CC BY
12
УДК 575.1 13.5:575.1 17.2
Комплексный анализ стромальных и сывороточных маркеров при раке желудка
О. В. Ковалева1*, П. А. Подлесная1, В. Л. Чанг2, Н. А. Огнерубов2, А. Н. Грачев1, Н. А. Козлов1, И. С. Стилиди1, Н. Е. Кушлинский1
Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина Минздрава России, 1 15552, Москва, Россия
2Тамбовский государственный университет им. Г.Р. Державина Министерства образования
и науки, 392000, Тамбов, Россия
*E-mail: ovkovaleva@gmail.com
Поступила в редакцию 14.06.2022
Принята к печати 20.10.2022
DOI: 10.32607/actanaturae.11753
РЕФЕРАТ Комплексный анализ фенотипа клеток воспалительного инфильтрата опухолевой стромы является перспективным направлением молекулярной онкологии. Также крайне актуальным представляется изучение не только мембраносвязанных форм различных молекул, связанных с иммунной регуляцией, но и их растворимых форм. Проведен комплексный анализ тканевых и циркулирующих форм белков PD-1 и PD-L1, а также макрофагов и В-клеток стромы злокачественных опухолей желудка для оценки их клинической и прогностической значимости. Проведен иммуноферментный и иммуно-гистохимический анализ 63 образцов опухолей и плазмы крови от больных раком желудка. Показано, что злокачественные опухоли желудка сильно инфильтрированы В-клетками, количество которых сравнимо с содержанием макрофагов. Обнаружена ассоциация экспрессии PU.1 с размером опухоли, а именно, опухоли большего размера содержат меньше PU.1+ инфильтрирующих клеток (p = 0.005). Не выявлено клинической значимости CD20+ и CD163+ клеток, однако их количество в строме было больше на более ранних стадиях заболевания и при отсутствии метастазов. Показано также, что содержание PD-L1 в опухолевых клетках не ассоциировано с клиническими и морфологическими характеристиками рака желудка, в то время как экспрессия PD-L1 в стромальных клетках опухоли ассоциирована с наличием отдаленных метастазов. Анализ прогностической значимости исследованных маркеров показал, что CD163 статистически значимо ассоциирован с неблагоприятным прогнозом данного заболевания (p = 0.019). Отмечена также тенденция к благоприятному прогнозу в случае экспрессии PD-L1 в опухолевых клетках (p = 0.122). Полученные нами результаты свидетельствуют о перспективности изучения растворимых и тканевых маркеров опухолевой стромы для прогнозирования течения рака желудка. Актуальным представляется поиск комбинаций маркеров, комплексный анализ которых поможет персонализировать современную противоопухолевую терапию. КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА рак желудка, PD-1, PD-L1, строма, прогноз.
ВВЕДЕНИЕ
Рак желудка (РЖ) - одно из наиболее распространенных видов онкологических заболеваний во всем мире и одна из основных причин смертности от онкологических заболеваний. Заболеваемость РЖ у мужчин выше, чем у женщин [1]. К возникновению РЖ приводит большое количество различных факторов, включая инфекцию Helicobacter pylori [2], курение [3], особенности питания [2], генетические нарушения [4] и другие факторы.
Несмотря на известность большинства этиологических факторов возникновения РЖ, раннюю диагностику этого заболевания затрудняет его бессимптомное развитие, что часто приводит к выявлению данной патологии уже на поздних стадиях. При распространенном РЖ применяют стандартные комбинированные схемы терапии, включающие фторпиримидин и препараты платины (а также тра-стузумаб в случае HER2-положительных опухолей), в качестве препаратов первой линии и паклитаксел
с рамуцирумабом или без него в качестве второй линии. Однако медиана выживаемости при распространенном РЖ все еще составляет примерно 12-15 месяцев, поэтому, безусловно, требуется внедрение новых методов лечения [5-7]. В последнее время новым стандартным методом лечения нескольких злокачественных опухолей, включая распространенный РЖ, стали ингибиторы иммунных контрольных точек (ИКИ). Однако успехи иммунотерапии РЖ не очень велики. Проводится большое количество клинических исследований, в которых для достижения максимального эффекта используют различные комбинации иммуно- и химиотерапевтических препаратов. Спорным остается вопрос, влияет ли количество PD-L1+ опухолевых клеток на эффективность терапии и нужно ли учитывать их количество при назначении соответствующего лечения. Кроме того, на успех терапии может повлиять качественный и количественный состав микроокружения опухоли. Например, повышенное количество ТЫ-клеток способствует воспалению и развитию РЖ [8], а содержание В-клеток, экспрессирующих ГЬ-10, влияет на продукцию цитокинов CD4+ и CD8+ Т-клетками [9].
