CC BY
27
DOI: 10.23868/202011016
КОМПЛЕКСНАЯ ОЦЕНКА МЕХАНИЗМА ДЕЙСТВИЯ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК В РАЗРАБОТКЕ ГЕН-АКТИВИРОВАННЫХ МАТЕРИАЛОВ
Поступила: 25.03.2020 Принята к печати: 05.05.2020 Опубликована on-line: 01.12.2020
И.Я. Бозо1-3, М.О. Мавликеев2' 4, А.А. Титова2' 5, А.И. Билялов5, Ф.А. Индейкин6, А.В. Пулин2, И.И. Еремин2, В.С. Комлев7, А.А. Исаев8, Р.В. Деев4 8
1 ООО «Гистографт», Москва, Россия
2 Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии, Москва, Россия
3 Федеральный медицинский биофизический центр им. А.И. Бурназяна ФМБА России, Москва, Россия
4 Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова, Санкт-Петербург, Россия
5 Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия
6 Казанский государственный медицинский университет, Казань, Россия
7 Институт металлургии и материаловедения РАН им. А.А. Байкова, Москва, Россия
8 ПАО «Институт Стволовых Клеток Человека», Москва, Россия
COMPLEX ASSESSMENT OF A PLASMID DNA MECHANISM OF ACTION IN DEVELOPMENT OF GENE-ACTIVATED MATERIALS
I.Y. Bozo1-3, M.O. Mavlikeev2 4, A.A. Titova2, 5, A.I. Bilyalov5, F.A. Indeykin6, A.A. Pulin2, I.I. Eremin2, V.S. Komlev7, A.A. Isaev8, R.V. Deev4, 8
1 Histograft, LLC, Moscow, Russia
2 Research Institute of General Pathology and Pathophysiology, Moscow, Russia
3 A.I. Burnazyana Federal Medical Biophysical Center, FMBA of Russia, Moscow, Russia
4 I.I. Mechnikov North-Western State Medical University, Saint Petersburg, Russia
5 Kazan (Volga Region) Federal University, Kazan, Russia
6 Kazan Federal Medical University, Kazan, Russia
7 AA. Baikov Institute of Metallurgy and Materials Science, Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia
8 Institute of Human Stem Cells, PJSC, Moscow, Russia
e-mail: [email protected]
Количество исследований в области ген-активированных материалов ежегодно увеличивается, первое изделие данного класса уже внедрено в клиническую практику для костной пластики. Учитывая специфический механизм действия ген-активированных материалов, обусловленный входящими в их состав генными конструкциями, актуализируется потребность в стандартизации методов исследований, которые позволяют охарактеризовать реализацию всех этапов биологического действия in vivo.
В настоящей работе на примере ген-активированного гидрогеля, состоящего из коллагена I типа и плазмидной ДНК с геном сосудистого эндотелиального фактора роста [VEGF165), различными методами была подтверждена реализация механизма действия плазмидной ДНК. Для этого использована флуоресцентная метка Cy3, репортерная плазмидная ДНК с геном люциферазы светлячнов (Luc), ПЦР-РВ и ИФА, иммуногисто-химическое исследование с антителами к CD31. Результаты сопоставлены с данными других научных работ, сформулированы рекомендации по составу минимально необходимого перечня исследований для разработки ген-активированных материалов.
Ключевые слова: ген-активированный материал, гидрогель, плазмидная ДНК, Cy3 метка, люцифераза, VEGF.
The number of studies related with gene-activated matrices is increasing annually; the first-in-class product has been already implemented into clinical practice for bone grafting indications. Considering specificity of the gene-activated matrices mechanism of action determined by gene constructs, there is a demand to standardize the methods allowing to characterize all the stages of biological action in vivo.
Here, using on the example of a gene-activated hydrogel consisting of type I collagen and plasmid DNA with the vascular endothelial growth factor gene (VEGF165), the main steps of the plasmid DNA mechanism of action were confirmed by various methods. For this, a fluorescent Cy3, reporter plasmid DNA with the firefly luciferase gene (Luc), RT-PCR and ELISA, immunohistochemical study with antibodies to CD31 were used. The results were compared with the other scientific papers, some recommendations were formulated to determine a minimally required list of studies for the development of gene-activated materials.
Keywords: gene-activated matrix, hydrogel, plasmid DNA, Cy3, luciferase, VEGF.
