBEI HPE «Altai State University», laboratory assistant of of bioengineering department at FBSE SRC VB «Vector», e-mail: Dan6091154224@mail.ru
Scherbakov Dmitry Nikolaevich — candidate of biological science, senior research associate of bioengineering department at FBSE SRC VB «Vector», e-mail: scherbakov_dn@vector.nsc.ru
List of the Literature:
1. Strategies and challenges for the next generation of therapeutic antibodies / A. Beck,
T. Wurch, C. Bailly, N. Corvaia // Nat. Rev. Immunol. — 2010. — Vol. 10 (5). — P. 345-52.
2. Phage display derived therapeutic antibodies / H. Thie, T. Meyer, T. Schirrmann [et al.] // Curr. Pharm. Biotechnol. — 2008. — Vol. 9 (6). — P. 439-46.
