CC BY
135
4. Методические рекомендации по реализации кластерной политики в субъектах Российской Федерации / утв. Минэкономразвития РФ от 26.12.2008 г. № 20615-ак/д 19. - Доступ из справ.-правовой системы «Консультант Плюс».
5. Загора И.П., Поклонова Е.В. Региональный кластер: теория формирования и мониторинг состояния. -Красноярск: Изд-во СФУ, 2012. - 190 с.
6. Красноярский край вошел в десятку самых инновационных регионов России. - 11Р1_: http://www.newslab.ru/news/408465.
7. Отчет об итогах социально-экономического развития Красноярского края за 2012 год. - 11Р1_: http://econ.krskstate.ru/ser_kray/itog.
8. Регионы России. Основные характеристики субъектов Российской Федерации. Данные Федеральной службы государственной статистики: справ. - 2010 г. - 786 с.
----------♦'-----------
УДК 547.913: 57.083.33 Н.С. Коростелева, А.А. Ефремов
КОМПОНЕНТНЫЙ СОСТАВ И АНТИМИКРОБНАЯ АКТИВНОСТЬ ЭФИРНОГО МАСЛА ЗИМНЕЙ ДРЕВЕСНОЙ ЗЕЛЕНИ СОСНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ
Методом хромато-масс-спектрометрии определен компонентный состав эфирного масла и его отдельных фракций зимней древесины зеленой сосны обыкновенной (Pinus sylvéstiis). Исследована антимикробная активность полученных образцов масла, которая уменьшается с увеличением времени его выделения.
Ключевые слова: компонентный состав, фракции эфирного масла, сосна обыкновенная (Pinus sylvéstris), антимикробная активность.
N.S. Korosteleva, A.A. Efremov THE ESSENTIAL OIL COMPONENT COMPOSITION AND ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF SCOTCH PINE WINTER ARBOREOUS VERDURE
The essential oil component composition and its particular fractions of Scotch pine (Pinus sylvéstris) winter arboreous verdure is determined by the chromatography-mass spectrometry method use. The antimicrobial activity of the received essential oil samples that decreases with its elution time increase is researched.
Key words: component composition, essential oil fractions, Scotch pine (P'mus sylvéstris), antimicrobial activity.
Введение. Древесная зелень (ДЗ) - это смесь хвои, коры, ветвей и побегов древесины. Она представляет собой покрытые хвоей ветви диаметром не более 8 мм, заготовленные со свежесрубленных деревьев [1, 2]. Механический состав ДЗ зависит от породы дерева, однако, независимо от породы, она на 6580 % представлена хвоей; на долю коры приходится 10-13 % [3, 4].
Установлено, что ДЗ содержит комплекс веществ, обладающих высокой биологической активностью и представляющих практически все классы органических соединений, встречаемых в растениях [5].
Эфирные масла хвойных пород деревьев - ценное сырье для производства ряда химических продуктов, находящих свое применение в парфюмерии, косметике, производстве различных отдушек, дезодорантов, освежителей воздуха [6, 7]. Компонентный состав эфирного масла хвойных пород деревьев во многом определяется видом сырьевого источника и природно-климатическими условиями его произрастания. Исследования компонентного состава эфирного масла ДЗ пихты сибирской показали, что содержание и состав заметно изменяются в зависимости от периода заготовки [8-10].
В связи с этим следовало предположить, что изменения в составе и содержании масла могут наблюдаться и в случае эфирного масла сосны обыкновенной, компонентный состав которого в случае летней ДЗ описан в [11-12].
Цель работы. Исследование компонентного состава и содержания эфирного масла ДЗ сосны обыкновенной в зимний период, когда хвойные находятся в состоянии покоя, а также определение антимикробной активности полученных фракций эфирного масла.
Задачи исследования:
1) получить различные фракции эфирного масла и ДЗ сосны обыкновенной, определить их компонентный состав и физико-химические показатели;
2) определить антимикробную активность различных фракций эфирного масла из ДЗ сосны обыкновенной.
