CC BY
60
2006 ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА. Сер. 3. Вып. 2
ФИЗИОЛОГИЯ, БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА
УДК 577.214.337:577.1 12.4:681.3 Т. В. Никитина, Л. И. Тищенко
КОМПЬЮТЕРНОЕ ПРЕДСКАЗАНИЕ ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ САЙТОВ ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ БЕЛКОВ И НЕКОТОРЫЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ ИХ ИССЛЕДОВАНИЯ*
Полученные в настоящее время данные свидетельствуют, что фосфорилирование белков по остаткам серика, треонина и тирозина, осуществляемое различными протеинки-назами, является наиболее распространенной регуляторной модификацией у эукариот [18, 26, 27]. Модификация является обратимой - дефосфорилирование белков, которое происходит с участием протеинфосфатаз, также является регуляторным процессом [26]. Известно, что процессы фосфорилирования и дефосфорилирования белков играют важную роль в регуляции таких ключевых физиологических процессов, как рост, дифференциация и развитие клетки Сигналы от рецепторов клеточной мембраны передаются по различным сигнальным каскадам, и во многих случаях эта передача включает обратимое фосфорилирование различных компонентов этих каскадов [26]. В геноме человека идентифицировано 518 генов, кодирующих протеинкиназы, которые фосфорилируют десятки тысяч внутриклеточных белков [30]. Одним из процессов, в регуляции которого участвуют различные протеинкиназы и протеинфосфатазы, является транскрипция. Во многих случаях было показано, что активность транскрипционных факторов регулируется с помощью фосфорилирования или дефосфорилирования в ответ на внеклеточные сигналы. При этом может изменяться локализация транскрипционных факторов в клетке, стабильность факторов, белок-белковые взаимодействия между разными факторами, ДНК-связывающие свойства белков, структура хроматина [8, 42]. Многие транскрипционные факторы, например, TIF-IA, HSF1, р53 и
х ТТ~~ А "Г 1 1 и _ __ф _ _ __ __»"___
r-ii" ai, могут ^ос^орилпроваться разными пр01синкина^сши ни рсиным саи|ам, чю приводит к разным функциональным последствиям [23]. Большинство протеинкиназ и протеин-фосфатаз, участвующих в регуляции транскрипции, относятся к серин-треониновым ферментам. Однако показано, что у многоклеточных в ядре присутствуют также и тирозиновые киназы и фосфатазы, которые участвуют в регуляции белок-белковых взаимодействий между некоторыми транскрипционными факторами (NFkB, STAT-белки, TFII-I, c-Jun), РНК-полимеразой II и белками гетерогенных ядерных РНП-частиц [13]. Недавно в ядре были обнаружены комплексы некоторых мембранных рецепторов с их лигандами. Цитоплазма-тические домены этих рецепторов обладают Tyr-киназной активностью. Для ряда таких комплексов выявлено, что они связываются со специфичными последовательностями ДНК и выступают в качестве транскрипционных факторов (например, активированные рецепторы эпидермального фактора роста - EGFR) [14].
Регуляторному фосфорилированию и дефосфорилированию подвергаются не только транскрипционные факторы, но и РНК-полимеразы. Известно, что у дрожжей в составе всех
* Работа поддержана грантом Президента РФ (МК-1434.2005.4) и грантом «Университеты России» (ур. ОТО 1.334)
£ Т. В. Никитина, Л. И. Тищенко, 2006
трех РНК-полимераз присутствуют фосфорилированные субъединицы [61. В клетках млекопитающих исследовалось только фосфорилирование in vivo и in vitro РНК-полимераз I и II [16]. В настоящее время роль фосфорилирования в регуляции транскрипции наиболее полно изучена для РНК-полимераз I и II. Показано, что СКИ соочищается с РНК-поли.меразой I и фосфорилирует ее самую крупную субъединицу, а дефосфорилирование РНК-полимеразы I снижает уровень корректной инициации транскрипции in vitro [21, 22]. Другими авторами было продемонстрировано, что фосфорилирование РНК-полимеразы I по определенным сайтам необходимо для правильной инициации транскрипции генов пре-рРНК [19]. Основная мишень протеинкиназ, фосфорилируюших РНК-полимеразу II, - это С-терминальный домен (CTD) ее самой крупной субъединииы. Эта модификация важна для перехода от инициации к элонгации транскрипции, для предотвращения абортивной транскрипции и для созревания ripe-мРНК транскриптов [38]. Фосфорилирование CTD осуществляют ряд протеинкиназ, действующих на различных этапах транскрипции in vivo: CDK7 - компонент базального транскрипционного фактора TFIIH, и CDK8 - компонент холофермента РНК-полимеразы II, участвуют в сборке преиниционного комплекса и инициации транскрипции, a CDK9 - компонент позитивного фактора элонгации P-TEFb (positive transcription elongation factor), участвует в элонгации транскрипции [35, 37]. Идентифицированы также две CTD-фосфатазы, специфично дефосфорилирующие CTD-домен РНК-полимеразы II [44].
