CC BY
78
УДК 576.3:6l018.46:6l6-089.28]-001.6
КОМПЛЕКСНАЯ ОЦЕНКА РАЗВИТИЯ ГЕПАТОЦИТОВ В ПОРИСТО-ПРОНИЦАЕМЫХ ИНКУБАТОРАХ ИЗ НИКЕЛИДА ТИТАНА
О.В. Кокорев1, В.Н. Ходоренко1, Г.Ц. Дамбаев2, С.Г. Аникеев3, В.Э. Гюнтер1
1НИИ медицинских материалов и имплантатов с памятью формы СФТИ при ТГУ, Томск 2ГБОУ ВПО "Сибирский государственный медицинский университет" Минздравсоцразвития России, Томск Национальный исследовательский Томский государственный университет E-mail: kokorevov@yandex.ru
COMPLEX RESEARCH OF GEPATOCYTES DEVELOPMENT IN POROUS-PERMEABLE TINI-BASED INCUBATORS
О-V. Kokorev1, V.N. Hodorenko1, G.Ts. Dambaev2, S.G. Anikeev3, V.E. Gunther1
Research Institute of Medical Materials and Shape Memory Implants, Tomsk 2Siberian State Medical University, Tomsk 3Tomsk State University
Проведен комплексный анализ развития клеток печени - гепатоцитов - в биосовместимом инкубаторе, изготовленном из высокопористого никелида титана. В работе показаны особенности развития клеточного материала внутри пор инкубатора. Установлено поэтапное развитие гепатоцитов в пористо-проницаемой структуре инкубатора из никелида титана. Развитая шероховатая поверхность пор инкубатора создает условия для закрепления и роста печеночных колоний, а пористо-проницаемая структура инкубатора обеспечивает проникновение питательных веществ из внешней среды. Исследование на патофизиологической модели хлориндуцированного гепатита показало эффективное антитоксическое действие популяции гепатоцитов в инкубаторах из пористого ни-келида титана и их пролонгированный эффект.
Ключевые слова: скаффолд, гепатоцит, никелид титана, пористый инкубатор из никелида титана.
Complex analysis of development of cells of liver - hepatocytes in the biocompatible scaffold, fabricated of high-porous nickelid titanium has been performed. Specific stages of development of cellular population in the row of incubator are displayed in the present investigation. The stepwise characteristic of developing of hepatocytes in porous-permeable structure from nickelid titanium is demonstrated. Rough surface of pores in incubator permit cells to be reliably fixed and produce growth to cellular colonies, and porous-permeable structure of incubator allows penetrating to nutrients from environment during all time of investigation in vivo. Examination on pathophysiological model CCl4-induced hepatitis has displayed effective antitoxic activity of population of hepatocytes in incubators from porous nic4kelid titanium and their prolonged effect.
Key words: scaffold, hepatocyte, titanium-nickel, porous incubator from titanium-nickel.
Введение
Понятие “биосовместимость” в последние годы изменило акцент и включает в себя две основные особенности. Первая - принцип “биобезопасности” - заключается в эффектах воздействия биоматериала на организм и включает такие понятия, как цитотоксичность и различные осложнения, как мутагенез и канцерогенез. Вторая особенность - “биофункциональность” - аспект, говорящий о дееспособности и биомеханике материала при специфическом его функционировании.
Факт, что клетки in vivo не существуют изолированно, а поддерживают связь с тканями, делает этот принцип основным при выборе объемных биоматериалов для замены тканей и органов. Этот принцип задает многочисленные критерии и параметры как для структуры объемных биоматериалов, так и для способов культивирования и методов изучения клеточного взаимодействия по сравнению с ранее существующей методологией изолированных клеток, выращенных в монослое или подвесной культуре [10, 14].
Первые технологии проектирования и внесения в организм чужеродных клеток связаны с инкапсулированием клеток. Эта технология имела определенный успех в тех заболеваниях, в которых потеряна функция клеток в специализированной дифференцированной ткани, а также когда была повреждена или утрачена железа - этот наиболее специализированный и компактный орган человека. Принцип применения этого биоматериала основан на использовании синтетической мембраны с избирательной проницаемостью, включающей живые клетки, которые обеспечивают замену функции железы. При этом мембрана должна позволять обмен газами, питательными веществами и метаболитами и препятствовать тому, чтобы иммунная система не сработала против пересаженных клеток. Для компенсации функции всей железы необходимо небольшое количество здоровых клеток [8].