Введение
Разработка ген-активированных материалов — это перспективное биомедицинское направление, объединяющее достижения биоматериаловедения и генной терапии в интересах регенеративной медицины. Основные эффекты ген-активированных материалов обусловлены действием входящих в их состав генных конструкций, размещенных на поверхности и (или) в структуре био-резорбируемого матрикса-носителя [1-3].
Генные конструкции — представляют собой фрагменты нуклеиновых кислот (ДНК или РНК), заключенные в вирусные или невирусные векторы и в большинстве случаев кодирующие терапевтические белки [4]. Попав
в клетку, генные конструкции перемещаются в ядро, где в течение определенного времени экспрессируются и транслируются с продукцией белка, кодируемого конструкцией. Белок, в свою очередь, обеспечивает целевой биологический эффект. Таким образом, трансфициро-ванные клетки в течение некоторого периода времени продуцируют молекулы белка. Так, сосудистый эндотели-альный фактор роста (УБЭР), индуцирует ангиогенез [5]. Повышение уровня его продукции за счет плазмидной ДНК, несущей ген УЕЗЁ (рОЫА-УЕЗЕ), востребовано в регенеративной медицине и уже внедрено в клиническую практику в виде геннотерапевтического лекарственного препарата «Неоваскулген» (Институт Стволовых
Клеток Человека, Россия) [6] и ген-активированного осте-опластического материала «Гистографт» (Гистографт, Россия, РУ № РЗН 2019/8310) [7].
В зависимости от типа вектора, доставленная нукле-отидная последовательность может сохраняться в ядре лишь некоторое время, а затем элиминируется, что обеспечивает временность эффекта, либо может интегрироваться в геном с перманентным изменением секретома клетки [8]. Наиболее безопасным вариантом генных конструкций является плазмидная ДНК, кольцевая отрицательно-заряженная молекула, которая не интегрируются в геном и не обладает антигенной активностью. Предполагается, что ее поступление в клетки происходит по механизму эндоцитоза, однако естественная активность этого процесса низкая, в связи с чем в клетки поступает менее 1% молекул голой плазмидной ДНК от общей концентрации. Это ограничение предопределяет высокую активность исследований, направленных на повышение доставки плазмидной ДНК химическими и (или) физическими методами [9].
Биорезорбируемый матрикс-носитель — важная составляющая ген-активированного материала. В зависимости от показания к применению, он способен выполнять не только функцию доставки генных конструкций, но и оказывать влияние на репаративную регенерацию тканей. Дополнительным предназначением матрикса-носителя может служить потенцирование эффекта генных конструкций за счет пролонгации их действия, защиты от разрушения ферментами и усиления поступления в клетки-мишени [10].
После имплантации ген-активированного материала in vivo, оба компонента изделия реализуют свое действие — разворачивается следующая последовательность событий: высвобождение генных конструкций (в том числе при постепенной биодеградации матрикса-носителя), поступление в клетки реципиентного ложа, экспрессия ими с продукцией терапевтического белка, обеспечивающего биологический эффект, вовлеченный в регуляцию репаративной регенерации тканей [11]. Матрикс-носитель при этом направляет образующиеся ткани, механически восполняет зону дефекта. Таким образом, механизм действия ген-активированных материалов специфичен и сложен, отличает их от изделий других классов в рамках регенеративной медицины — тканеинженерных конструкций и материалов с факторами роста [4].
В связи с этим, разработка ген-активированных материалов с целью их дальнейшего внедрения в клиническую практику требует применения специализированных методов исследований, направленных на оценку реализации каждого из вышеприведенных этапов механизма действия. Варианты таких исследований многочисленны, а минимальный, но достаточный их перечень не принят профильными научными сообществами, стандартизированные программы исследований ген-активированных материалов отсутствуют. Однако с ростом числа разработок медицинских изделий на основе ген-активированных материалов, с появлением первых прецедентов клинического применения [12, 13] и внедрения [7] потребность в такой программе неизбежно возникнет. По этой причине, целью работы стала оценка информативности различных методов исследований, использующихся для оценки отдельных этапов механизма действия плазмидной ДНК ген-активированных материалов, для формирования рекомендаций по рациональному и достаточному набору исследований, позволяющих подтвердить биологическое действия изделий этого
класса. В качестве примера ген-активированного материала в работе был использован гидрогель на основе коллагена I типа с pDNA-VEGF.