Роль других регуляторных модификаций белков (гликозилирования, метилирования, апеллирования и т. д.) в настоящее время изучена мало. Долгое время считалось, что гли-козилированию подвержены только внеклеточные белки и внеклеточные домены мембранных белков. Однако оказалось, что у всех исследованных эукариот многие цитоплазматиче-ские и ядерные белки модифицированы по остаткам серина и треонина добавлением одного остатка N-ацетилглюкозамина. Эта модификация является обратимой и служит для регуляции активности различных белков, в том числе транскрипционных факторов (Spl, API, р53 и др.) и РНК-полимеразы II [15]. Было замечено, что гликозилирование может происходить по тем же остаткам серина и треонина, что и фосфорилирование. Это так называемые сайты «инь-янь». Оказалось, что и гликозилирование может влиять на транскрипцию, не только регулируя белок-белковые взаимодействия между различными ядерными белками, но также конкурируя за одни и те же сайты модификации с фосфорилированием [40]. Таким образом, с помощью гликозилирования осуществляется дополнительный контроль над регуляцией активности белков: в некоторых случаях для фосфорилирования белка может быть недостаточно присутствия соответствующей протеинкиназы, а необходимо, чтобы сайг модификации был дегликозилирован. Причем активация протеинкиназы и дегликозилирование могут индуцироваться разными сигнальными путями, обеспечивая скоординированный ответ клетки на разные сигналы [40]. Мат о изучена роль других модификаций белков при передаче сигнала от мембранных рецепторов факторов роста в клетку. Однако известно, что целый ряд факторов транскрипции может подвергаться множественным регуляторным модификациям, влияющим на их активность. Так, для белка-супрессора опухолей р53 показаны множественные модификации (фосфорилирование, ацетилирование и убиквитилирование) по целому ряду сайтов, которые влияют как на стабильность белка, гак и на его активность как регулятора транскрипции [10].
Подводя итог сказанному, можно с уверенностью утверждать, что исследование ре-гуляторного фосфорилирования белков является актуальной задачей протеомики. Однако решение этой задачи требует комплексного подхода и использования целого набора различных биохимических и молекулярно-биологических методов.
Методы детекции фосфорилированных белков. Для того чтобы исследовать роль фосфорилирования в функционировании конкретного белка, необходимо решить ряд задач: 1) исследовать, фосфорилируется ли белок in vivo и in vitro; 2) выяснить, какие аминокислотные остатки фосфорили-руются в составе белка (Ser, Thr или Туг); 3) определить, какие сайты в составе белка фосфорилиру-
ются (т. е. какое положение в первичной последовательности белка занимают модифицированные остатки); 4) изучить, какие протеинкиназы и протеинфосфатазы участвуют в модификации данного белка при различных воздействиях на клетку; 5) определить, существует ли прочная ассоциация про-теинкиназ и протеинфосфатаз с исследуемым белком; 6) проверить, возможно ли автофосфорилиро-вание белка (т. е. определить, есть ли в его составе потенциальный активный центр протеинкиназы); 7) исследовать, в какие сигнальные пути вовлечен регулируемый белок (т. е. проследить путь сигнала от мембраны клетки до исследуемого белка и компонентов клетки, на которые этот белок оказывает действие).
Известно довольно много экспериментальных методов детекции фосфорилированных белков. Можно использовать изотопное меченые белков "Р или "Р in vivo (при этом меченый неорганический фосфат добавляют в культуральную среду) или in vitro (добавляя меченный АТР в пробу). Затем белки можно разделить с помощью одномерного или двумерного электрофореза и после авторадиографии с рентг еновской пленкой определить положение в геле меченных изотопом фосфобелков [3]. К недостаткам метода можно отнести: короткий период полураспада изотопа ,:Р, низкую энергию излучения изотопа 33Р, что снижает чувствительность метода детекции, а также необходимость работать с опасными для здоровья исследователя изотопными реактивами. Существуют специфичные красители, позволяющие окрашивать фосфобелки в геле, например, GelCode ® Phosphoprotein Staining Kit (Pierce). Однако этот метод окраски имеет низкую чувствительность и позволяет детектировать только относительно большие количества белков (в зависимости от конкретного белка - 40-160 нг на одну белковую зону в геле). Часто при работе с фосфобелками используют универсальные аффинные реактивы, содержащие ион Fe3r: при очистке и/или концентрировании белков на аффинных колонках (IMAC, аффинная металлохелатная хроматография) [4] и при детекции фосфобелков на дотах и бло-тах (например, с помощью реактива INDIA™ PhosphoProbe-HRP фирмы Pierce, представляющего собой производное пероксидазы хрена с иммобилизованным ионом Fe3t). Во всех этих методах используется способность иона железа Fe3+с высокой аффинностью (Ka > 1013 M"1) [36J взаимодействовать с фосфогруппой. Однако данные реактивы имеют низкую специфичность - они взаимодействуют с любыми фосфосоединениями (фосфобелками. фосфолипидами, нуклеотидами. органофосфатами и т. д.). Кроме того, Fe3+ также связывается с карбоксильными группами, поэтому необходимо перед детекцией фосфобелков на доте или блоте проводить блокирование карбоксигрупп аминокислотных остатков с помощью дополнительной обработки.