Многие исследователи моделируют различные ткани с применением послойной технологии, т.е. сложное строение ткани воспроизводится накладкой друг на друга определенных клеточных монослоев на пророщенном
плоском листе из биоматериала [7, 9]. Данный способ хотя и воспроизводит многослойные ткани, но при внесении в организм необходимо создать капиллярную сеть для снабжения ткани кислородом и питательными веществами в глубинных слоях.
Одна из главных задач в создании гибридных органов - это симуляция интеграции тканей. A.W. Kim и со-авт. [9] предложили технику построения пространственных (3D) нетекстурированных биоматериалов, которые исключительно точно имитируют межклеточный пространственный рельеф. Изготовлением пространственной модели занимается аппарат, аналогичный принтеру, который наносит заведомо нужные полимерные композиции совместно с клетками. Как результат, получается нетекстурированный материал необходимой конфигурации.
Многочисленные работы посвящены выращиванию различных клеток на уже готовых 3D-матрицах - скаф-фолдах (в настоящее время имеются готовые коммерческие продукты) [3-6, 9, 12]. Они различаются по своему составу, структуре, рельефу поверхности, времени деградации и т.д. Среди известных технологий выделяют волокнистые скаффолды, содержащие в своем составе различные типы волокон и потому имеющие большее сходство с натуральными тканями.
Использование клеточных технологий связано с выращиванием р-клеток при сахарном диабете, гепатоци-тов - при печеночной недостаточности и нейросекре-тирующих клеток - при неврологических заболеваниях [8]. Следует заметить, что ежегодные потребности в донорской печени только в США составляют более 25 тыс., а ограниченный источник поставки делает трансплантацию доступной только для нескольких сотен пациентов. В этой связи лечение, основанное на инжиниринге тканей, представляется весьма перспективным. Поскольку печень имеет большой потенциал для самовосстановления, то использование устройства “стимуляции печени”, предоставляющее время для регенерации нормальной печеночной ткани, может спасти тысячи жизней ежегодно и оказаться высокоэффективным [1]. На данный момент существуют три тканеинженерных подхода для замещения функции печени:
1) трансплантация гепатоцитов путем прямой инъекции;
2) выращивание гепатоцитов на каркасах (скаффолдах) или использование пористых бус из полимеров, коллагена, пророщенных гепатоцитами, которые можно трансплантировать;
3) использование систем для удаления продуктов обмена веществ путем отвода части крови и пропускания ее через устройство (биореактор), содержащее гепа-тоциты.
Основная проблема при указанных видах лечения -поддержание сложных, многочисленных биологических функций гепатоцитов, связанных с предоставлением достаточного времени для того, чтобы дать собственной печени возможность регенерировать [1].
Наиболее перспективным для использования в качестве материала инкубатора-носителя клеточных культур является пористый проницаемый материал из никелида титана. Созданные в НИИ медицинских материалов и
имплантатов с памятью формы (Томск) пористо-проницаемые материалы на основе никелида титана обладают уникальными свойствами: имеют открытую пористо-проницаемую структуру, обладают высокой степенью смачиваемости тканевыми жидкостями, отвечают требованиям биомеханической и биохимической совместимости с тканями организма [3]. Изготовленные из таких материалов имплантаты характеризуются набором свойств, необходимых для их использования в качестве инкубаторов-носителей клеточных культур различных органов [2,
3].
В настоящее время в связи с появлением большого количества биоматериалов и для ускорения их тестирования, уменьшения количества экспериментов на животных, а также модернизации методов in vitro, предложен ряд новых тестов. Специально разработаны клеточные технологии исследования биосовместимости, предназначенные для тестирования медицинских имплантатов, которые соответствуют тестам и стандартам Международной организации по стандартизации [8, 11].
Данное исследование посвящено анализу развития клеток печени - гепатоцитов - после их имплантации в поровое пространство инкубатора, изготовленного из пористого никелида титана, и последующей их диффе-ренцировки и развития клеток in vivo. Также проанализировано функциональное состояние гибридной печени на патофизиологической модели токсического гепатита.