Методы исследования. Исходное сырье - ДЗ сосны обыкновенной, согласно [1, 2], собирали в декабре 2012 года с 55 деревьев, проба усреднялась методом квартования и подвергалась исследованиям как в свежем виде, так и после высушивания в тени при 20-25 °С. Эфирное масло получали методом исчерпывающей гидропародистилляции исходя из навески сырья более 2 кг, с использованием цельнометаллической установки с насадкой Клевенджера. Влажность исходного сырья определяли согласно ГОСТ 24027.0-80 [13]. Полученное эфирное масло количественно собирали в процессе отгонки до полного выделения всех компонентов эфирного масла в течение 20 часов, взвешивали и тем самым определяли его выход. Плотность и показатель преломления полученного масла и его отдельных фракций определяли с использованием высокоточных приборов фирмы Mettler Toledo 40 Density Meter и Mettler Toledo 40 D Refractometer при 20 °С. Состав эфирного масла определяли на хроматографе Agilent Technologies 7890 GC System с квадрупольным масс-спектрометром 5975 С в качестве детектора аналогично [8-10]. Содержание компонентов вычисляли по площадям пиков, идентификацию отдельных компонентов проводили сравнением времени удерживания и полных масс-спектров с соответствующими данными компонентов эталонных масел и чистых соединений, а также с использованием линейных индексов удерживания [14, 15].
Антимикробную активность определяли методом серийных разведений в 0,5 мл питательного бульона [16, 17]. В качестве тест-культур использовали штаммы условно-патогенных микроорганизмов: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus 209р, MRSA, Proteus vulgaris. Чистую культуру выращивали на скошенном питательном агаре, в течение 24 часов при 37 °С. Затем готовили взвесь из смыва выращенной культуры 0,85%-м раствором хлорида натрия, по стандарту мутности 1*109 мкл/мл. После определения «рабочей дозы» тест-культуры титровали эфирное масло путем двукратных разведений в объеме 0,5 мл мясо-пептонного бульона, затем во все пробирки вносили по 0,5 мл «рабочей дозы» тест-культуры. Пробирки с эфирным маслом и тест-культурой ставили на три часа на экспозицию при 37 °С, потом вносили индикатор метиленовый синий с глюкозой и мясо-пептонным агаром, содержимое пробирок вновь смешивали и инкубировали в течение часа при температуре 37 0С. Результат учитывали по цвету питательной среды: если индикатор обесцвечивался - подавления роста тест-культуры нет, если не изменился - свидетельствует о блокировке дыхательных ферментов бактериальных клеток тест-культур и вызывает их гибель.
Результаты исследования. Отдельно проведенными экспериментами установлено, что эфирное масло из зимней ДЗ сосны обыкновенной количественно отгоняется в течение не менее 20 часов от начала его выделения. Результаты пяти экспериментов показали, что содержание эфирного масла в ДЗ составляет
0,92±0,04 % в пересчете на абсолютно сухое сырье (влажность зимней ДЗ составляла 50,90 %).
Исследование динамики выделения эфирного масла в условиях гидропародистилляции с непрерывным отбором отдельных фракций позволило описать процесс выделения масла экспоненциальной зависимостью от времени и определить физико-химические характеристики полученных фракций. Из рисунка видно, что в данном случае процесс выделения эфирного масла из зимней ДЗ сосны обыкновенной аналогичен процессу в случае Дз пихты сибирской и сосны обыкновенной [8-10,12]. А количество выделенного масла экспоненциально зависит от времени его выделения и описывается следующим уравнением:
P=f(time)=(1-e-Hme),
где P - количество выделявшегося масла в относительных единицах; time - время отгонки, час; т - переменная, определяющая наклон модели (для данного процесса т=0,026).
Динамика выделения эфирного масла из зимней ДЗ сосны обыкновенной в условиях гидропародистилляции
В таблице 1 приведены условия отбора отдельных фракций эфирного масла по мере его выделения и приведены показатель преломления и плотность полученных фракций.
Таблица 1
Динамика выделения и физико-химические показатели отдельных фракций эфирного масла сосны
обыкновенной
Время выделения, ч Количество выделившегося масла, % па20 Плотность, г/см3
1,2 21,55 1,4726 0,8596
2,0 21,22 1,4741 0,8616
4,0 22,89 1,4766 0,8621
5,0 13,67 1,4865 0,8850
8,0 20,67 1,4913 0,8938
Цельное масло 100,0 1,4810 0,8812
Изменение плотности и показателя преломления полученных фракций эфирного масла свидетельствует об изменении компонентного состава. Тем не менее интегральные величины цельного масла зимней ДЗ близки к таковым в случае летней ДЗ сосны обыкновенной и сосны пицундской (см. табл. 2) [12].