При изучении фосфорилирования белков довольно часто проводят ингибиторный анализ in vivo и in vitro, т. е. используют специфичные ингибиторы протеинкиназ и протеинфосфатаз или инги-бируют эти ферменты пептидами-субстратами, конкурирующими с природным субстратом [17]. В результате такого анализа можно определить, какие протеинкиназы и протеинфосфатазы модифицируют исследуемый белок. При этом необходимо тщательно подбирать концентрацию ингибитора, так как его специфичность проявляется только при определенных концентрациях, обычно довольно низких. Для детекции фосфорилированных белков на дотах и блотах можно использовать специфичные антитела к фосфобелкач: 1) антитела, специфичные к остаткам фосфосерина, фосфотреонина и фос-фотирозина. Однако антитела к фосфосерину и фосфотреонину обладают низким сродством к своим эпитопам, что снижает чувствительность детекции; 2) антитела, специфичные к фосфорилированным остаткам в определенном контексте аминокислотной последовательности (т. е. к определенному сайту конкретного белка) [29].
Известно, что фосфорилирование, как и любые другие регуляторные модификации белков, является обратимым процессом. Это необходимо для того, чтобы контролировать длительность передаваемого в клетку и внутри клетки сигнала. Показано, что часто модифицируемый белок, а также действующие на него протеинкиназы и протеинфосфатазы входят в состав единого комплекса [18]. Для определения того, ассоциированы ли модифицирующие ферменты с исследуемым белком-субстратом, можно использовать специфичные антитела к протеинкиназам и пропгеинфосфатазам [3].
В последние годы появились новые методы исследования фосфорилированных белков, позволяющие изучать одновременно не один, а несколько белков, т. е. проводить протеомные исследования. К этим методам относятся: системы исследования белков в суспензии, белковые микрочипы и новые виды масс-спектрометрии. Дополнительным преимуществом новых подходов является то, что они не требуют большого количества исследуемого материала. Системы исследования белков в суспензии (например, Bio-Plex™ Suspension Array System, Bio-Rad) позволяют детектировать в клеточном лизате до 100 различных фосфобелков. Реактив содержит смесь из 100 видов микроскопических сфе-
рических частиц, имеющих различную окраску и конъюгированных со специфичными реагентами к определенным молекулам-мишеням. Например, в состав конъюгатов могут входить флуоресцентно меченые антитела к фосфорилированным сайтам различных белков. При связывании в клеточном лизате молекулы-мишени (фосфобелка) с антителом, конъюгированным со сферической частицей, изменяется флуоресценция метки, присоединенной к антителу. Далее специальная лазерная установка («ридер») распознает в проходящем через нее потоке реакционной суспензии отдельные частицы и, определяя их цвет и уровень флуоресценции, вычисляет содержание в суспензии каждого из исследуемых фосфобелков. Для выявления в клеточном лизате определенного фосфобелка можно также использовать белковые микрочипы. В этом случае антитела к фосфосайтам различных белков «пришиты» к специальной пластине в виде небольших «пятен» (в каждом таком «пятне» содержатся моно-клональные антитела к одному эпитопу). После связывания белка-мишени со специфичными антите-ломи можно проводить детекцию с использованием вторых антител и флуоресцентных красителей. Усовершенствование аппаратуры и методик для масс-спектрометрии привело к разработке новых подходов к изучению фосфорилированных белков, которые позволяют определить в составе белков все фосфорилированные аминокислотные остатки, а также их положение в первичной последовательности белка. Так, широко используется пептидное картирование: после ферментативного расщепления и разделения пептидов-продуктов гидролиза одномерным или (чаше) двумерным электрофорезом, проводится масс-спектрометрический анализ всех фрагментов методом MALDI-TOF (при этом используется лазерная десорбция в матрице (MALDI) и время-пролетный анализатор (TOF)). Сравнение результатов анализа исходного белка и белка после обработки протеинфосфатазой позволяет выявить фосфопептиды. Проведение далее тандемной масс-спектрометрии фосфопептидов позволяет секвени-ровать их и определить, какие аминокислотные остатки и в каких положениях были фосфорилирова-ны в исходном белке [5, 31, 43].
Компьютерное предсказание потенциальных сайтов фосфорилирования белков. Компьютерный анализ потенциальных сайтов фосфорилирования может быть полезен для оценки наиболее вероятных сайтов модификации, которые, по-зидимому, и должны быть в первую очередь изучены экспериментальными методами, например масс-спектрометричес-кими. Кроме того, данные анализа можно использовать для подбора специфичных антител при проведении исследований с помощью белковых микрочипов или систем исследования белков в суспензии (см. ранее). Использование компьютерного анализа особенно актуально, если исследуемый белок имеет сложное строение (содержит много субъединиц), как, например, в случае с РНК-полимеразой III и другими мультисубъединичными белками.