Материал и методы
Исследования проведены на образцах инкубаторов из пористо-проницаемого никелида титана, полученного методом самораспространяющегося высокотемпературного синтеза (СВС). Инкубаторы изготавливались элект-роэрозионным способом из медицинского сплава ТН-10. Перед испытанием инкубаторы выдерживали при t=180 °С в течение 60 мин в сухожаровом шкафу. Топографию поверхности образцов и структуру порового пространства изучали, используя инвертированный металлографический световой микроскоп Axiowert 40MAT и растровый электронный микроскоп Quanta 200 3D. Фазовый состав поверхности определяли с помощью локального микрорентгеноспектрального анализа.
В качестве клеточного материала использовали печеночные клетки крыс Vistar (получены из питомника экспериментальных животных ФГБУ “НИИ фармакологии” СО РАМН, Томск). Гепатоциты выделяли по методу Seglen P.O. с некоторыми модификациями [13]. В стерильных условиях разрезали брюшную полость крысы и перфу-зировали печень раствором ЭДТА (0,15 M NHjCl, 1 mM KHCO3, 0,1 mM NasEDTA, pH 7,2-7,4) в течение 7-10 мин. Затем отмытую от крови и измельченную на кусочки 1-2 мм печень помещали в раствор коллагеназы, содержащий 5 mM CaCl2, 80 U/ml коллагеназы IV, 0,8 mM MgCÜ, 20 mM HEPES, pH 7,4 при t=37 °С на 30-40 мин, используя перемешивающий аппарат. Далее клеточную суспензию центрифугировали 5 мин (со скоростью 450 g, 4 °С), супернатант собирали и еще вновь центрифугировали 2 раза со сменой среды по 10 мин (680 g, 4 °С). Затем пропуска-
ли через фильтр размером 100 мкм для удаления крупных частиц и ресуспендировали в культуральной среде, содержащей среды DMEM-F12 (“Sigma”, РФ), 10%-й эмбриональной телячьей сыворотки (“HyClone”, США), ген-тамицин 40 мкг/мл (“ПанЭко”, РФ), глутамин 250мг/л (“ПанЭко”, РФ), 0,2 ммоль/л фосфата аскорбиновой кислоты (Sigma), 107 моль/л дексаметазона (“Sigma”), 20 нг/ мл EGF (эпидермальный фактор роста; Sigma) и 5 мл ITS+ (6,25 мг/мл инсулина, 6,25 мг/мл трансферина, 6,25 нг/ мл селенита, 1,25 мг/мл BSA, и 5,35 мг/мл линолиевой кислоты “Sigma”). Изолированные клетки засевали на инкубаторы из никелида титана в конечной концентрации 125х106/мл. Инкубаторы с клетками содержали при 37 °С и 98% влажности с 5% СО2 в течение суток и затем под эфирным наркозом имплантировали в брюшную полость крыс. Раны послойно зашивали. Образцы на исследование отбирали через каждые 7 сут. Экспериментальные исследования выполнены в соответствии с “Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей”, согласно “Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных” (приказ МЗ СССР № 755 от 12.08.1987 г.) и с Федеральным законом о защите животных от жестокого обращения от 01.01.1997 г., а также Директивой 86/609 ЕЭС, основанной на тексте соглашения “Dr. Robert Hubrecht, Current EU Legislation Controlling Animal Experiments”.
Сканирующая электронная микроскопия. Тонкие секции образцов фиксировали в 2,5%-м глютаральдегиде (SIGMA) в течение 1 ч. Затем промывали 3 раза в PBS (15 мин каждый) и далее фиксировали 1 ч в 1%-м тетраоксиде осмия (SIGMA). После этого вновь промывали 3 раза в PBS и затем дегидратировали, пропуская через ряд растворов (30, 50, 70, 90 и 100%) этанола, по 15 мин - в каждом. Дегидратированные образцы высушивали, после чего каждый образец инкубатора исследовался на растровом электронном микроскопе. В работе представлены микрофотографии внутренней поверхности инкубатора.
Гепатоциты крыс Vistar в суспензии засевали на 2 вида инкубаторов. Один инкубатор состоял из 5 изолирован-
А
Рис. 1. Структура пористого проницаемого инкубатора из
ных пористых пластин никелида титана (5х5х1 мм) - К1; второй - из объемного пористого никелида титана (5х5х5 мм) - К2. Культивирование продолжалось 24 ч, и затем конструкции под эфирным наркозом вшивали животным внутрибрюшинно. Предварительно мышам в течение недели внутрижелудочно вводили СС14 в дозе 50 мг/кг в масляном растворе. Биохимические ферменты исследовали в течение 1,5 мес. с интервалом в 2 недели.
