CC BY
141
УДК 57.087.31/.37
компьютерная технология оценки СЕМЕНИ животных
Б.С. ИОЛЧИЕВ, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник
В.А. БАГИРОВ, член-корреспондент РАСХН, зав. лабораторией
П.М. КЛЕНОВИЦКИЙ, доктор биологических наук, главный научный сотрудник В.П. КОНОНОВ
Ш.Н.НАСИБОВ, кандидат биологических наук, докторант
В.А. ВОЕВОДИН, аспирант
ВНИИ животноводства Россельхозакадемии
E-mail: baylar1@yandex.ru
Резюме. Для оценки качественных и количественных показателей семени разных видов животных использован компьютерный анализ семени - Computer-assisted sperm analysis (CASA). Разработан протокол для оценки количественных и качественных показателей семени быков, баранов, козлов и других сельскохозяйственных и диких видов животных с использованием компьютерной технологии.
Ключевые слова: оценка сперматозоидов, компьютерный анализ спермы, морфология сперматозоидов, концентрация сперматозоидов, подвижность сперматозоидов.
Один из важнейших факторов эффективного ведения животноводства - воспроизводство, которое тесно связано с репродуктивными качествами животных. Сегодня регуляция функций репродукции в отрасли, особенно в молочном скотоводстве в России - один из важнейших и сложнейших вопросов [5].
Искусственное осеменение относится к числу наиболее эффективных методов репродуктивной технологии, позволяющих ускорить селекционный процесс и максимально использовать высокоценных производителей в создании новых селекционных форм [1].
В некоторых случаях, например, при отдаленной гибридизации, искусственное осеменение - единственный метод получения потомства, поскольку он снимает барьеры, препятствующие естественному спариванию [2].
Успех осеменения зависит от многих факторов. Как при естественном спаривании, так и при искусственном осеменении, один из главных факторов - качество семени [3, 6].
Комплексная оценка семени включает множество качественных и количественных показателей, на точность определения которых влияет ряд объективных и субъективных причин. В сфере животноводства России оценку семени в основном проводят традиционными методами. Они отличаются очень низкой производительностью и не позволяют избежать субъективизма, так как связаны с ограниченными возможностями человеческого восприятия (особенно при высокой концентрации) и различиями в используемом лабораторном оборудовании (микроскоп, подогреваемый столик, вид счетной камеры и др.) [7, 9].
Еще одна нерешенная проблема при оценке семени в животноводстве - отсутствие четких критериев в протоколах. Кроме того, следует отметить, что не существует ни одного теста, который со стопроцентной точностью определял оплодотворяющий потенциал эякулята, так как сперматозоид - это сложный биологический объект, и оплодотворение зависит не только от тех показателей, по которым проводится оценка
семени, но и от множества других факторов. Тем не менее оценка семени позволяет выявлять эякуляты, явно непригодные для использования, обнаруживать отклонения в качестве семени, определять самцов с низкой фертильностью.
Избежать субъективизма можно при использовании компьютерных технологий. В этом случае не только значительно повышается точность оценки, но и сокращаются затраты времени и труда. Кроме того, применение таких технологий позволяет накапливать и сопоставлять информацию без ограничения.
Учитывая масштабы искусственного осеменения в животноводстве, комплексная оценка качества сперматозоидов приобретает все большее значение. Сегодня для ее проведения разработано несколько методов инструментального анализа. Наиболее распространенные из них - использование капиллярных фотометров и видеомикроскопических анализаторов. Они позволяют учитывать множество показателей, в том числе такие наиболее значимые, как подвижность и морфология сперматозоидов. Однако даже при использовании компьютерных технологий возможны проблемы, связанные, например, с видовыми особенностями, которые обусловливают количественные и качественные показатели семени.
Для оценки биологической полноценности семени только количественных показателей недостаточно, поэтому одновременно определяют биохимические, физиологические и морфометрические параметры. Для определения морфометрических параметров сперматозоидов также можно использовать компьютерный анализ, что повышает точность и объективность оценки.