Для поиска потенциальных участков фосфорилирования в первичной последовательности белка можно использовать программы MotifScan из набора программ Scansite 2.0 (Массачусетский технологический институт, http://scansite.mit.edu/motifscan_id.phtml) [34] и NetPhos 2.0 (Технический университет Дании, http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/) [7]. Программа Motif Scan ищет в предложенной аминокислотной последовательности консен-сусные участки фосфорилирования 26 протеинкиназами: тирозинкиназами - АЫ, киназами рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) и фактора роста фибробластов (FGFR), киназой рецептора инсулина, Itk, Lck, киназой рецептора фактора роста тромбоцитов (PDGFR), Src; базофильными Ser/Thr-киназами - Akt, кальмодулин-зависимой киназой 2, Clk2, протеинкиназой А, протеинкиназами Ca/ß/y, С5, Се, Сц, С^; киназами, действующими при повреждении ДНК - ATM, ДНК-зависимой киназой; ацидофильными Ser/Thr-киназа-ми- CKI, СКИ, GSK3; пролин-зависимыми Ser/Thr-киназами - CDC2, CDK5, ERK1, р38 МАР-киназой. Программа оценивает аминокислотную последовательность каждого сайта (по семь остатков с каждой стороны от модифицируемого) в соответствии с предпочтениями определенной протеинкиназы. Далее с использованием базы данных по белкам позвоночных SWISS-PROT вычисляется процент сайтов (Р), которые имеют такую же или лучшую оценку. Авторы выделяют три уровня строгости предсказания потенциальных участков фосфорилирования: высокий - Р не более 0,2%, средний - Р < 1% и низкий - Р < 5%. Также каждый остаток оценивается по его доступности растворителю (показатель SA): если SA > 1, то остаток экспонирован на поверхности белка и доступен для фосфорилирования [34].
В программе NetPhos 2.0 применен метод «искусственной нейронной сети» [7], который позволил «обучать» программу на основе известных данных для большого количества экспериментально определенных участков фосфорилирования белков (210 сайтов по Тут, 584 - Ser и 108 - Thr) и сайтов, фосфорилирование которых не показано (240 сайтов по Туг, 3266 - Ser и 1283 - Thr). В результате такого обучения программой выработаны нелинейные алгоритмы поиска участков фосфорилирования по Ser, Thr и Туг, учитывающие не только частоту встречаемости определенных аминокислотных остатков в определенных позициях последовательности вокруг модифицируемого остатка (по четыре остатка с каждой стороны от участка модификации по Туг и Thr и по пять - для Ser), но и частоту встречаемости данного остатка в окружении других остатков. Оценка каждого участка отражает вероятность того, что этот участок может модифицироваться протеинкиназами; согласно [7] положительной считается оценка >0,9, а чувствительность метода составляет 69-96%.
Еще одна программа, YinOYang 1.2 (Технический университет Дании, http://www.cbs. dtu.dk/services/YinOYang/), позволяет проводить поиск потенциальных участков, которые могут подвергаться как фосфорилированию, так и гликозилированию (сайты «инь-янь»). На первом этапе программа, так же как и NetPhos 2.0, использует метод «искусственных нейронных сетей» для поиска возможных участков гликозилирования в предложенной аминокислотной последовательности полипептида. Программа «обучена» с использованием данных по 40 участкам гликозилирования, экспериментально выявленным во внутриклеточных белках. На втором этапе программа YinOYang 1.2, работая параллельно с программой NetPhos 2.0, выделяет те из сайтов гликозилирования, которые могут подвергаться и реципрок-ному фосфорилированию, т. е. сайты «инь-янь».
Так как многие сигнальные пути и белки, участвующие в них, достаточно консервативны для низших и высших эукариот, то важную информацию о фосфорилировании исследуемого белка могут дать исследования эволюционной консервативности потенциачьных сайтов модификации-, чем консервативнее сайт, тем выше вероятность того, что он подвергается регу-ляторному фосфорилированию. Для определения эволюционной консервативности сайтов необходимо провести множественное выравнивание аминокислотных последовательностей исследуемого белка и его гомологов у нескольких видов, например, у Homo sapiens, Saccharomy-ces cerevisiae и Schizosaccharomyces pombe, а затем оценить, какие из сайтов оставались консервативными у разных видов. Для множественного выравнивания аминокислотных последовательностей можно использовать программу T-Coffee (http://services. bioasp.rd/blast/cgi-biri't-coffcc.cgi) [33], а степень гомологии аминокислотных последовательностей определять с помощью программы LALIGN (http://www.ch.embnet.org/software/ LALIGN_form.html) [25].
Компьютерные программы позволяют предсказывать потенциальные ферментативные свойства белка. Так, с помощью программы PREDIKJN (http://www.biosci.uq.edu.au/ kinsub/home.htm) можно выявить в составе исследуемого белка потенциальные протеинки-назные каталитические домены. Если такой каталитический домен в белке присутствует, программа позволяет также определить возможные субстраты данной протеинкиназы [9]. PREDIKIN ищет в первичной последовательности белка сайты, похожие на сайты каталитических доменов известных протеинкиназ. При создании этой программы использовались данные о доменах 390 ферментов, поделенных на семейства в соответствии со схожими структурными и функциональными свойствами, прежде всего - в соответствии со сходством аминокислотных последовательностей их каталитических доменов.