Материал и методы
Ген-активированный материал
Для изготовления ген-активированного материала использовали коллагеновый гидрогель («Коллост», Ниармедик, Россия) и сверхскрученную голую pDNA-VEGF — действующее вещество лекарственного препарата «Неоваскулген». Для отдельных этапов исследования вместо pDNA-VEGF использовали репор-терную плазмидную ДНК, несущую ген люциферазы (Luc) светлячков (pC4W-GL3). Препарат растворяли в воде для инъекций с получением раствора концентрацией 1,5 мкг/мкл, затем непосредственно перед использованием в экспериментах смешивали с коллагеновым гидрогелем. Концентрация плазмидной ДНК в составе ген-активированного материала для отдельных исследований варьировалась.
Оценка высвобождения плазмидной ДНК
из коллагенового гидрогеля in vivo
Установка флуоресцентной метки на плазмидную ДНК. Для детекции локализации плазмидной ДНК после введения in vivo использовали набор для мечения плазмидной ДНК Label IT® Tracker (Mirus, США), который обеспечивает прямое ковалентное прикрепление флуоресцентной метки Cy3 к остаткам гуанина плазмидной ДНК без резкого изменения исходной ДНК. Для приготовления рабочего раствора в эппендорфе смешивали 314,84 мкл стерильной воды, свободной от РНКаз и ДНКаз (ThermoScientific, США), 32,5 мкл pC4W-GL3 (концентрация плазмины 1 мкг/мкл), 32,5 мкл 10Х Buffer и 8,125 мкл Label IT. Полученную смесь инкубировали при 37 °С в течение 60 мин. Через 30 мин. инкубации центрифугировали в течении 30 сек. на низких оборотах. После инкубации добавляли 38,8 мкл 5M NaCl и 775,93 мкл 100% этанола. Затем рабочий раствор инкубировали 30 мин. при -20 °С. Далее раствор центрифугировали при 14 000g в течение 30 мин. при +4 °С. Затем надосадочную жидкость удаляли, а к осадку добавляли 70% этанол и центрифугировали, используя те же параметры еще 30 минут. После центрифугирования удаляли надосадочную жидкость, а осадок ресу-спензировали в 21,67 мкл стерильной воды, свободной от РНКаз и ДНКаз. Конечная концентрация раствора составляла 15 мкг меченой плазмидной ДНК в 10 мкл, этот объем плазмидной ДНК добавляли к 240 мкл коллагенового гидрогеля с получением образцов ген-активированного геля объемом 250 мкл.
Имплантация in v/ш. Эксперимент выполнен на мышах линии Balb/c обоего пола (n = 30) с соблюдением международных правил гуманного обращения с лабораторными животными. Каждому животному при помощи инсулинового шприца под кожу спины вводились исследуемые материалы: с правой стороны — ген-активированный коллагеновый гидрогель с pC4W-GL3, меченый Cy3, с левой — контрольные образцы без Cy3 метки: коллагеновый гидрогель с pC4W-GL3, колла-геновый гидрогель без плазмидной ДНК.
Прямая визуализация меченой плазмидной ДНК в тканях. Для визуализации предварительно меченной pC4W-GL3 животных выводили из эксперимента на сроках 1, 7, 14 сут., забирали ткани с зонами имплантации материалов, изготавливали замороженные срезы
толщиной 4-6 мкм. После инкубации в PBS ядра клеток докрашивали DAPI. Изготовленные препараты фотодо-кументировали при помощи микроскопа Axio Imager z2 и программного обеспечения Zen (Zeiss, Германия).