Цель наших исследований - разработка элементов методики оценки биологической полноценности сперматозоидов различных видов сельскохозяйственных животных с использованием компьютерных технологий.
Условия, материалы и методы. Работа выполнена в лаборатории репродуктивной криобиологии животных ВНИИ животноводства. Оборудование для проведения анализа: компьютер, микроскоп с системой ввода изображений в компьютер и термостоликом, камера Маклера. Для анализа использовали пакет программы «Зоосперм 1.0» [4]. Принцип его действия основан на обработке видеоизображений. В ходе анализа каждый сперматозоид распознается по заданным параметрам и проводится оценка семени. Для дифференцированной окраски использовали набор Дифф-Квик.
Оценку семени быков, баранов, хряков и козлов-производителей проводили по качественным и количественным показателям.
Распределение по подвижности осуществляли в соответствии со следующими классами:
А - сперматозоиды с быстрым прямолинейно-поступательным движением со скоростью не менее 25 мкм/сек. Сперматозоиды этого класса в течение двух секунд преодолевают расстояние равное своей длине;
В - с медленным прямолинейным движением со скоростью менее 25 мкм/сек;
С - с манежным или колебательным движением;
D - неподвижные [8].
Результаты и обсуждение. Концентрация сперматозоидов в 1 мл зависит от вида животного, высокой величиной этого показателя характеризуются бараны и козлы, средней - быки, низкой - жеребцы и хряки. Семя видов с невысокой концентрацией сперматозоидов (хряков, жеребцов) можно изучать в неразбавленных образцах, в остальных случаях его необходимо разбавлять. Образцы должны быть свежими и без посторонних примесей. Значительное влияние на достоверность полученных результатов при компьютерном анализе имеет настройка оборудования. Точность можно проверить путем повторных анализов одних тех же образцов. Ошибка полученных результатов не должна превышать 5 %.
Используемая нами программа создает калибровочный файл, в который записываются все параметры. Возможно формирование нескольких калибровок, но все измерения проводятся в соответствии с параметрами активного файла. В начале работы задаются условия классификации сперматозоидов по таким параметрам, как площадь, фактор формы круга, округлость, скорость прямолинейного движения головки и др., а также заполняются необходимые поля бланка карточки результатов анализа (рис.1).
Рис.1. Бланк карточки результатов анализа.
Все оборудование нужно готовить для анализа заранее, так как для настройки и перехода к необходимому режиму требуется время, а сперматозоиды очень чувствительны к температурным условиям.
Используемые камеры должны быть чистыми и свободны от пыли. Если на поверхности содержатся частицы размером более 10 микрон, это может отрицательно сказаться на результатах. При оценке сперматозоидов по подвижности необходимо соблюдение определенного температурного режима, который создается с помощью нагревательного стола. Камеру нужно заранее ставить на несколько минут на нагревательный столик, чтобы на ее стекле установилась необходимая температура, а затем наносить образец.
Мы в своих исследованиях использовали камеру Маклера, которая состоит из 2-х частей и позволяет наблюдать образец в одной фокальной плоскости. Верхняя ее часть выполняет роль покровного стекла и имеет в центре сетку с ячейкой 1 мм2, поделенной на 100 квадратов площадью 0,1 *0,1 мм. Высота камеры в 10 микрон обеспечивает оптимальные условия для свободного движения сперматозоидов. Не наблюдается размытость изображения.
Используемый пакет программ позволяет определить концентрацию и подвижность сперматозоидов в одном образце. Так как учитывается каждый объект, находящийся в поле зрения и соответствующий заданным критериям, то зная площадь поля зрения микроскопа можно рассчитать объем образца и концентрацию сперматозоидов в 1 мл.