К основным типам клеток иммунного инфильтрата опухоли относятся макрофаги и Т-клетки, а также В-клетки. Известно, что количество и состав клеток опухолевого микроокружения могут быть как прогностическим фактором течения заболевания, так и маркером ответа на проводимую терапию. Транскрипционный фактор Ри.1, играющий важную роль в гемопоэзе, экспрессируется на высоком уровне в макрофагах. Ранее мы показали, что Ри.1 можно использовать в качестве маркера макрофагов в строме различных типов солидных опухолей [10]. CD3 является поверхностным маркером зрелых Т-клеток и используется для оценки их содержания в различных типах тканей. Трансмембранный белок CD20 экспрессируется на поверхности В-клеток-предшественников и зрелых В-клеток, что позволяет использовать его в различных клинических исследованиях в качестве общего В-клеточного маркера.
В нашей работе проведен комплексный анализ экспрессии PD-L1 в опухолевых и стромальных клетках РЖ, а также определено содержание растворимой формы PD-L1 в плазме крови пациентов. Проанализировано также содержание макрофагов и ассоциированных с опухолью В-клеток в строме опухолей РЖ.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В исследование включены 63 первичных больных РЖ с различными стадиями опухолевого
процесса, проходивших обследование и лечение в Национальном медицинском исследовательском центре онкологии им. Н.Н. Блохина, а также 60 здоровых доноров. Все процедуры, выполненные в исследовании с участием больных и здоровых доноров, соответствуют стандартам этического комитета организации и Хельсинкской декларации 1964 года и ее последующим изменениям или сопоставимым нормам. От каждого из включенных в исследование участника получено информированное добровольное согласие. Клинический диагноз «рак желудка» у всех пациентов подтвержден данными морфологического исследования опухоли согласно Международной гистологической классификации опухолей пищеварительной системы (ВОЗ, 2019). Описание выборки представлено в табл. 1.
Концентрацию белков sPD-L1 и sPD-1 определяли в плазме крови, полученной по стандартной методике до начала специфического лечения, с помощью наборов реактивов для иммунофер-
Таблица 1. Клинико-морфологические характеристики больных раком желудка
Характеристика Число случаев, %
Возраст <61 >61 32 (51) 31 (49)
Пол Мужской Женский 35 (56) 28 (44)
Гистология Аденокарцинома Перстневидноклеточный рак Недифференцированный рак 52 (82.5) 10 (16) 1 (1.5)
Стадия 1-11 Ш-ГУ 25 (40) 38 (60)
Локализация Дистальный отдел КЭР (кардиоэзофагеальный рак) Проксимальный отдел Тело желудка Тотальное поражение 14 (22) 3 (5) 16 (25) 26 (42) 4 (6)
Размер опухоли (Т) Т1-Т2 Т3-Т4 13 (21) 50 (79)
Наличие регионарных метастазов (Ы) N0 24 (38) 39 (62)
Наличие отдаленных метастазов (М) М0 М+ 54 (86) 9 (14)
Степень дифференцировки (О) 01-02 ОЗ 19 (30) 44 (70)
Л
PU.1
CD163
CD20
25
20
.с
нт 15
е
и
ZS га 10
d
5
дП
20-
I
ш
5 10 J
га
С 5
rUo-
10 20 30 40 50 60 70 80
Количество клеток в поле зрения
0
20
3 15 т
иен10
J
га
(ЩДд
№
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 Количество клеток в поле зрения
•■•V7'' • - ГЛ
а/
Hfl '
IM
iio ■
' fc£aHK»i
v'K-Ж,- J
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Количество клеток в поле зрения
-V/ , .■:
Jft
' V*. '
GiftC4 Л>.
Рис. 1. Распределение Ри.1+, CD163+ и CD20+ клеток в строме опухолей больных РЖ (А) и пример иммуноги-стохимического окрашивания опухолей желудка с использованием антител к Ри.1, CD163 и CD20 (х 100) (Б)
0
0
Б
ментного анализа: Human PD-L1 Platinum ELISA, Human PD-1 ELISA kit (Affimetrix, eBioscience, США) в соответствии с инструкциями производителя. Измерения проводили на автоматическом иммуноферментном анализаторе BEP 2000 Advance (Siemens Healthcare Diagnostics, Германия). Содержание маркеров выражали в пикограммах (пг) на 1 мл плазмы крови.
Иммуногистохимическое (ИГХ) исследование CD163, PU.1 и CD20 выполнено по стандартной методике на срезах опухолевой ткани. Для демаскировки антигена использовали Tрис-EDTA-буфер pH 9.0 («ПраймБиоМед», Россия). Первичные антитела к PU.1 (4G6; «ПраймБиоМед», разведение 1 : 200), CD163 (10D6; BIOCARE, США, разведение 1 : 100) и CD20 (клон PBM-12F1; «ПраймБиоМед», разведение 1 : 100) инкубировали в течение 30 мин. Использовали систему детекции PrimeVision Ms/Rb HRP/DAB (78-310004, «ПраймБиоМед») согласно инструкциям производителя.