Оценка уровня экспрессии плазмидной
ДНК ген-активированного гидрогеля
Оценка уровня экспрессии терапевтического трансгена in vitro. Эксперимент выполнен на культурах клеток линии HEK-293. Клетки культивировали в среде DMEM/ F12 (ПанЭко, Россия) с добавлением 1% фетальной телячьей сыворотки (HyClone, США) и пенициллина-стрептомицина (ПанЭко, Россия). Клетки рассаживали в 6-луночные планшеты в количестве 1,5х106 кл./лун. для оценки на сроках 1 и 3 сут. и 0,65х106 тыс. кл./ лун. — для измерений на сроке 5 сут. При достижении первыми культурами 70-90 % конфлюентности монослоя, а вторыми — 50% конфлюентности в лунки вносили один из исследуемых материалов: 100 мкл ген-активированного коллагенового гидрогеля, содержащего 50 мкг pDNA-VEGF; эквивалентные объемы коллагенового гидрогеля, без плазмидной ДНК; воды для инъекций или 50 мкг pDNA-VEGF в воде для инъекций. Перед внесением образцов гидрогелей ростовую среду у клеток меняли на свежую с добавлением 1% фетальной телячьей сыворотки. Далее в течение всего времени со-инкубирования ростовую среду не меняли. В запланированные сроки забирали образцы ростовой среды объемом 1 мкл для дальнейшего определения в них концентрации белка VEGF-А методом иммуно-ферментного анализа с помощью набора HEB696Hu ELISA Kit for Vascular Endothelial 1 Growth Factor 165. Значения оптической плотности измеряли с помощью микропланшетного фотометра Anthos 2010 с программным обеспечением ADAP+ при длине волны 450 нм. Затем с помощью трипсина снимали с пластика культивированные клетки. Количество и жизнеспособность клеток в каждом образце определяли в автоматическом режиме с помощью счетчика клеток TC20. Из полученных образов выделяли тотальную РНК для дальнейшего анализа уровня продукции мРНК гена VEGF методом ПЦР в реальном времени с использованием смеси для ПЦР qPCRmix-HS SYBR с интеркалирующим красителем SYBR Green I согласно инструкции производителя. Детекцию результатов ПЦР осуществляли на амплификаторе ДТлайт. В качестве референсных генов использовали b2M и TBP. Были использованы следующие праймеры:
VEGFA-for — GGGCAGAATCATCACGAAGT;
VEGFA-rev — GGTGAGGTTTGATCCGCATA;
B2M-for — GACTTTGTCACAGCCCAAGAT;
B2M-rev — GTGGAGCAACCTGCTCAGA;
TBP-for — CAGCGCAAGGGTTTCTGGTTT;
TBP-rev — TGGAAGAGCTGTGGTGCCTG.
Оценка уровня экспрессии репортерного трансгена in vivo. Эксперимент выполнен по протоколу, описанному выше в разделе «имплантация in vivo». Каждому животному имплантировали 250 мкл ген-активированного геля с репортерной плазмидной ДНК (экспериментальная группа), либо коллагеновый гель без плазмидной ДНК или подный раствор pC4W-GL3. В каждой группе насчитывалось 3 мыши. На сроках 1, 3, 7, 14 и 28 сут. животным под внутримышечной седацией Sol. Zoletili 100 внутрибрюшинно вводили D-люциферина натриевую соль (Promega, США) из расчета 150 мкг/кг массы тела животного и через 10 и 45 мин. помещали в камеру
прибора для детекции люминесценции IVIS Spectrum (Perkin Elmer, Santa Clara, США). Обработку полученных изображений с количественным определением уровня люминесценции производили в программе Living image® (Perkin Elmer, США), результаты представлены в виде значений показателя люминесценции (количество фотонов / сек. /см2 / угол (стерадиан), p/s/cm2/sr).
Оценка биологического эффекта
терапевтического белка, кодируемого трансгеном
Ангиогенный эффект белка VEGF, кодируемого pDNA-VEGF, оценивали in vivo в модели механического повреждения скелетной мышцы у крыс линии Wistar массой 250 г (n = 6), как было описано ранее [14]. Кратко, каждому животному иссекали фрагменты передних большеберцовых мышц от верхней трети книзу, длиной 10 мм и толщиной 2-3 мм. Дефекты справа заполняли ген-активированным гидрогелем объемом 250 мкл с концентрацией pDNA-VEGF 100 мкг, слева — коллагеновым гидрогелем эквивалентного объема без плазмидной ДНК. Животных выводили из эксперимента на сроке 2 нед. после операции, извлеченные материалы фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, изготавливали гистологические препараты по стандартной методике. Осуществляли иммуногистохимическую реакцию с антителами к CD31 (кроличьи монокло-нальные EPR17259, Abcam). Препараты сканировали в Aperio CS2 (Leica, Германия) с получением цифровых изображений, подсчет количества сосудов в 10 случайных полях зрения выполняли с использованием программы Aperio ImageScope (Leica, Германия).