Свежеполученное семя баранов и козлов разводят в 50, а быков в 20 раз. Для оценки концентрации
с неподвижными сперматозоидами используют 3 %-ный раствор хлорида натрия или хлорида калия. Под влиянием гипертонического раствора сперматозоиды через 2...3 минуты становятся неподвижными. Перед анализом семя тщательно перемешивают, стараясь избегать образования пузырьков. С помощью стержня или пипетки небольшую каплю образца наносят в центр нижнего диска камеры Маклера. Покровное стекло камеры устанавливают так, чтобы появились радужные разводы. Правильное его расположение гарантирует равномерное распределение капли. Состояние нанесенного образца можно наблюдать на экране монитора. Съемка проводится после того, как остановится текучесть жидкости, для этого требуется примерно 2...3 минуты. Количество сперматозоидов в десяти квадратиках, после корректировки с учетом степени разведения показывает число сперматозоидов в миллионах в 1 мл.
Для оценки подвижности (или подвижности и концентрации одновременно) сперму необходимо разводить 2,9 %-ным раствором цитрата натрия с температурой 38.40 °С. Ее осторожно перемешивают, а затем пипеткой наносят небольшую каплю образца в центр нижнего диска камеры Маклера, подогретой на термостолике. Через 2.3 минуты после установки покровного стекла проводится запись видеоролика (файл в формате .avi) движения сперматозоидов длительностью 1 сек.
Для достоверной оценки необходимо записывать несколько полей.
Следующий этап обработки - распознание сперматозоидов и сопоставление их с параметрами калибровки и условиями классификации.
Программа определяет следующие параметры каждого сперматозоида:
VAP - средняя скорость движения головки по усредненной траектории, мкм/сек;
VSL - скорость прямолинейного движения головки, мкм/сек (средняя скорость движения головки сперматозоида вдоль прямого отрезка между начальной и конечной точкой траектории);
VCL - средняя скорость движения сперматозоидов по реальной траектории, мкм /сек;
ALH - среднее отклонение головки, мкм (амплитуда латерального смещения головки сперматозоида от траектории движения);
BCF - частота колебательных усредненной движений, Г ц (частота пересечений). Средняя частота пересечения криволинейной траекторией движения сперматозоида его усредненной траектории за единицу времени;
STR - степень прямолинейности направленного
Рис. 2. Распознание сперматозоидов и обработка результатов.
движения сперматозоидов, % (прямолинейность средней траектории движения). Рассчитывается по формуле VSL / VAP х 100.
LIN - степень волнистости треков, % (величина колебания истинной траектории движения по отношению к средней траектории). Рассчитывается по формуле VSL / VCL х 100.
Результаты измерения параметров каждого объекта, наблюдавшегося в видеоролике, заносятся в таблицу. При активизации строки в таблице соответствующий объект выделяется на изображении и, наоборот (рис.2).
После обработки видеороликов автоматически заполняются остальные поля карточки бланка результатов и формируется бланк для печати.
Для оценки морфометрических показателей сперматозоидов мазок должен быть приготовлен не позднее 30 минут после взятия. В зависимости от цели исследования используют различные методы. Наиболее эффективно дифференцированное окрашивание, когда разные участки сперматозоида окрашиваются в разные цвета с различной интенсивностью. Для выполнения этой операции выпускают разные коммерческие наборы. Мы в своих исследованиях использовали отечественный набор Дифф-Квик с некоторыми модификациями протокола окрашивания (рис. 3).
Исследования морфологии проводятся под микроскопом при увеличении 400...1000х. Для полно-
Литература.
1. Багиров В. Генетические ресурсы животноводства. //Животноводство России. - 2008. - №2.- С. 10-12.
2. Багиров В.А., Эрнст Л.К., Насибов Ш.Н., Кленовицкий П.М., Иолчиев B.C., Зиновьева Н.А. Сохранение биоразнообразия животного мира и использование отдаленной гибридизации в животноводстве //Достижения науки и техники АПК. - 2009. - № 7. - С. 54-56.