Таблица 2
Физико-химические показатели эфирного масла сосны обыкновенной и сосны пицундской
Исходное сырье па20 Плотность, г/см3
Хвоя сосны обыкновенной 1,4790 0,8772
Летняя ДЗ сосны обыкновенной 1,4824 0,8893
Зимняя ДЗ сосны обыкновенной 1,4810 0,8812
Летняя ДЗ сосны пицундской 1,4767 0,8728
Компонентный состав цельного эфирного масла и его фракций из зимней ДЗ сосны обыкновенной, полученного методом исчерпывающей гидропародистилляции, установленный с использованием хромато-масс-спектрометрии, приведен в таблице 3.
Таблица 3
Компонентный состав эфирного масла различных фракций сосны обыкновенной
га Компонент Содержание от и ельного масла, %
Цельное масло Ф 1* Ф 2 Ф 3 Ф 4 Ф 5
1 2 3 4 5 6 7 8
921 трициклен 0.67 1.79 0.88 1.53 0.34 0.64
928 3-туйен 0.94 2.23 0.20 1.93 0.11 1.88
932 а-пинен 27.48 36.06 41.85 34.60 18.45 8.82
952 камфен 2.06 11.21 3.47 5.79 0.80 5.12
957 вербенен 1.11 2.22 - 1.24 - 1.61
963 бензальдегид 0.54 0.84 - 1.60 - 0.64
974 сабинен 0.20 0.53 0.23 - - -
977 р-пинен 1.92 3.46 2.03 1.93 1.34 0.77
992 р-мирцен 2.40 3.33 2.73 1.99 1.98 1.53
1003 а-фелландрин 0.16 0.14 0.13 0.13 0.21 0.25
1010 3-карен 9.84 12.51 12.01 8.32 6.98 3.70
1015 а-терпинен 0.15 0.17 0.20 0.17 0.21 0.18
1023 пара-цимен 0.20 0.17 0.11 - - -
1028 р-фелландрин 8.20 10.66 8.68 6.70 8.02 5.88
1048 транс-р-оцимен 0.55 0.86 1.00 0.55 0.25 -
1057 Y-терпинен 0.25 0.31 0.36 0.27 0.26 0.19
1087 терпинолен 1.23 1.80 1.86 1.18 1.00 0.75
1175 терпинен-4-ол 0.30 0.14 0.34 0.33 0.31 0.17
1189 а-терпинеол 0.45 - 0.20 0.31 0.68 0.70
1234 тимол метиловый эфир 0.16 0.19 0.20 0.17 0.18 0.16
1285 борнил ацетат 0.96 1.18 1.69 0.86 0.39 0.13
1349 а-терпинеол ацетат 0.47 0.36 0.57 0.48 0.53 0.41
1375 а-копаен 0.42 0.16 0.17 0.35 0.72 0.79
1384 р-бурбонен 0.10 - - - 0.14 0.16
1391 р-элемен 0.64 - 0.22 0.52 1.07 1.17
1403 цис-селина-4(15),6-диен 0.16 0.37 0.24 0.13 0.12 -
1418 кариофиллен 2.75 0.70 1.15 2.02 5.43 5.76
1428 р-копаен 0.13 0.13 - 0.10 0.23 0.31
1438 аромадендрен 0.35 - 0.10 0.22 0.68 1.06
1443 гвайя-6,9-диен 0.14 0.22 0.14 - - -
1449 цис-муурола-3,5-диен 0.20 0.11 0.35 0.38 0.56 0.59
1452 хумулен 0.52 0.12 0.30 0.48 1.01 1.10
1462 цис-муурола-4(14),5-диен 0.34 0.12 0.28 0.31 0.54 0.57
1473 транс-кадина-1,6,4-диен 0.38 0.14 0.38 0.46 0.71 0.87
1477 Y-мууролен 0.87 0.29 0.52 0.71 1.54 2.12
1481 О-гермакрен 0.69 0.42 0.80 1.03 1.32 0.69
1485 р-селинен 0.76 0.14 0.34 0.65 1.48 1.85
Окончание табл. 3
1 2 3 4 5 6 7 8
1491 бициклосесквифландрен 0.41 0.24 0.55 0.52 0.61 0.43
1494 а-селинен 1.48 - 1.26 - 3.09 2.97
1496 бициклогермакрен 0.26 0.56 - 1.82 - -
1500 а-мууролен 1.18 0.59 1.01 1.05 1.82 2.29
1515 Y-кaдинен 3.93 1.02 1.77 2.33 6.09 7.45
1525 5-кадинен 6.57 2.43 5.00 6.03 10.44 14.41
1532 транс-кадина-1,4-диен 0.29 0.10 0.26 0.31 0.48 0.54
1538 а-кадинен 0.29 0.13 0.23 0.24 0.44 0.55
1543 а-калакорен 0.16 - - 0.12 0.21 0.20
1566 не идентиф. 0.15 - - 0.15 0.32 0.22