С помощью компьютерных программ можно также предсказывать, в какие сигнальные пути вовлечены те или иные фосфобелки. Так, программа ScanSite (Массачусетский технологический институт, http://scansite.mit.edu) [34], составной частью которой является программа MotifScan, идентифицирует короткие мотивы аминокислотных последовательностей, которые 1) связываются с определенными доменами белков, участвующих в пере-
даче сигналов в клетке (домены SH2, SH3, PDZ, 14-3-3 и РТВ); 2) фосфорилируются определенными протеинкиназами (сайты, которые ищет программа MotifScan); 3) специфично взаимодействуют с фосфолипидными лигандами (фосфатидилинозитол-3,4,5-трифосфат-специфичные PH-домены). Всего программа способна узнавать 62 аминокислотных мотива. Предсказанные с помощью программы взаимодействия между различными сигнальными белками позволяют, при их комбинировании, конструировать in silico фрагменты сигнальных путей, участником которых является исследуемый белок [34].
Компьютерный анализ потенциальных сайтов фосфорилирования РНК-поли-меразы III человека. Изучение механизмов, лежащих в основе регуляции активности ДНК-зависимой РНК-полимеразы III, транскрибирующей гены большинства малых стабильных нетранслируемых РНК (гены класса III), является актуальной проблемой, так как в последние годы появляется все больше данных, свидетельствующих о значительной роли подобных РНК в таких важных процессах в клетке, как рост, пролиферация и дифференци-ровка. Имеющиеся в литературе данные позволяют предположить, что в регуляции активности этой полимеразы могут участвовать протеинкиназы и протеинфосфатазы [2]. В то же время, механизм действия этих ферментов на транскрипционную машину РНК-полнмера-зы III в большинстве случаев остается невыясненным. Неизвестны также и сайты в составе субъединиц полимеразы, которые подвергаются регуляторной модификации фосфорилиро-ванием. Экспериментальное исследование фосфорилирования РНК-полимеразы III затруднено из-за сложного строения фермента: в его состав входят 17 субъединиц. Поэтому мы провели компьютерный поиск потенциальных сайтов фосфорилирования и сайтов «инь-янь» в составе субъединиц РНК-полимеразы III человека с использованием описанных в статье программ, а также определили эволюционную консервативность идентифицированных сайтов у Н. sapiens, S. cerevisiae и S. pombe [1].
На первом этапе исследования мы проверили, присутствуют ли в составе субъединип РНК-полимеразы III человека сайты, по которым возможно фосфорилирование. С помощью компьютерных программ MotifScan [34] и NetPhos2.0 [7] был проведен поиск для всех 17 субъединиц РНК-полимеразы III человека. В результате нами были выявлены возможные сайты фосфорилирования 16 из 26 изученных протеинкиназ в составе семи субъединиц РНК-полимеразы III человека: RPC1, RPC3, RPC4. RPC5, RPC7, RPC9 и RPABC1. Далее с помощью программы YinOYang 1.2 в составе двух субъединиц РНК-полимеразы III человека были идентифицированы потенциальные сайты, которые могут подвергаться реципрок-ной регуляторной модификации как фосфорилированием, так и гликозилированием (сайты «инь-янь»). Таким образом, в составе семи субъединиц РНК-полимеразы III человека присутствуют сайты, которые, согласно данному исследованию, могут быть мишенью протеинкиназ и/или гликозилтрансфераз. Эти данные служат подтверждением нашего предположения о регуляторной роли посттрансляционных модификаций этой полимеразы [1]. В настоящее время экспериментально выявлена модификация лишь одного сайта в составе общей для всех эукариотических РНК-полимераз субъединицы RPABC2. Так, с помощью ме-чения 32Р рекомбинантной RPABC2 дикого типа и RPABC2 с заменами потенциальных сайтов фосфорилирования показано, что в ее составе потеинкиназа СКИ фосфорилирует in vitro остаток Ser2 [28]. Необходимо отметить, что обе использованные программы - MotifScan и NetPhos 2.0 - не идентифицировали этот сайт как потенциальную мишень для фосфорилирования. Это, по-видимому, объясняется тем, что данные программы ищут сайты модификации в контексте нескольких аминокислотных остатков (семи или пяти соответственно) по обе стороны от модифицируемого остатка, и находящиеся близко к концам полипептида остатки, как, например, рассматриваемый Ser2 в составе субъединицы RPABC2. заведомо игнорируются.