Соответственно, экспериментальные животные были разделены на 4 группы:
1) контроль - интактные (здоровые) животные;
2) СС14 - животные с токсическим гепатитом, вызванным введением СС14;
3) СС14+К1 - животные с введением СС14 и имплантированными 5 плоскими пластинами с гепатоцитами;
4) СС14+К2 - животные с введением СС14 и имплантиро-ван4ным объемным пористым инкуба4тором с гепато-цитами.
Биохимическиеметоды оценки. Активность аланина-минотрансфераз, аспартатаминотрансфераз и щелочной фосфатазы исследовали кинетическим УФ-методом наборами “НегЬсв Diagnostika” (Хорватия).
Статистическая обработка выполнялась с использованием пакета статистических компьютерных программ 5ТАТ15Т1СА 6. По данным проверки критерием Колмогорова-Смирнова, закон распределения числовых показателей отличался от нормального, поэтому различия изучаемых признаков проверяли при помощи непараметрического и-критерия Манна-Уитни (попарные сравнения независимых совокупностей показателей). За статистически значимое принималось значение р<0,05.
Результаты и обсуждение
Структура клеточного инкубатора из пористо-проницаемого никелида титана представляет собой трехмерное поровое пространство, морфологическое строение которого типично для высокопористых материалов, полученных с участием жидкой фазы. Пористый материал
Б
титана: А - макроструктура; Б - микроструктура стенок пор
имеет большую удельную поверхность, обусловленную наличием в нем системы открытых и взаимосвязанных пор (рис. 1 А). За счет открытых пор (более 90%) и гидрофильной поверхности материал обладает высокой степенью проницаемости, что обусловлено самим способом получения пористого материала - методом СВС [2, 4, 6]. Стенки пор имеют рельефную и шероховато-нанопори-стую поверхность (рис. 1 Б).
Основные структурные характеристики пористого материала - пористость, средний размер пор и распределение пор по размерам. Применяя различные схемы метода СВС - меняя температурные режимы самого процесса, а также исходные параметры порошков, можно получить различный по структуре пористо-проницаемый материал с определенным размером пор и заданным распределением пор по размерам, а также, что особенно важно в клеточной и тканевой инженерии, с определенной
140
сГ УКМ
Рис. 2. Гистограмма распределения пор по размерам для образцов со средними размерами пор 150 мкм
топографией и состоянием поверхности порового пространства. Таким образом, в данном материале имеется широкий диапазон состояний пористой и поверхностной структуры, пригодной для культивирования тех или иных тканей организма. Топография поверхности образцов и порового пространства материала матрицы нике-лида титана имеет пористую (пористость 70%) неупорядоченную структуру с размером пор в диапазоне 0,1-1000 мкм и распределением пор по размерам, представленным на рисунке 2.
В нашем эксперименте в полученной суспензии жизнеспособность гепатоцитов, определяемая согласно 180 10993-5 по исключению окрашивания в тесте с 0,4%-м трипановым синим, составила 85-88%. При культивировании на пластике в течение 7-8 сут. клетки проявляли типичную морфологию гепатоцитов с признаками деления (рис. 3 на 3-й стр. обложки).
С увеличением срока исследования (более 8 сут) значительно повышалась оптическая плотность распределения клеток на локальных областях поверхности. Однако средняя площадь значимо уменьшалась (на 31%; р<0,001), рост приобретал очаговый характер, затем культура утрачивала способность к размножению и деградировала.
Структурные исследования на растровом электронном микроскопе показали хорошую адгезию и размножение гепатоцитов на поверхности внутрипорового пространства инкубатора по мере роста гепатоцитов в пористом инкубаторе из никелида титана по истечении 7 сут (рис. 4 А). Также наблюдали множественную интеграцию групп клеток в поровом пространстве и этапы синтеза волокон межклеточного веществе (рис. 4 Б).