1577 спатуленол 0.94 - 0.48 0.67 1.23 0.94
1583 глобулол 0.60 - 0.27 - - 0.83
1591 виридифлорол 0.11 - - - - 0.31
1609 р-олофенон 0.13 - - 0.14 0.25 0.16
1615 1,10-ди-эпи-кубенол 0.35 - 0.17 0.40 0.63 0.53
1622 эремолигнол 0.10 - - - 0.16 0.18
1628 1-эпи-кубенол 0.80 - 0.38 0.74 1.42 1.27
1642 т-кадинол 0,15 0.50 2.10 - - -
1644 Т-мууролол 5.66 - - 3.81 7.78 8.63
1647 5-кадинол 0.61 - 0.27 0.46 1.02 1.01
1656 а-кадинол 3.33 0.36 1.73 2.30 5.17 5.46
1728 хамазулен 0.16 - - - 0.16 0.16
Идентифицировано: 98,7% 99.1% 99,21% 98.38% 98.59% 98.89%
* - номер фракции в данной таблице соответствует номеру фракций в таблице 1.
Анализ полученных данных позволяет заключить, что эфирное масло зимней ДЗ сосны обыкновенной содержит не менее 59 индивидуальных компонентов, которые идентифицируются по полным масс-спектрам и линейным индексам удерживания, за исключением компонента с индексом удерживания 1566.
Основными компонентами цельного эфирного масла ДЗ сосны обыкновенной являются: а-пинен, 3-карен, р-фелландрен, 5-кадинен, т-мууролол, а-кадинол и другие.
Практически аналогичные данные по компонентному составу эфирного масла августовской ДЗ сосны обыкновенной были получены нами ранее [12].
Анализ компонентного состава полученных отдельных фракций эфирного масла показал, что по мере увеличения продолжительности процесса гидропародистилляции доля высококипящих компонентов возрастает, а доля легколетучих компонентов уменьшается.
Из имеющихся литературных данных известно, что практически все эфирные масла обладают антимикробным действием [18-19]. Очевидно, что антимикробным действием будет обладать как само цельное масло, так и его отдельные фракции. Учитывая тот факт, что компонентный состав полученных фракций несколько различается, следует ожидать, что эти фракции масла могут различаться по антимикробной активности.
В таблице 4 приведены данные по антимикробной активности полученных фракций и цельного масла в отношении некоторых микробных сообществ.
Таблица 4
Антимикробная активность эфирного масла сосны обыкновенной, мкг/мл
Эфирное масло 5 І CD -2 ‘25 І» § % 1 3 1 сх Escherichia coli Proteus vulgaris Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa
Фракция 1 0,66 5,31 21,25 10,62 0,66 21,25
Фракция 2 1,32 5,31 21,25 10,62 0,66 42,5
Фракция 3 1,32 10,62 21,25 21,25 1,32 42,5
Фракция 4 2,65 21,25 21,25 21,25 1,32 85
Фракция 5 5,31 21,25 42,5 42,5 2,65 85
Цельное 1,32 10,62 21,25 10,62 1,32 42,5
Естественно, что на различные микроорганизмы цельное эфирное масло действует по-разному, причем наибольшая активность его проявляется к грамположительным MRSA и Staphylococcus aureus. Но наибольший интерес в этом плане представляет тот факт, что антимикробная активность всех фракций эфирного масла заметно снижается с увеличением номера фракции. Иными словами, наибольшую антимикробную активность будет иметь первая фракция эфирного масла зимней ДЗ сосны обыкновенной.