В то же время необходимо отметить, что профамма MotifScan идентифицировала
потенциальные сайты фосфорилирования для четырех из шести протеинкиназ, которые, как было показано ранее, влияют на уровень транскрипции генов класса III: CDC2, CKII, ERKI и протеинкиназы С [2]. Для протеинкиназы ERK2 сайты фосфорилирования не были выявлены, хотя она и входит в список киназ, для которых программа MotifScan может находить сайты модификации. Для шестой же протеинкиназы - TOR-киназы - программа MotifScan не способна находить сайты узнавания. Это объясняется тем, что до сих пор не определен консенсусный мотив, в составе которого происходит фосфорилирование субстратов этой протеинкиназой. Известно, что киназный домен mTOR-киназы имеет высокую гомологию с киназными доменами протеинкиназ ATM, ATR и АТХ. Можно ожидать, что и сайты, модифицируемые этими киназами, схожи. В связи с этим интересно отметить, что потенциальные сайты фосфорилирования киназой ATM были найдены программой MotifScan в составе субъединиц RPC1 и RPC6 РНК-полимеразы III человека. С другой стороны, показано, что в составе двух наиболее изученных субстратов mTOR-киназы -- PHAS-I и S6K1 - фос-форилируются остатки Ser и Thr в последовательности Ser/Thr-Pro [11]. Такие дипептидные последовательности присутствуют в 12 из 17 субъединиц РНК-полимеразы III. При этом 5 сайтов в составе четырех субъединиц являются консервативными у Н. sapiens, S. cerevisiae и S. pombe и имеют оценку NetPhos 2.0 более 0.9. Дипептиды Ser/Thr-Pro содержат все шесть субъединиц, которые, как было показано нами ранее, фосфорилируются протеинкиназой, ассоциированной с РНК-полимеразой III плаценты человека [3]. Но только в составе субъединицы RRC1 сайты, включающие этот дипептид, являются консервативными и высоко оценены программой NetPhos 2.0. Однако следует учитывать, что в составе РНК-полимера-зы III человека mTOR-киназа потенциально может фосфорилировагь сайты, которые отсутствуют у дрожжей, но могут играть важную регуляторную роль в клетках млекопитающих. Так, было показано, что у многоклеточных организмов TOR-киназный сигнальный путь приобрел новые функции (по сравнению с дрожжами) в связи с возникновением межклеточных коммуникаций [12].
Интересно, что два потенциальных сайта фосфорилирования - S466 в составе субъединицы RPC2 и S226 в составе RPAC1 - являются сайтами «инь-янь». По современным представлениям, в клетке важное регуляторное значение имеет не просто фосфорилирование или гликозилирование белков соответствующими ферментами, а конкуренция протеинкиназ и гликозилтрансфераз за одни и те же сайты модификации в составе субстратов. Это позволяет более тонко регулировать процессы, происходящие в клетке с участием модифицируемых белков. Так, полагают, что гликозилирование цитоплазматических и ядерных белков используется для передачи сигнала о содержании питательных веществ в клетке, в то время как фосфорилирование - для передачи экстраклеточных сигналов. Сочетание этих двух механизмов позволяет клетке отвечать на внеклеточные сигналы, учитывая ее собственное энергетическое состояние [41]. Показано, что конкуренция фосфорилирования и гликози-лирования С-терминального домена самой крупной субъединицы РНК-полимеразы II играет важную роль в регуляции работы этого фермента [41]. Мы полагаем, что и РНК-полимера-за III также может подвергаться такой регуляции, так как известно, что ее активность строго соответствует физиологическому состоянию клетки [11, 20, 32, 39].
В последние годы получено довольно много данных, связанных с регуляцией транскрипции генов класса III. Однако практически все исследователи рассматривают в качестве мишеней для регуляторного воздействия базальные транскрипционные факторы РНК-полимеразы III - TFIIIA, TFIIIB и TFIIIC [11]. Традиционно мало внимания уделяется регуляции активности самой РНК-полимеразы III, в частности, посттрансляционным модификациям фермента. Результаты этого исследования и полученные ранее данные [3, 6J показывают, что РНК-полимераза III может подвергаться регуляторным модификациям - фосфо-рилированию и гликозилированию.
Очевидно, для того чтобы получить полное представление о механизмах, лежащих в основе контроля транскрипции генов класса III в клетке, в дальнейшем необходимо исследовать модификации не только базальных факторов, но и самой полимеразы. Этому исследованию должны способствовать имеющиеся данные о субъединичном составе РНК-поли-меразы III из различных источников, в том числе из клеток человека [24], и развитие проте-омных технологий - это появление новых масс-спектрометрических методов, позволяющих идентифицировать посттрансляционные модификации белков. Однако из-за сложного строения фермента масс-спектрометрическое исследование всех 17 субъединиц РНК-полимера-зы 111 выполнить в настоящее время практически невозможно. Поэтому представляется целесообразным использовать приведенные в данном исследовании результаты оценки наиболее вероятных сайтов модификации. Эти сайты, по-видимому, и должны быть в первую очередь исследованы масс-спектрометрическими методами.
Статья рекомендована проф. В. Н. Кокряковы.м. Summary
Nikitina Т. К. Tishchenko L. I. Computer analysis of potential protein phosphorylation sites and some experimental methods for their investigation.