Полученные препараты анализировали с помощью микроскопа OLYMPUS BX53, камеры Lumenera INFINITY2-2C и программного обеспечения Infinity analyze. Оценивали экспрессию CD163, PU.1 и CD20 в строме опухоли. В каждом случае количество CD163, PU.1 и CD20 положительных клеток подсчитывали при увеличении х200 в пяти независимых полях зрения. Образец считали положительным при наличии хотя бы одной специфи-
чески окрашенной клетки. Содержание CD163, Ри.1 и CD20 в строме опухоли выражали как среднее значение количества клеток в поле зрения.
Полученные данные обрабатывали с помощью программы GraphPad Ртт 9.0. Для сравнения показателей и анализа их взаимосвязей использовали непараметрический критерий Манна-Уитни и коэффициент ранговой корреляции Спирмена. Для анализа общей выживаемости больных разделили на две группы сравнения в зависимости от медианы содержания исследуемых белков. Общую выживаемость анализировали путем построения кривых дожития по методу Каплана-Майера. Статистическую значимость различий оценивали с использованием логарифмического рангового критерия. Потенциальное влияние различных факторов риска на выживаемость оценивали с помощью многофакторного анализа с использованием непараметрической модели пропорциональных рисков Кокса. Различия и корреляции считали статистически значимыми при р < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Экспрессию Ри.1, CD163 и CD20 выявили в 100% исследованных образцов РЖ. Распределение клеток, содержащих Ри.1, CD163 и CD20, в образцах РЖ представлено на рис. 1.
Анализ результатов исследования показал, что медиана содержания Ри.1+ клеток в образ-
Таблица 2. Ассоциация Ри.1+, CD163+ и CD20+ клеток в строме опухоли с клинико-морфологическими характеристиками заболевания
Характеристика Ри.1 (число клеток) СЭ163 (число клеток) CD20 (число клеток)
Медиана (25-75%) Р Медиана (25-75%) Р Медиана (25-75%) Р
Возраст <61 >61 35.8 (23.4-42.7) 34.2 (20.2-42.0) 0.488 17.2 (9.05-22.3) 18.2 (13.2-25.2) 0.297 28.2 (19.4-45.4) 34.4 (20.8-45.2) 0.418
Пол Мужской Женский 33.6 (20.2-37.6) 37.3 (26.9-44.2) 0.150 16.2 (10.4-24.4) 18.0 (12.9-21.1) 0.713 29.4 (18.8-45.2) 33.9 (22.9-44.9) 0.403
Гистология Аденокарцинома Перстневидноклеточный рак Недифференцированный рак 35.0 (20.8-41.9) 29.7 (23.3-37.7) 63.4 (63.4-63.4) 0.216 17.6 (11.8-24.1) 17.5 (10.8-19.7) 28.2 (28.2-28.2) 0.459 33.3 (19.9-44.8) 30.5 (22.1-47.8) 19.6 (19.6-19.6) 0.574
Стадия 1-11 Ш-ГУ 35.8 (27.5-44.8) 33.8 (18.0-39.5) 0.249 17.8 (13.7-20.7) 16.7 (10.1-24.6) 0.623 34.4 (21.6-46.3) 29.4 (19.5-43.9) 0.424
Локализация Дистальный отдел КЭР Проксимальный отдел Тело желудка Тотальное поражение 34.8 (28.9-44.1) 35.8 (0.4-41.8) 33.6 (12.5-41.2) 33.4 (24.4-39.8) 48.4 (38.1-61.0) 0.226 17.5 (12.4-23.4) 19.4 (14.8-25.2) 17.3 (11.8-24.1) 18.1 (11.6-23.6) 11.1 (7.7-24.5) 0.824 33.8 (24.7-43.1) 23.4 (6.0-24.6) 28.8 (13.3-52.4) 37.7 (22.3-47.3) 26.5 (18.6-41.1) 0.316
Размер опухоли (Т) Т1-Т2 Т3-Т4 41.8 (35.5-54.4) 32.9 (19.1-38.7) 0.005* 17.8 (14.5-23.0) 17.6 (10.1-23.4) 0.504 36.0 (26.1-48.1) 29.4 (19.5-43.9) 0.277
Наличие регионарных метастазов (Ы) N0 35.5 (25.3-42.8) 34.8 (20.2-41.4) 0.733 17.3 (12.9-20.0) 17.8 (11.4-28.2) 0.437 33.3 (19.9-44.4) 29.4 (20.6-45.2) 0.947
Наличие отдаленных метастазов (М) М0 М+ 34.8 (25.6-41.9) 35.4 (13.6-48.6) 0.889 17.6 (11.2-23.4) 18.4 (12.8-25.4) 0.598 33.3 (21.1-45.3) 29.4 (10.6-40.2) 0.214
Степень дифференцировки (О) 01-02 03-04 37.6 (25.0-49.8) 34.2 (18.7-38.9) 0.131 19.0 (13.2-25.8) 16.2 (10.9-21.5) 0.448 33.2 (22.0-43.6) 33.4 (18.6-45.4) 0.796
'Статистически значимо.