Статистический анализ
На первом этапе статистического анализа использовали описательные методы с расчетом среднего значения, медианы, стандартного отклонения, верхнего и нижнего квартилей. Учитывая распределение количественных признаков, отличное от нормального, для сравнения групп использовали непараметрические методы (U-критерий Манна-Уитни для межгрупповых сравнений, критерий Вилкоксона — для внутригрупповых). Во всех случаях уровень статистической значимости различий (p) был принят за 0,05.
Результаты и обсуждение
Детекция плазмидной ДНК в тканях in vivo
В ходе эксперимента ни одно из животных не погибло до запланированных сроков выведения. Послеоперационные раны заживали без особенностей. После подкожной имплантации ген-активированного гидрогеля с pC4W-GL3, меченой Cy3, молекулы генной конструкции выявлялись в эпидермисе, дерме и кожной мышце мышей. При этом в первые сутки после введения в тканях выявлялись округлые участки, имеющие вид полостей с многочисленными скоплениями флуоресцирующих элементов в виде точек, тогда как на последующих сроках наблюдения молекулы ДНК рассредоточивались, распределялись диффузно без дискретных скоплений, детектировались не только в межклеточном матриксе, но и внутри клеток, преимущественно фибробластов дермы, а также эпителиоци-тов (рис. 1). В исследовании Р^. Palumbo (2012), в сходном эксперименте, меченая Cy3 репортерная голая плазмидная ДНК с геном Luc также акцептировалась
1 сут.
7 сут.
14 сут.
А
Б
Л п>1 tí
V
Рис. 1. Кожа крыс после введения ген-активированного гидрогеля с меченой репортерной плазмидной ДНК (А) и коллагенового гидрогеля без плазмидной ДНК (Б). Белыми стрелками обозначены детектированные генные конструкции. Флуоресцентная микросокопия
преимущественно фибробластами дермы, тогда как доставленная различными катионными полиплексами определялась преимущественно в антиген-презенти-рующих клетках [15]. К 14 сут. после операции в тканях определялись лишь единичные молекулы плазмидной ДНК. В контрольных группах аналогичный флуоресцентный сигнал не детектировался.
Важно отметить, что использование Су3-метки позволяет оценить локализацию и распределение плазмидной ДНК не только в ходе цитологического или гистологического исследований, но и прижизненно при использовании специализированных систем визуализации флуоресцентного сигнала, таких как Maestro (Caliper Life Sciences, США] [15]. В целом, исследование позволяет охарактеризовать не только высвобождение плазмидной ДНК из матрикса-носителя, но и дальнейшие этапы механизма действия, а именно — поступление в клетки мишени. Для этого с помощью иммуногистохимических исследований с антителами к маркерам различных видов клеток получают гистологические изображения, ко-локализация которых с флуоресцентными данными позволяет идентифицировать клетки-акцепторы плазмиды. Дополнительно, может быть идентифицирована внутриклеточная локализация плазмидной ДНК. Преимуществом метода является возможность прямой детекции исследуемой плазмид-ной ДНК, недостатком — возможное влияние метки на механизм действия молекулы.
Экспрессия трансгена in vitro
Как в случае ген-активированного гидрогеля, так и коллагенового геля без плазмидной ДНК на сроке 5 сут. ко-инкубирования наблюдалось снижение количества жизнеспособных клеток по сравнению с интактной культурой и клетками, в среду которых была добавлен водный раствор плазмидной ДНК (p < 0,05; рис. 2], что необходимо учитывать при интерпретации результатов ПЦР и ИФА. При этом, ген-активированный гидрогель
обеспечивал значительное увеличение уровня мРНК гена VEGF через 1 сут. после со-инкубирования с последующим плавным снижением, а также белка VEGF с пиковым уровнем на сроке 3 сут. (рис. 2]. Важно, что агенты, усиливающие трансфекцию in vitro, в данном эксперименте не использовались. В этом случае статистически значимое увеличение уровней мРНК гена VEGF и белка VEGF-A в случае ген-активированного гидрогеля, вероятно, было обусловлено позитивным эффектом коллагенового матрикса, который через 1 сут. после начала ко-инкубации уже полностью растворялся в культуральной среде. Представляется возможным, что фрагменты коллагена акцептировались клетками вместе с молекулами плазмидной ДНК, обеспечивая увеличение эффективности трансфекции последних.