The computer programs for in silico protein phosphorylation investigation and basic experimental methods for phosphoprotein purification and detection are investigated. The application of the programs described is demonstrated by the example of computer search for human RNA polymerase III potential sites of phosphorylation and «Yin-Yang» sites, and detennination of evolution conservatism of these sites in H. sapiens. S. cerevisiae and S. pombe.
Литература
1. Никитина Т. В., Тищенко Л. И. Компьютерный поиск потенциальных участков посттрансля-ционных модификаций субъединиц РНК-полимеразы III человека // Молекулярная биология. 2005. Т. 39, № 3. С. 437^444. 2. Никитина Т. В., Тищенко Л. И. Транскрипционная машина РНК-полимера-зы 111: строение и регуляция транскрипции (обзор) // Молекулярная биология. 2005. Т. 39, №2. С. 179-192. 3 .Никитина Т. В.. Тищенко Л. И., Седова В. М. Фосфорилирование-дефосфорилирование холоэнзима РНК-полимеразы III - модификации, регулирующие уровень транскрипции in vitro // Цитология. 2002. Т. 44. № 3. С. 277-284. 4. Andersson L.. Porath J. Isolation of phosphoproteins by immobilized metal (Fe3+) affinity chromatography // Anal. Biochem. 1986. Vol.154. P. 250-254. 5. Beau-soleil S. A.. Jedrychowski M, Schwartz D.. EliasJ.E.. VillenJ.. Li J., CohnM.A., Cantley L. C., Gygi S. P. Large-scale characterization of HeLa cell nuclear phosphoproteins // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. Vol. 101. P. 12131-12135. 6. Bell G.I.. Valenznela P., RutterW.J. Phosphorylation of yeast DNA-depen-dent RNA polymerases in vivo and in vitro /7 J. Biol. Chem. 1977. Vol. 252. P. 3082-3091. 7. Blom N.. Gam-meltofl S.. Brunak S. Sequence and structure-based prediction of eukaryotic protein phosphorylation sites 11 J. Mol. Biol. 1999. Vol. 294. P. 1351 1362. 8. Bollen M., Beullens M. Signaling by protein phosphatases in the nucleus // Trends Cell Biol. 2002. Vol. 12. P. 138-145. 9. Brinkworth R. /.. Breinl R. A., Kobe B. Structural basis and prediction of substrate specificity in protein serine/threonine kinases // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. Vol. 100. P. 74-79. 10. Brooks C. L„ Gu W. Ubiquitination, phosphorylation and acetylation: the molecular basis for p53 regulation // Curr. Opin. Cell Biol. 2003. Vol.15. P. 164-171. 11. Brown T. R.. Scott P. H.. Stein Т.. Winter.4. G., White R. J. RNA polymerase III transcription: its control by tumor suppressors and its deregulation by transforming agents // Gene Expr. 2000. Vol. 9. P. 15-28. 12. Brunn G. J.. Fadden P., Haystead T. A., Lawrence J. C. The mammalian target of rapamycin phosphorylates sites having a (Ser/Thr)-Pro motif and is activated by antibodies to a region near its COOH terminus /7 J. Biol. Chem. 1997. Vol. 272. P. 32547-32550. 13. Cans C., Mangano R.. Barila D„ Neubauer G.. Superti-Furga G. Nuclear tyrosine phsphorylation: the beginning of the map // Biochem. Pharmac. 2000. Vol.60. P. 1203-1215. 14. Carpenter G. Nuclear localization and possible function of receptor tyrosine kinases // Curr. Opin. Cell Biol. 2003. Vol. 15. P. 143-148. 15. Comer F. I.. Hart G. W. O-glycosylation of nuclear and cytosolic proteins // J. Biol. Chem. 2000. Vol.275. P. 29179-29182. 16. Dahmus M. E. Phosphorylation of eukaryotic
DNA-dependent RNA polymerase // J. Biol. Chem. 1981. Vol.256. P. 3332-3339. 17. DaviesS. P., Red-dy N.. Caivano M., Cohen P. Specificity and mechanism of action of some commonly used protein kinase inhibitors // Biochem. J. 2000. Vol. 351. P. 95-105. 18. Dombradi V., Kreiglstein J., Klumpp S. Regulating the regulators // EMBO reports. 2002. Vol.3. P. 120-124. 19. Fath S„ Milkereit P., PeyrocheG.. Riva M„ Carles C., Tschochner H. Differential roles of phosphorylation in the formation of ranscriptional active RNA polymerase!. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. Vol.98. P. 14334-14339. 20. Felton-Edkins Z. A., Kenneth N. S., Brown T. R.. Daly N. L., Gomez-Roman N.. Crandori C.. Eisenman R. N.. White R. J. Direct regulation of RNA polymerase III transcription by RB, p53 and c-Myc // Cell Cycle. 2003. Vol. 2. P. 181-184. 