це составила 34.8 (0.4-77.8) клеток в поле зрения, CD163+ клеток - 17.6 (0.8-66.4), CD20+ клеток -32.2 (3.2-91.2). Следует отметить, что в опухолях желудка В-клетки представлены в таком же количестве, как и Ри.1+ макрофаги.
Связь количества PU.1+, CD163+ и CD20+ клеток c клинико-морфологическими характеристиками РЖ
На следующем этапе работы сопоставили содержание Ри.1+, CD20+ и CD163+ клеток в строме опухоли с клинико-морфологическими характеристиками заболевания (табл. 2).
Проведенный анализ показал, что содержание Ри.1 значимо ассоциировано с размером опухоли, и именно опухоли большего размера содержат меньше Ри.1+ инфильтрирующих клеток. Также следует отметить различия в содержании Ри.1 + и CD163+ клеток в зависимости от локализации опухоли. Так, наибольшее количество Ри.1+ клеток
и наименьшее количество CD163+ клеток выявлено при тотальном поражении желудка, однако эти наблюдения не достигали статистической значимости.
Содержание PD-1 и PD-L1 в образцах опухоли больных РЖ
Помимо анализа экспрессии стромальных маркеров, оценили тканевое содержание PD-L1 в образцах РЖ. Примеры иммуногистохимического окрашивания на PD-L1 представлены на рис. 2.
Рис. 2. Экспрессия PD-L1 в образцах РЖ (Х100)
Таблица 3. Ассоциация содержания PD-L1 в опухолевых клетках и в строме опухоли с клинико-морфологически-ми характеристиками заболевания
PD-L1, опухоль (n) PD-L1, строма (n)
Характеристика + +
- Р - Р
Возраст
<61 8 24 0.117 18 14 0.609
>61 14 17 20 11
Пол
Мужской 12 23 >0.999 18 17 0.127
Женский 10 18 20 8
Гистология
Аденокарцинома 19 33 0.704 32 20 0.567
Перстневидноклеточный рак 3 7 5 5
Недифференцированный рак 0 1 1 0
Стадия
1-11 8 17 0.790 16 9 0.793
Ш-^ 14 24 22 15
Локализация
Дистальный отдел 3 11 0.396 8 6 0.987
КЭР 0 3 2 1
Проксимальный отдел 7 9 10 6
Тело желудка 11 15 16 10
Тотальное поражение 1 3 2 2
Размер опухоли (Т)
Т1-Т2 3 10 0.515 11 2 0.058
Т3-Т4 19 31 27 23
Наличие регионарных метастазов (Ы)
N0 7 17 0.588 13 11 0.597
15 24 25 14
Наличие отдаленных метастазов (М)
М0 21 33 0.144 36 18 0.023*
М+ 1 8 2 7
Дифференцировка (0)
01-02 7 12 >0.999 14 5 0.239
03 12 21 18 15
*Статистически значимо.
Экспрессия PD-L1 в опухолевых клетках отмечена в 35% (22 из 63) образцов. Экспрессию PD-L1 в стромальных клетках выявили в 60% (38 из 63) образцов. Далее проанализировали ассоциацию между содержанием PD-L1 и клинико-морфологическими характеристиками заболевания (табл. 3).
Проведенное исследование показало, что содержание PD-L1 в опухолевых клетках не ассоциировано с клиническими и морфологическими характеристиками РЖ. Экспрессия PD-L1 в стро-мальных клетках опухоли ассоциирована с отдаленными метастазами, именно при их наличии реже наблюдали экспрессию PD-L1 в строме первичной опухоли.
Растворимые формы PD-1 и PD-L1
Дополнительно проведен анализ содержания растворимых форм (sPD-1, sPD-L1) контрольной точки иммунитета PD-1/PD-L1 в плазме крови больных РЖ для выявления корреляций между их содержа-
нием в плазме крови, тканевой экспрессией и прогностической значимостью.
На первом этапе работы мы оценили диагностический потенциал исследованных белков. Медиана содержания sPD-1 и sPD-L1 в плазме крови здоровых доноров составила 29.25 (14.9-45.5) и 36.23 (9.83-73.1) пг/мл соответственно, в группе больных РЖ - 12.57 (7.7-19.7) и 21.83 (10.1-74.3) пг/мл. Проведение статистического анализа показало, что содержание растворимой формы рецептора sPD-1 у больных РЖ значимо ниже, чем у здоровых доноров. Уровни sPD-L1 в группах здоровых доноров и больных РЖ не различались.
Корреляционный анализ растворимых и тканевых форм исследованных белков
Корреляцию уровней исследуемых белков анализировали с использованием коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Результаты представлены на рис. 3.