Оценка экспрессии трансгена in vitro на уровне транскриптома и секретома с помощью ПЦР-РВ и ИФА, соответственно, являются наиболее широко применяющимися методами исследований в разработке ген-активированных материалов [16, 17]. Однако нет единого мнения в отношении выбора наиболее приемлемой культуры клеток под определенные виды генных конструкций и трансгенов, количества клеток в культуре, доз и сроков наблюдения. Широкая палитра протоколов оценки доставки плазмидной ДНК in vitro и необходимость стандартизации уже отмечена рядом исследователей [17]. Наиболее логичным представляется использование клеточных линий, которые отличаются наименьшим уровнем эндогенной продукции белка, аналогичного кодируемому трансгеном. Это послужило причиной выбора нами линии HEK-293 для выполнения эксперимента.
Экспрессия трансгена in vivo
В ходе прижизненного люминисцентного исследования наличие сигнала было выявлено в группе с ген-активированным гидрогелем на сроках 3, 7 и 1 4 сут. с пиковой экспрессией на отметке 7 сут. При этом
Рис. 2. Уровень экспрессии трансгена in vitro и влияние материалов на жизнеспособность клеток HEK-293: А — доля жизнеспособных клеток, Б — относительный уровень мРНК, В — концентрация белка VEGF-A, пг/мл. А — ген-активированный гидрогель, Б — коллагеновый гидрогель без плазмидной ДНК, В — интактная культура клеток, Г — водный раствор плазмидной ДНК. * — различия с группами В и Г статистически значимы, ** — различия с группой Б статистически значимы, p < 0,05
Cotoîfifc M*i-2.7ie3
Ч'. ■ 5 м--.
Рис. 3. Люминисцентный сигнал, 7 сут. после подкожного
введения исследуемых материалов мышам
введение pC4W-GL3 в растворе (контроль) приводило к детекции люминисцентного сигнала на сроках 1, 3, 7 и 14 сут. с пиковым уровнем отметке 3 сут. (рис. 3). Сходные данные с максимальным уровнем экспрессии люциферазы через 3 сут. после введения водного раствора плазмидной ДНК с геном Luc были получены и другими исследователями [18].
Важно отметить, что данный метод является высокочувствительным не только в плане минимального порога детекции люминисцентного сигнала, но и в части восприимчивости к любым изменениям протокола: разведение соли D-люциферина, ее экспозиция до введения в организм животного, экспозиция перед измерением люминисцентного сигнала, экспозиция в ходе измерения люминисценции, а также наличие шерсти в зоне детекции сигнала и прочие факторы существенно влияют на результаты исследования [19]. В этой связи, объективное сравнение результатов экспериментов, выполненных по единому протоколу, но в разное время, может оказаться не выполнимым. Тем не менее, данный метод активно используется, особенно для разработки средств улучшения доставки плазмидной ДНК: оптимизированных матриксов-носителей, различных вспомогательных компонентов, способных образовывать комплексы с плазмидной ДНК и т. п. [15].
Помимо прижизненного люминисцентного исследования, широко применяется иммуногистохимическое исследование с антителами к белку, кодируемому репортерной плазмидной ДНК — люциферазе, зеленому
флуоресцентному белку и др. [15, 18]. Однако такой метод носит полуколичественный характер.
Необходимо отметить, что указанные способы базируются на использовании репортерной плазмидной ДНК, отличной от терапевтической, входящей в состав ген-активированного материала. В связи с этим, результаты исследований должны учитываться в комплексе с вышеприведенной оценкой трансфекции in vitro, а также могут быть заменены биохимическими методами количественного определения содержания белка в образцах тканей.
Биологический эффект белка,
кодируемого трансгеном, in vivo
Финальным этапом реализации биологического действия плазмидной ДНК, входящей в состав ген-активированного материала, является эффект, обусловленный влиянием белка, кодируемого трансгеном, на клетки-мишени. Основным каноническим эффектом VEGF-A является индукция ангиогенеза, количественную оценку которого можно выполнить, подсчитав количество сосудов на гистологическом препарате. В модели заживления раны скелетной мышцы у крыс было выявлено, что в случае имплантации ген-активированного коллагено-вого гидрогеля количество сосудов в 10 случайных полях было статистически значимо большим, чем в контроле, составив 33,1 ± 11,4 и 14,8 ± 3,5, соответственно (p = 0,027). Эти данные подтверждают, что ангиогенный эффект имплантированного материала был обусловлен pDNA-VEGF.