21. Grummt I. Regulation of mammalian ribosomal gene transcription by RNA polymerase I // Prog. Nucleic Acids. Res. Mol. Biol. 1999. Vol. 62. P. 109-154. 22. Hannan R. D„ Hempel W. M„ Cavanaygh A.. Arino Т.. Dimitrov S. /., Moss Т., Rothblum L Affinity purification of mammalian RNA polymerase I. Identification of an associated kinase A J. Biol. Chem. 1998. Vol. 273. P. 1257-1267. 23. Holmberg C. /., Tran S. E. F„ Eriksson J. E.. Sistonen L. Multisite phosphorylation provides sophisticated regulation of transcription factors //' Trends Biol. Sci. 2002. Vol. 27. P. 619-627. 24. Ни P.. Wu S.. Sun Y.. Yuan C.C.. Kobayashi R„ Myers M.P., Hernandez N. Characterization of human RNA polymerase III identifies orthologues for Saccharomyces cerevisiae RNA polymerase III subunits // Mol. Cell. Biol. 2002. Vol.22. P. 8044-8055. 25. Huang X.. Miller W. A time-efficient, linear-space local similarity algorithm // Adv. in Appl. Math. 1991. Vol. 12. P. 337-357. 26. Hunter T. Signaling - 2000 and beyond // Cell. 2000. Vol. 100. P. 113-127. 27. Johnson L. N.. O'Reilly M. Control by phosphorylation // Curr. Opin. Struct. Biol. 1996. Vol.6. P. 762-769. 28. Kayukawa K., Makino Y., Yogosawa S., Tamura T. A serine residue in the N-terminal acidic region of rat RPB6, one of the common subunits of RNA polymerases, is exclusively phosphorylated by casein kinase II in vitro // Gene. 1999. Vol. 234. P. 139-147. 29. Lim Y.-P.. DiongE-S., Qi R.. DrukerB. J., Epstein R. J. Phos-phoproteomic fingerprinting of epidermal growth factor signalling and anticancer drug action in human tumor cells// Mol. Cancer Ther. 2003. Vol. 2. P. 1369-1377. 30. Manning G„ Whyte D. В.. Martinez R„ Hunter Т., Sudarsanam S. The protein kinase complement of the human genome // Science. 2002. Vol. 298. P. 1912-1918. 31. McLachlin D. Т.. Chait В. T. Analysis of phosphorylated proteins and peptides by mass spectrometry // Curr. Opin. Chem. Biol. 2001. Vol. 5. P. 591-602. 32. Nikitina Т. V., Nazarova N. Y„ AksenovN. D, Tishchenko E /., Tuohimaa P.. Sedova V. M. Small stable RNA level depends on the physiological state of the cell // Цитология. 2004. 'Г. 46. С. 437-441. 33. Notredame С., Higgins D. G„ HeringaJ. T-Coffee: a novel method for fast and accurate multiple sequence alignment // J. Mol. Biol. 2000. Vol. 302. P. 205-217. 34. Obernauer J. С.. Cantley E C.. Yaffe M. B. Scansite 2.0: proteome-wide prediction of cell signaling interactions using short sequence motifs // Nucleic Acids Res. 2003. Vol. 31. P. 3635-3641. 35. Oelgeschlager T. Regulation of RNA polymerase II activity by CTD phosphorylation and cell cycle control // J. Cell. Physiol. 2002. Vol. 190. P. 160-169. 36. Osterberg R. Metal and hydrogen-ion binding properties of O-phosphoserine // Nature (London). 1957. Vol.179. P. 476-477. 37. Ramanathan Y„ Rajpara S. M„ RezaS.M., Lees E„ Shuman S., Mathews M. В.. Pe'ery Т. Three RNA polymerase II carboxyl-terminal domain kinases display distinct substrate preferences // J. Biol. Chem. 2001. Vol.276. P. 10913-10920. 38. Riedl Т., EglyJ.M. Phosphorylation in transcription: the CTD and more // Gene Expr. 2000. Vol. 9. P. 3-13. 39. Schultz M. C. Target of rapamycin (TOR) signaling coordinates tRNA and 5S rRNA gene transcription with growth rate in yeast // Gene Ther. Mol. Biol. 1999. Vol. 4. P. 339-348. 40. Vosseller K„ Wells E. Hart G. W. Nucleoplasms O-glycosylation: O-GlcNAc and functional proteomics // Biochimie. 2001. Vol.83. P. 575-581. 41. Wells L, Whelan S. A.. Hart G. W. O-GlcNAc: a regulatory post-translational modification I! Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003. Vol.302. P. 435-441. 42. Whitmarsh A. J., Davis R.J. Regulation of transcription factor function by phosphorylation // Cell. Mol. Life Sci. 2000. Vol.57. P. 1172-1183. 43. Yates J. R. Mass spectral analysis in proteomics // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 2004. Vol. 33. P. 297-316. 44. Yeo M, Lin P. S„ Dahmus M. £.. Gill G. N. A novel RNA polymerase II C-terminal domain phosphatase that preferentially dephosphorylates serine 5 // J. Biol. Chem. 2003. Vol. 278. P. 26078-26085.
Статья поступила в редакцию 1 декабря 2005 г.