о
х □
О
5 о а
а а о о о. о. и и
1.00 -0.25 0.07 0.26 0.01 0.18 0.17
-0.25 1.00 0.17 -0.07 -0.19 -0.16 -0.22
Рй-1-1 (опухоль) 0.07 0.17 1.00 0.46 0.29 0.16 0.13
Рй-Ы (строма) 0.26 -0.07 0.46 1.00 0.31 0.39 0.33
Сй20 0.01 -0.19 0.2Э 0.31 1.00 0.26 0.26
Сй163 0.18 -0.16 0.16 0.39 0.26 1.00 0.24
РУ.1 0.17 -0.22 0.13 0.33 0.26 0.24 1.00
1.0
0.5
-0.5
-1.0
Рис. 3. Корреляционный анализ тканевых и сывороточных уровней PD-1, PD-L1, Ри.1, CD163 и CD20 у больных раком желудка
Показано, что содержание в плазме крови растворимой формы рецептора sPD-1 обратно коррелирует с содержанием в плазме крови sPD-L1 и прямо коррелирует с тканевой экспрессией PD-L1 в стро-мальных клетках (г = -0.251; р = 0.047 и г = 0.255; р = 0.044 соответственно). Также экспрессия PD-L1 в стромальных клетках опухолей желудка прямо коррелировала с экспрессией PD-L1 в опухолевых клетках и содержанием всех исследованных стро-мальных маркеров. Аналогичную картину наблюдали и для В-клеток. А именно, содержание CD20+ В-клеток в строме опухолей положительно статистически значимо коррелирует как с содержанием макрофагов, так и с экспрессией PD-L1 и в строме, и в опухолевых клетках.
Прогностическая значимость PD-L1/PD-1 у больных РЖ
Нами проведен анализ прогностической значимости исследованных маркеров и их комбинаций у больных РЖ. Для анализа показателей выживаемости пациентов распределили на две группы: с высоким и низким содержанием растворимых форм-маркеров относительно медианы. В случае тканевой экспрессии PD-L1 пациентов распределяли на две группы по наличию/отсутствию этого белка отдельно в опухолевых и стромальных клетках. Дополнительно проанализировали выживаемость в зависимости от комплексного содержания как растворимой sPD-L1, так и тканевой формы PD-L1. Графики выживаемости больных представлены на рис. 4.
В данном исследовании не была установлена связь между уровнем sPD-1 и sPD-L1 при РЖ и прогнозом выживаемости. Аналогичную картину наблюдали в случае тканевой формы PD-L1, однако следует отметить тенденцию к прогностической значимости PD-L1, а именно, высокий уровень этого белка в опухолевых клетках РЖ является более благоприятным прогностическим фактором, в отличие от низкой экспрессии маркера (р = 0.122). Проведение комплексного анализа показало, что высокое содержание одновременно тканевой и растворимой форм PD-L1 также не является прогностическим маркером выживаемости при РЖ.
Далее проанализировали прогностическую значимость PИ.1, CD20 и CD163 при РЖ. Результаты представлены на рис. 5.
Как следует из представленных на рис. 5 данных, стромальные маркеры ^ИЛ, CD163, CD20) не имеют прогностической значимости при РЖ.
Результаты многофакторного статистического анализа прогностической значимости всех исследованных маркеров представлены в табл. 4.
С использованием регрессионного анализа Кокса показано, что высокое содержание CD163 при РЖ можно рассматривать как независимый прогностический фактор, ассоциированный со снижением показателей общей выживаемости.