Необходимо подчеркнуть, что наилучшее прикрепление и развитие клеток наблюдалось на развитой шероховатой поверхности пор, содержащих наносруктурные поры диаметром 1-3 мкм. Известно, что взрослая ткань содержит межклеточный матрикс, содержащий коллоидный и волокнистый компоненты. Установлено, что через
А Б
Рис. 4. Прикрепление и размножение гепатоцитов на поверхности порового пространства инкубатора (7 сут)
А Б
Рис. 5. Размножение клеток и синтез волокон межклеточного вещества, стадия быстрого заполнения пор клеточной популяцией (14-е сут)
А Б
Рис. 6. Окончательный этап полного заполнения тканями пор инкубатора. А - этап активного заполнения порового пространства (21-е сут); Б - ткань в порах всего периметра инкубатора (28-е сут)
2 недели происходило дальнейшее развитие популяции гепатоцитов, большинство клеток выпячивали плазматическую мембрану и формировали межклеточные соединения, наблюдались области скопления клеток с ново-синтезированной сетчатой структурой межклеточного вещества (рис. 5).
Дальнейший детальный анализ взаимодействия гепа-тоцитов с внутренней поверхностью пористого инкубатора из никелида титана показал, что на 21-е сутки размножение и синтез межклеточного матрикса усиливались (рис. 6 А).
Увеличение роста шло за счет достижения необходимого критического уровня клеточной массы и соответ-
ствующего повышения градиента концентрации ростовых и питательных факторов в трехмерном объеме пор. Ткань постепенно выстилала внутреннюю поверхность пор и заполняла все поровое пространство. К 28-м суткам поры инкубатора оказывались заполненными тканью на 80% (рис. 6 Б).
Таким образом, на основании проведенных исследований можно сделать вывод, что инкубатор из пористого проницаемого никелида титана биосовместим с клетками печени - гепатоцитами. Клетки активно прикрепляются, растут, размножаются и формируют соответствующую ткань в аллогенном окружении.
Также была проведена серия исследований по изуче-
Таблица 1
Показатели ферментов (Е/л) у крыс Vistar с СЫ4-индуцированным гепатитом после имплантации пористых носителей из никелида титана с аллогенными гепатоцитами в течение 1,5 мес.
Срок
Группы животных (n=10)
инкубации Контроль СС|4 CCl4+K1 CCl4+K2
АСТ АЛТ ЩФ АСТ АЛТ ЩФ АСТ АЛТ ЩФ АСТ АЛТ ЩФ
15 сут 45+9 30+4 94+9 96+18 58+14 168+16 48+11 36+6 124+21 59+10p2 42+5р1, р2 129+20Р1, Р2
30 сут 44+6 35±5 109+12 82+17 54+15 152+11 67+12 52+7 144+15 50+10р2 Рз 116+12Р2, Р3
45 сут 48+6 32+4 101+12 85+12 46+9 154+12 88+14 49+10 148+12 54+8р2, Рз 30+5р2, Рз 112+14Р2, Р3
Примечание: р р р3<0,05 - уровень статистически значимых различий с группой "контроль”, "СС!" и "CCI.+K1” соответственно.
нию функциональной характеристики гибридной печени с применением патофизиологической модели хлорин-дуцированного гепатита. Развитие острого СС14-индуци-рованного гепатита сопровождается появлением очагов некроза, локализованных центролобулярно, дистрофии гепатоцитов и - в дальнейшем - всей печени. При этом наблюдается увеличение ферментов аспартаттрансфера-зы (АСТ), алланинтрансферазы (АЛТ) и щелочной фос-фатазы (ЩФ) (табл. 1).
Отмечено, что продолжительность жизни в течение 1,5 мес. в контрольной группе и в группе с индуцированным токсическим гепатитом составила 20%. В группе животных с имплантированными пластинами продолжительность жизни не имела статистически значимых различий с контрольной группой и составила 30%. Наиболее эффективными оказались объемные инкубаторы: при сходных условиях эксперимента в группе, где были имплантированы такие инкубаторы, продолжительность жизни оказалась максимальной - 90%. При введении хлористого углерода (группа CC14) наблюдали резкое повышение активности всех исследуемых ферментов. В группе, где гепатоциты имплантировались на пластинах из ни-келида титана, декомпенсация хлориндуцированного гепатита составила не более двух недель. В то же время в опытной группе активность печеночных ферментов оказалась равной или ниже, чем в группе здоровых животных в течение всего периода исследований (таблица). Эти данные косвенно подтверждали большую эффективность объемных пористых конструкций в развитии и сохранении функциональных клеток печени по сравнению с плоскими конструкциями или введением клеток без подложек. Это, соответственно, и служит доказательством более пролонгированного терапевтического действия, оказываемого объемными пористо-проницаемыми инкубаторами.