Сходные результаты были получены нами ранее в исследованиях с твердыми (на основе гранул окта-кальциевого фосфата [20]) и гидрогелевым (на основне гиалуроновой кислоты [1 4]) ген-активированными материалами.
Очевидно, что этап механизма действия является наиболее специфичным, напрямую зависит от белковой молекулы, кодируемой трансгеном. В связи с этим, стандартизация исследований, направленных на оценку его реализации, представляется особенно затруднительной и, вероятно, не требующей реализации задачей — в каждом отдельном случае для оценки эффекта целесообразно подбирать наиболее релевантные целевому показанию к применению модели.
Заключение
Таким образом, перечень методов исследований различных этапов механизма действия плазмидной ДНК чрезвычайно широк. Детализация данных о процессах,
происходящих с генными конструкциями на тканевом, клеточном и субклеточном уровнях закономерно приводят к росту перечня методов исследований. При этом, для более объективного сопоставления результатов экспериментальных исследований, а также для безопасной и эффективной трансляции разработок в клиническую практику требуется стандартизация подходов, которая к настоящему времени отсутствует не только в руководствах профильных научных сообществ, но и в регламентирующих документах.
На основании проведенных исследований, сопоставленных с данными литературы, представляется возможным предложить следующий минимальный список исследований, позволяющих охарактеризовать механизм действия и биологический эффект плазмид-ной ДНК ген-активированных материалов.
1) Оценка высвобождения, локализации и распределения генных конструкций в тканях с использованием Су3-метки или аналогов.
2) Оценка уровня экспрессии трансгена in vitro по данным ПЦР и ИФА на культуре клеток, отличающейся минимальным уровнем эндогенной экспресси гена, аналогичного трансгену, без применения трансфицирующих агентов.
ЛИТЕРАТУРА [REFERENCES]:
1. Lu H., Lv L., Dai Y. et al. Porous chitosan scaffolds with embedded hyaluronic acid/chitosan/plasmid-DNA nanoparticles encoding TGF-pl induce DNA controlled release, transfected chondrocytes, and promoted cell proliferation. PLoS One 2013; 8(7): e69950.
2. Keeney M., van den Beucken J.J., van der Kraan P.M. et al. The ability of a collagen/calcium phosphate scaffold to act as its own vector for gene delivery and to promote bone formation via transfection with VEGF(165). Biomaterials. 2010; 31(10): 2893-902.
3. Бозо И.Я., Деев Р.В., Журавлева М.Н., Комлев В.С., Попов В.К., Смирнов И.В., Федотов А.Ю. Ген-активированный остеопластический материал на основе октакальциевого фосфата, допированный ионами магния. Материаловедение 2017; 5: 33-37.
4. Деев Р.В., Дробышев А.Ю., Бозо И.Я. Ординарные и активированные остеопластические материалы. Вестник травматологии и ортопедии им. Н.Н. Приорова 2015; 1: 51-69. [Deev R.V., Drobyshev A.Yu., Bozo I.Ya. Ordinary and Activated Osteoplastic Materials. N.N. Priorov Bulletin of Traumatology and Orthopedics 2015; 1: 51-69].
5. Peach C.J., Mignone V.W., Arruda M.A. et al. Molecular Pharmacology of VEGF-A Isoforms: Binding and Signalling at VEGFR2. Int J Mol Sci. 2018; 19(4): 1264.
6. Деев Р.В., Бозо И.Я., Мжаванадзе Н.Д. и др. Эффективность применения гена VEGF165 в комплексном лечении пациентов с хронической ишемией нижних конечностей 2а-3 стадии. Ангиология и сосудистая хирургия 2014; 20(2): 38-48. [Deev R.V., Bozo I.Ya., Mzhavanadze N.D. et al. Efficacy of using VEGF165 gene in comprehensive treatment of patients with stage 2А-3 lower limb chronic ischaemia. Angiol Sosud Khir. 2014; 20(2): 38-48].
7. Sallent I., Capella-Monsonis H., Procter P. и др. The Few Who Made It: Commercially and Clinically Successful Innovative Bone Grafts. Front Bioeng Biotechnol. 2020; 8: 952.
8. Chira S., Jackson C.S., Oprea I. et al. Calin, Ioana Berindan-Neagoe Progresses towards safe and efficient gene therapy vectors. Oncotarget 2015; 6(31): 30675-30703.