Выводы
1. Определен компонентный состав различных фракций эфирного масла сосны обыкновенной. С использованием хромато-масс-спектрометрии установлено, что в состав эфирного масла сосны обыкновенной входит не менее 59 компонентов, 58 из которых идентифицировано.
2. Изучена антимикробная активность различных фракций эфирного масла сосны обыкновенной, которая заметно снижается с увеличением времени выделения масла. Установлено более интенсивное воздействие на грамположительные микроорганизмы.
Литература
1. ГОСТ 21769-84. Зелень древесная. - М.: Изд-во стандартов, 1984. - 5 с.
2. Химическая технология древесины / А.К. Славянский, В.И. Шарков, А.А. Ливеровский [и др.]. - М.: Гослесбумиздат, 1962. - 577 с.
3. Ягодин В.И. Основы химии и технологии переработки древесной зелени. - Л.: Изд-во ЛГУ, 1981. - 244 с.
4. Репях С.М., Чупрова Н.А., Величко H.A. Состав древесной зелени хвойных // Химия древесины. -1982. - № 3. - С.92-95.
5. Андерсон П.П., Репях С.М., Полис О.Р. Основы классификации химических веществ, входящих в состав древесной зелени // Изучение химического состава древесной зелени. - Рига: Зинатне, 1983. -С. 5-10.
6. Войткевич С.А., Хейфиц Л.А. От древних благовоний к современным парфюмерии и косметике // Пищ. пром-сть. - М., 1997. - 215 с.
7. Лоулес Д. Энциклопедия ароматических масел. - М.: Крон-пресс, 2000. - 287 с.
8. Ефремов Е.А., Ефремов А.А. Компонентный состав эфирного масла июльской лапки пихты сибирской Красноярского края // Химия растительного сырья. - 2010. - № 2. - С. 135-138.
9. Ефремов Е.А., Ефремов А.А. Компонентный состав эфирного масла октябрьской лапки пихты сибирской Красноярского края // Химия растительного сырья. - 2010. - № 3. - С. 121-124.
10. Ефремов Е.А., Ефремов А.А. Компонентный состав эфирного масла зимней лапки пихты сибирской Красноярского края // Химия растительного сырья. - 2012. - № 4. - С. 113-117.
11. Чекушкина Н.В., Невзорова Т.В., Ефремов А.А. Фракционный состав эфирного масла сосны обыкновенной // Химия растительного сырья. - 2008. - № 2. - C. 87-90.
12. Зыкова И.Д., Ефремов А.А. Сравнительный анализ компонентного состава эфирных масел Pinus Pi-thyusa и Pinus Silvestris // Химия растительного сырья. - 2012. - № 2. - С. 105-110.
13. ГОСТ 24027.2-80. Сырье лекарственное растительное. - М.: Изд-во стандартов, 1980. - 27 с.
14. Ткачев А.В. Исследование летучих веществ растений. - Новосибирск, 2008. - 969 с.
15. Adams R.P. Identification of essential oil components by gas chromatography/mass spectroscopy // 4th ed.
Allured Publishing Corporation. - Illinois, USA, 2007. - 804 p.
16. Леви М.И., Горожанкина И.А., Сагатовская Л.А. Быстрый метод определения чувствительности бактериальных культур к различным антибиотикам в жидкой среде // Антибиотики. - 1967. - № 1. -С. 57-65.
17. Дьяков С.И., Лебедева И.К., Сидоренко С.В. Современные методы и средства быстрого определения чувствительности возбудителей опасных инфекционных заболеваний к антибиотикам и химиопрепаратам // Военно-мед. журн. - 1996. - № 3. - C. 44-47.
18. Воздействие эфирных масел Сибирского региона на условно-патогенные микроорганизмы / Е.Г. Стру-
кова, А.А. Ефремов, А.А. Гонтова [и др.] // Химия растительного сырья. - 2009. - № 4. - С. 57-62.
19. Определение микроэкологического статуса и диагностика инфекций организма человека с использованием метода хромато-масс-спектрометрии / Е.Г. Струкова, А.А. Ефремов, А.А. Гонтова [и др.] // Журнал Сибирского федерального университета. Химия. - 2009. - № 4. - С. 351-358.