ОБСУЖДЕНИЕ
Клиническая и прогностическая значимость микроокружения опухолей желудка активно изучается в настоящее время. Нами проведен анализ содержания PИ.1+, CD163+ и CD20+ в строме опухолей желудка и оценена их клиническая и прогностическая значимость. В контексте солидных опухолей изучена клиническая значимость экспрессии PИ.1 у больных раком молочной железы и глиомами [11, 12], причем показана ассоциация его экспрессии с прогрессией и неблагоприятным прогнозом при обеих нозологиях. Экспрессия PИ.1 изучена также при немелкоклеточном раке легкого (НМРЛ) [13], раке толстой кишки [14] и пищевода [10]. Изучению экспрессии PИ.1 при РЖ посвящено одно исследование, в котором показано, что экспрессия PИ.1 значительно повышена в опухолевой ткани желудка по сравнению с относительной нормой и ассоциирована с неблагоприятным прогнозом и прогрессиро-ванием заболевания. Более того, высокая экспрессия PИ.1 положительно коррелирует с количеством активированных CD4 Т-клеток памяти, покоящихся №К-клеток, макрофагов М2, покоящихся дендритных клеток и нейтрофилов в строме опухоли [15]. Проведенное нами исследование не выявило прогностической значимости этого белка, однако мы на-
50
БРй-1
БРй-И
высокий
20
т-40
60
80
ЧР
с о
ем50
а в и ж ы 00 0
низкий высокий
"Т
20
Время, месяцы Рй-И (строма)
т
40 60 80 Время, месяцы
Рй-И (опухоль)
' Рй-И-— Рй-И +
т
20
40
60
80
20
т
40
60
80
Время, месяцы
Время, месяцы
БРй-И+Рй-И (опухоль)
чР
О^ 100
с о
ем50
а в и ж ы В
низкий высокий
"Г
20
40 60 80 Время, месяцы
БРй-И+Рй-И (строма)
20
40
т-60
п
80
Время, месяцы
Рис. 4. Анализ общей выживаемости больных РЖ в зависимости от содержания растворимых (БРй-И, БРй-1) и тканевых (Рй-И, Рй-1) форм основных компонентов контрольной точки иммунитета Рй-1/Рй-11
Таблица 4. Статистический анализ прогностической значимости БРй-1, БРй-И, Рй-И, Сй20, Сй163 и Ри.1 при раке желудка
0
0
0
0
0
0
0
Показатель Однофакторный анализ Многофакторный анализ
HR 95% С1 Р HR 95% С1 Р
sPD-1 (высокий/низкий) 1.443 (0.646-3.226) 0.366 0.971 (0.915-1.013) 0.234
sPD-L1 (высокий/низкий) 1.038 (0.466-2.315) 0.927 0.999 (0.988-1.008) 0.780
PD-L1 (опухоль) (высокий/низкий) 0.524 (0.235-1.167) 0.122 0.480 (0.150-1.406) 0.193
PD-L1 (строма) (высокий/низкий) 0.721 (0.316-1.644) 0.419 0.954 (0.332-2.564) 0.927
CD20 (высокий/низкий) 0.876 (0.393-1.953) 0.745 0.992 (0.965-1.016) 0.526
CD163 (высокий/низкий) 1.509 (0.677-3.361) 0.316 1.053 (1.007-1.098) 0.019*
PИ.1 (высокий/низкий) 0.654 (0.292-1.466) 0.319 0.991 (0.963-1.018) 0.497
* Статистически значимо.
блюдали положительную корреляцию между содержанием PИ.1+ клеток, макрофагов и В-клеток, а также PD-L1+ клеток в опухолевой строме, что согласуется с опубликованными данными.
Оценке содержания CD163+ макрофагов в опухолях желудка посвящено большое количество исследований, однако их результаты достаточно противоречивы. Экспрессия CD163 часто ассоциируется с неблагоприятным прогнозом при различных солидных опухолях [16]. Однако CD163 может быть маркером хорошего прогноза при опухолях желудочно-кишечного тракта, в частности при раке пищевода [17] и раке толстой кишки [18]. Согласно данным однофакторного анализа, повышенная
плотность CD163+ макрофагов в строме опухоли при РЖ ассоциирована с активацией иммунного ответа и улучшением выживаемости пациентов [19]. Опубликованы и противоположные результаты. По данным исследования 148 образцов опухолевой ткани высокая инфильтрация CD68+/CD163+ может быть маркером неблагоприятного прогноза [20]. Показано также, что повышенное содержание CD163+ клеток ассоциировано с большим размером и низкой дифференцировкой опухоли, метастазами в регионарных лимфоузлах. Более того, плотность CD163 повышалась с увеличением глубины инвазии, стадии заболевания и повышением экспрессии маркеров опухолевых стволовых клеток. Установлено
ТОМ 14 № 4 (55) 2022 | АСТА ЫАТИЙАЕ | 81
ри.1
CD163
CD20
100
и О
<и га т х
.о
ой
N
50
тл.
' низкий — высокий
100
—I-1-1-1
20 40 60 80 Время, месяцы
с о м е
га
в и
ы В
50
низкий 100
высокий ,
20 40 60 Время, месяцы
с о м е
га
в и
ы В
80
50
1
20 40 60 80 Время, месяцы
Рис. 5. Анализ общей выживаемости больных РЖ в зависимости от содержания Ри.1, CD163 и CD20 в строме опухолей
также, что повышенная экспрессия CD163 ассоциирована с рецидивированием заболевания [21, 22]. Полученные нами данные согласуются с результатами, согласно которым именно высокое содержание CD163+ клеток в опухолях является независимым маркером неблагоприятного прогноза при РЖ. Опубликованы также данные, согласно которым повышенная экспрессия CD163 характерна для PD-L1-положительного РЖ в сравнении с PD-L1-отрицательным [23]. Нами показано, что содержание CD163+ клеток в опухолевой строме положительно коррелирует с экспрессией PD-L1 в стромальных, но не в опухолевых клетках при РЖ.