Заключение
Пространственная конфигурация инкубатора из ни-келида титана оказывает биомеханическое формообразующее влияние на морфофункциональные особенности культивируемых клеток, обеспечивая динамическое напряжение цитоскелета и пространственно-временную ориентацию клеток. Адгезируясь к трехмерной матрице инкубатора, гепатоциты претерпевают серию трансформаций, в ходе которых появляется трехмерная конфигурация будущей ткани с межклеточными волокнами и мат-
риксом.
Положительное влияние матрицы из никелида титана на изменение функциональной активности клеток не вызывает сомнений. Она позволяет клеткам печени прикрепляться к поверхности, размножаться, синтезировать межклеточный матрикс и строить пространственно-функциональное подобие печеночной ткани. При этом функциональная характеристика гибридной тканеинженерной конструкции на примере хлориндуцированного гепатита доказывает работоспособность печеночной ткани, развивающейся внутри 3D-пористого инкубатора из никелида титана.
Подобная технология может иметь фундаментальное значение, связанное с изучением механизмов модификации морфофункциональных свойств клеток в скаффол-дах, а также и практический выход, позволяющий наращивать массу дифференцированных клеток посредством технологии “биореактор in vivo” для заместительной терапии.
Литература
1. Бенч Л., Джонс Д. Биоматериалы, искусственные органы и инжиниринг тканей. - М. : Техносфера, 2007. - 304 с.
2. Кокорев О.В., Дамбаев ГЦ., Ходоренко В.Н. и др. Применение пористо-проницаемых инкубаторов из никелида титана в качестве носителей клеточных культур // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2010. - Т. 5, № 4. - С. 31-37.
3. Материалы с памятью формы и новые медицинские технологии / под ред. В.Э. Гюнтера. - Томск : Изд-во “НПП МИЦ”, 2010. - 360 с.
4. Bettinger C.J., Weinberg E.J., Kulig K.M. et al. Three-dimensional microfluidic tissue-engineering scaffolds using a flexible biodegradable polymer // Advanced Materials. - 2005, December 8. - [Vol.] 18 (2). - P. 165-169.
5. Bettinger C.J., Kulig K.M., Vacanti J.P et al. Nanofabricated collagen-inspired synthetic elastomers for primary rat hepatocyte culture// Tissue Engineering. Part A. - 2009, June, 15 (6). - P 1321-1329.
6. Dehai L., Hsiao S.B., Chu B. Functional electrospun nanofibrous scaffolds for biomedical applications // Advanced Drug. Deliv. Rev. - 2007, December 10. - [Vol.] 59 (14). -P. 1392-1412.
7. Jae H.P, Bong G.C., Won G.L. et al. Microporous cell-laden hydrogels for engineered tissue constructs // Biotechnology and Bioengineering. - 2010, May 1. - [Vol.] 106 (1). - P. 138-148.
8. Kirkpatrick C.J., Bittinger F, Wagner M., et al. Current trends in biocompatibility testing // Proceed. Inst. Mechanic. Engin., Part H: J. Engin. Med. - 1998. - P. 212-275.
9. Woodrow K.A., Wood M.J., Saucier-Sawyer J.K. et al. Biodegradable meshes printed with extracellular matrix proteins support micropatterned hepatocyte cultures // Tissue engineering: Part A. - 2009. - Vol. 15, No. 5. - P 1169-1179.
10. Freed L.E., Engelmayr G.C.Jr., Borenstein J.T. et al. Advanced material strategies for tissue engineering scaffold // Advanced Materials. - 2009, September, 21. - Vol. 32-33. - P 3410- 3418.
11. Bokhari M., Carnachan R.J., Cameron N.R. et al. Culture of HepG2 liver cells on three dimensional polystyrene scaffolds enhances cell structure and during toxicological challenge // J. Anatom. - 2007. - No. 21. - P. 567-576.
12. Dvir-Ginzberg M., Elkayam T, Cohen S. Induced differentiation and maturation of newborn liver cells into functional hepatic tissue in macroporous alginate scaffolds // FASEB Journal. -2008. - Vol. 22. - P. 1440-1449.
13. Seglen P.O. Effects of anaerobiosis, glucose, insulin and glucagons on glycogen metabolism in isolated parenchymal rat liver cells // FEBS Letters. - 1973. - Vol. 36. - P. 309-312.
14. Tabata Y. Biomaterial technology for tissue engineering applications // J. Royal Society Interface. - 2009. - No. 4. -P. 311-324.
Поступила 07.11.2011