3. Багиров В.А., Эрнст Л.К., Кленовицкий П.М., Зиновьева Н.А. Сохранение генетических ресурсов редких, исчезающих и уникальных видов животных// Цитология. - 2004. - Т. 46. - № 9. - С. 767.
4. Видеотест-сперм 2.1. - Санкт-Петербург. - 2004. - 17 с.
5. Кононов В.П., Черных В.Я. Биотехника репродукции в молочном скотоводстве. // Москва, 2009. - 365 с.
6. Методы получения и криоконсервации семени для сохранения генетических ресурсов животных/Ш.Н.Насибов, В.А. Воеводин, В.А. Багиров, Б.С.Иолчиев, П.М.Кленовицкий, Ф.С. Амиршоев, С.А. Лесин//Вестник Казанского ГАУ. - 2010. - Т.18. - № 4. - С. 139-141
7. Martinez C., Mar C., Azcarate M., Pascual P., Aritzeta J.M., and Lopez-Urrutia A.(2000) Sperm motility index: a quick screening parameter from SQA-IIB to rule out oligospermia and asthenozoospermia in male fertility study. Hum. Reprod., 15, 1727-1733.
8. WHO laboratory manual for examination of human semen and sperm-cervical mucus interaction / пер. с англ. РА. Нерсеяна под научн. ред. рус. перевода Л.Ф. Курило. — 4-е издание. — М., Изд-во «МедПресс». -2001. - 144 с.
9. Yeung C.H., Cooper T.G. and Nieschlag E. (1997) A technique for standardization and quality control of subjective sperm motility assessments in semen analysis. Fertil. Steril., 67,1156-1158.
computer technology for animal semen evaluation
B.S. lolchiev, V.A. Bagirov, P.M. Klenovitskij, V.P. Kononov, Sh.N. Nasibov, V.A. Voevodin
Summary: To assess the quality and quantity indicators of sperm of animal of different species the computer analysis of sperm -Computerassisted sperm analysis (CASA) - was used. It was developed a protocol for assessing the quantity and quality indicators of sperm of bulls, rams, he-goats, and other agricultural and wild species of animals, using computer technology.
Key words: Sperm evaluation, computer analysis of sperm, morphology of spermatozoa, spermatozoa concentration, sperm mobility.
*
/■
Рис. 3. Сперматозоиды, окрашенные с использованием набора Диф-Квик.
ценной оценки число сперматозоидов должно быть не менее 200. С использованием компьютерной технологии можно определить длину, ширину, полную площадь, коэффициент эллиптичности (отношение ширины к длине), среднюю яркость и долю площади акросомы.
Результаты исследования показывают, что использование компьютерной техники и специальных прикладных программ снижает затраты времени на оценку семени в несколько десятков раз. Одновременно увеличивается точность оценки.
УДК 636.22/28.034
оценка и рациональное использование ГЕНОФОНДА костромской ПОРОДЫ СКОТА
А.В. БАРАНОВ, доктор биологических наук, директор Костромской НИИСХ Россельхозакадемии Б.В. ШАЛУГИН, кандидат сельскохозяйственных наук, профессор
Костромская ГСХА E-mail: knicx@kosnet.ru
Резюме. В работе приведены данные, характеризующие генофонд костромской породы скота. Подробно проанализированы показатели молочной продуктивности коров племенных хозяйств; особенности состава молока и его сыропригод-ность; продолжительность продуктивного использования;
устойчивость к заболеваниям; генетический потенциал молочной продуктивности быков-производителей. Анализ генофонда показал, что рациональное его использование позволит совершенствовать быстрыми темпами не только костромскую, но и другие бурые породы РФ.
Ключевые слова: генофонд, оценка, молочная продуктивность.
Согласно плану породного районирования в Костромской области разводят 3 породы крупного рогатого скота молочного и молочно-мясного направления продуктивности - это черно-пестрая, ярославская и костромская.