На следующем этапе мы проанализировали содержание CD20+ клеток в строме опухолей больных РЖ. На неоднозначность влияния CD20 + В-лимфоцитов, присутствующих в опухолях разного типа, на прогноз выживаемости и стадию опухоли указывают результаты разных исследований [24]. Так, например, общее число CD20+ В-лимфоцитов ассоциировано с прогрессией рака молочной железы [25], при этом обратная корреляция показана при раке яичников, печени и толстой кишки [26-28]. Показано, что повышенное содержание CD20+ В-лимфоцитов в строме РЖ ассоциировано с лучшим прогнозом, однако не выявлено ассоциации между количеством В-лимфоцитов и клинико-морфологическими характеристиками опухоли [29]. Схожие результаты продемонстрировали и другие исследователи, показавшие, что более высокая плотность CD20+ В-клеток в строме ассоциирована с лучшим прогнозом. По результатам данного исследования показано также, что экспрессия CD20 ассоциирована с CD68 в опухолевой строме. Интересно, что некоторые иммунные клетки стромы экспрес-сировали Кь67, причем в основном это были CD20+ клетки. Более того, использование комбинации Кь 67+ и CD20+ показало лучший прогностический потенциал для РЖ [30]. Установленное нами отсутствие прогностической значимости CD20 при РЖ
свидетельствует о необходимости использования комбинаций маркеров для повышения эффективности прогнозирования клинического течения заболевания.
Прогностической значимости тканевой экспрессии PD-L1 в настоящее время посвящено около двух десятков исследований. Большинство работ свидетельствует о неблагоприятной прогностической значимости экспрессии данного белка в опухолевых клетках РЖ [31]. Однако некоторые результаты указывают на высокую экспрессию PD-L1 в опухолевых клетках как на маркер хорошего прогноза [32, 33]. Проведенное нами исследование продемонстрировало, что экспрессия PD-L1 в опухолевых клетках ассоциирована с более высокой общей выживаемостью пациентов, в то время как анализ экспрессии PD-L1 в стромальных клетках или его растворимой формы такой закономерности не выявил.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что маркеры стромальных клеток при злокачественных опухолях желудка потенциально могут использоваться для определения стратегии лечения и прогноза заболевания. Однако существующие методы, а именно одноцветная иммуногистохимия, не позволяют получить достаточно информативный ответ. Для того, чтобы эффективно использовать стромальные маркеры в случае РЖ, необходимо проведение комплексного анализа, включающего определение нескольких сывороточных маркеров и мультиплексный анализ нескольких маркеров опухолевой стромы.
Конфликт интересов: Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант № 20-015-00479).
0
0
0
0
0
0
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Bray F., Ferlay J., Soerjomataram I., Siegel R.L., Torre L.A., Jemal A. // CA Cancer J. Clin. 2018. V. 68. № 6. P. 394-424.
2. Gonzalez C.A., Sala N., Rokkas T. // Helicobacter. 2013. V. 18 Suppl 1. P. 34-38.
3. Nomura A., Grove J.S., Stemmermann G.N., Severson R.K. // Cancer Res. 1990. V. 50. № 21. P. 7084.
4. Brooks-Wilson A.R., Kaurah P., Suriano G., Leach S., Senz J., Grehan N., Butterfield Y.S., Jeyes J., Schinas J., Bacani J., et al. // J. Med. Genet. 2004. V. 41. № 7. P. 508-517.
5. Cunningham D., Starling N., Rao S., Iveson T., Nicolson M., Coxon F., Middleton G., Daniel F., Oates J., Norman A.R., et al. // N. Engl. J. Med. 2008. V. 358. № 1. P. 36-46.
6. Bang Y.J., van Cutsem E., Feyereislova A., Chung H.C., Shen L., Sawaki A., Lordick F., Ohtsu A., Omuro Y., Satoh T., et al. // Lancet. 2010. V. 376. № 9742. P. 687-697.
7. Wilke H., Muro K., van Cutsem E., Oh S.C., Bodoky G., Shi-mada Y., Hironaka S., Sugimoto N., Lipatov O., Kim T.Y., et al. // Lancet Oncol. 2014. V. 15. № 11. P. 1224-1235.
8. Zhang H., Yue R., Zhao P., Yu X., Li J., Ma G., Tang J., Zhang L., Feng L., Sun L., et al. // Tumour Biol. 2017. V. 39. № 6. P. 1010428317705747. doi: 10.1177/1010428317705747
9. Hu H.T., Ai X., Lu M., Song Z., Li H. // Exp. Cell. Res. 2019. V. 384. № 2. P. 111652.
10. Kovaleva O.V., Rashidova M.A., Samoilova D.V., Podlesnaya P.A., Mochalnikova V.V., Gratchev A. // Anal. Cell. Pathol. (Amst.). 2020. V. 2020. P. 5424780.
11. Xu Y., Gu S., Bi Y., Qi X., Yan Y., Lou M. // Oncol. Lett. 2018. V. 15. № 3. P. 3753-3759.
12. Lin J., Liu W., Luan T., Yuan L., Jiang W., Cai H., Yuan W., Wang Y., Zhang Q., Wang L. // Oncol. Lett. 2017. V. 14. № 6. P. 8220-8226.
13. Kovaleva O.V., Rashidova M.A., Samoilova D.V., Podlesnaya P.A., Mochalnikova V.V., Gratchev A.N. // Bull. Exp. Biol. Med. 2021. V. 170. № 4. P. 489-492.
14. Ковалева О.В., Грачев А.Н., Подлесная П.А., Рашидова М.А., Самойлова Д.В., Соколов Н.Ю., Мамедли З.З., Кудлай Д.А., Кушлинский Н.Е. // Клин. эксп. морфол. 2021. Т. 10. № 2. C. 32-39.
15. Huang J., Chen W., Jie Z., Jiang M. // Front. Oncol. 2022. V. 12. P. 820568.
16. Mantovani A., Sozzani S., Locati M., Allavena P., Sica A. // Trends Immunol. 2002. V. 23. № 11. P. 549-555.
17. Kovaleva O., Podlesnaya P., Rashidova M., Samoilova D., Petrenko A., Mochalnikova V., Kataev V., Khlopko Y., Plot-
nikov A., Gratchev A. // Biomedicines. 2021. V. 9. № 7. P. 743.
18. Koelzer V.H., Canonica K., Dawson H., Sokol L., Karamito-poulou-Diamantis E., Lugli A., Zlobec I. // Oncoimmunology.
2016. V. 5. № 4. P. e1106677.
19. Huang Y.K., Wang M., Sun Y., Di Costanzo N., Mitchell C., Achuthan A., Hamilton J.A., Busuttil R.A., Boussioutas A. // Nat. Commun. 2019. V. 10. № 1. P. 3928.
20. Svensson M.C., Svensson M., Nodin B., Borg D., Hedner C., Hjalmarsson C., Leandersson K., Jirstrom K. // J. Innate Immun. 2022. № 3. P. 1-14.
21. Zhu Q., Wu X., Tang M., Wu L. // Medicine (Baltimore). 2020. V. 99. № 17. P. e19839.
22. Zhang W.J., Zhou Z.H., Guo M., Yang L.Q., Xu Y.Y., Pang T.H., Gao S.T., Xu X.Y., Sun Q., Feng M., et al. // J. Cancer.
2017. V. 8. № 3. P. 363-370.
23. Harada K., Dong X., Estrella J.S., Correa A.M., Xu Y., Hof-stetter W.L., Sudo K., Onodera H., Suzuki K., Suzuki A., et al. // Gastric Cancer. 2018. V. 21. № 1. P. 31-40.
24. Sjoberg E., Frodin M., Lovrot J., Mezheyeuski A., Johansson M., Harmenberg U., Egevad L., Sandstrom P., Ostman A. // Br. J. Cancer. 2018. V. 119. № 7. P. 840-846.
25. Mahmoud S.M., Lee A.H., Paish E.C., Macmillan R.D., Ellis I.O., Green A.R. // Breast Cancer Res. Treat. 2012. V. 132. № 2. P. 545-553.
26. Shi J.Y., Gao Q., Wang Z.C., Zhou J., Wang X.Y., Min Z.H., Shi Y.H., Shi G.M., Ding Z.B., Ke A.W., et al. // Clin. Cancer Res. 2013. V. 19. № 21. P. 5994-6005.
27. Lundgren S., Berntsson J., Nodin B., Micke P., Jirstrom K. // J. Ovarian Res. 2016. V. 9. P. 21.
28. Berntsson J., Nodin B., Eberhard J., Micke P., Jirstrom K. // Int. J. Cancer. 2016. V. 139. № 5. P. 1129-1139.
29. Dong J., Li J., Liu S.M., Feng X.Y., Chen S., Chen Y.B., Zhang X.S. // Med. Oncol. 2013. V. 30. № 1. P. 442.
30. Meier A., Nekolla K., Hewitt L.C., Earle S., Yoshikawa T., Oshima T., Miyagi Y., Huss R., Schmidt G., Grabsch H.I. // J. Pathol. Clin. Res. 2020. V. 6. № 4. P. 273-282.
31. Gu L., Chen M., Guo D., Zhu H., Zhang W., Pan J., Zhong X., Li X., Qian H., Wang X. // PLoS One. 2017. V. 12. № 8. P. e0182692.
32. Kim J.W., Nam K.H., Ahn S.H., Park D.J., Kim H.H., Kim S.H., Chang H., Lee J.O., Kim Y.J., Lee H.S., et al. // Gastric Cancer. 2016. V. 19. № 1. P. 42-52.
33. Boger C., Behrens H.M., Mathiak M., Kruger S., Kalthoff H., Rocken C. // Oncotarget. 2016. V. 7. № 17. P. 24269-24283.