9. Григорян А.С., Шевченко К.Г. Возможные молекулярные механизмы функционирования плазмидных конструкций, содержащих ген VEGF. Гены и Клетки 2011; 6(3): 24-28. [Grigorian A.S., Shevchenko K.G. Some possible molecular mechanisms of VEGF encoding plasmids functioning. Genes and Cells 2011; 6(3): 24-28].
10. Бозо И.Я., Билялов А.И., Мавликеев М.О. и др. Ген-активированные гидрогели в регенеративной медицине. Гены и Клетки
3) Количественное определение белка, кодируемого трансгеном, в тканях реципиентного ложа
4) Оценка биологического эффекта, вызванного белком, кодируемым трансгеном, с использованием моделей и методов, подобранных под конкретный вариант ген-активированного материала и релевантных основному показанию к применению.
Люминисцентные и флуоресцентные методы исследований in vivo, основанные на применении репортерных плазмидных ДНК, носят вспомогательный характер в оценке этапа экспрессии трансгена, так как позволяют получить данные о влиянии матрикса-носителя или иных факторов на общий уровень трансфекции плазмидной ДНК, но не конкретной, терапевтически активной (целевой) генной конструкции.
Благодарности
Авторы выражают благодарность П. Макаревичу за предоставленную плазмидную ДНК с геном Luc, М. Крутиковой и Е. Кананыхиной за выполнение исследований in vitro. Работа выполнена за счет средств граната Российского научного фонда по контракту № 18-75-10085 от08.08.2018 года.
2019; 14(1): 16-21. [Bozo I.Y., Bilialov A.I., Mavllkeev M.O. Gene-activated hydrogels in regenerative medicine. Genes and Cells 2019; 14(1): 16-21].
11. D'Mello S., Atluri K., Geary S.M. et al. Bone regeneration using gene-activated matrices. AAPS J. 2017; 19(1): 43-53.
12. Bozo I.Y., Deev R.V., Drobyshev A.Y. et al. World's First Clinical Case of Gene-Activated Bone Substitute Application. Case Rep Dent. 2016; 2016: 8648949.
13. Masgutov R., Chekunov M., Zhuravleva M. et al. Use of gene-activated demineralized bone allograft in the therapy of ulnar pseudarthrosis. case report. BioNanoScience. 2017; 7(1): 194-198.
14. Деев Р.В., Бозо И.Я., Мавликеев М.О. Регенерационный гистогенез в области дефекта скелетной мышцы при местном введении ген-активированного гидрогеля на основе гиалуроновой кислоты в эксперименте. Гены и Клетки 2020; 15(2): 66-72. [Deev R.V., Bozo I.Y., Mavlikeev M.O. et al. Regenerative histogenesis in a skeletal muscle defect with local injection of gene-activated hydrogel in an experiment. Genes and Cells 2020; 15(2): 66-72].
15. Palumbo P.N., Zhong X., Panus D. et al. Transgene expression and local tissue distribution of naked and polymer-condensed plasmid DNA after intradermal administration in mice. J Control Release. 2012; 159(2): 232-39.
16. Sadeghpour H., Khalvati B., Entezar-Almahdi E. et al. Double domain polyethylenimine-based nanoparticles for integrin receptor mediated delivery of plasmid DNA. Sci Rep. 2018; 8: 6842.
17. Bono N., Ponti F., Mantovani D. et al. Non-Viral in Vitro Gene Delivery: It is Now Time to Set the Bar! Pharmaceutics. 2020; 12(2): 183.
18. Petkov S.P., Heuts F., Krotova O.A. et al. Evaluation of immunogen delivery by DNA immunization using non-invasive bioluminescence imaging. Hum Vaccin Immunother. 2013; 9(10): 2228-2236.
19. Tseng J.-C., Vasquez K.O., Peterson J.D. Optical Imaging on the IVIS SpectrumCT System: General and Technical Considerations for 2D and 3D Imaging. 2015. https://www.perkinelmer.com/lab-solutions/ resources/docs/TCH_012007_01_IVIS-2D_3D_Imaging.pdf
20. Бозо И.Я., Деев Р.В., Дробышев А.Ю. и др. Эффективность ген-активированного остеопластического материала на основе октакальциевого фосфата и плазмидной днк с геном VEGF в восполнении «критических» костных дефектов. Вестник травматологии и ортопедии им. Н.Н. Приорова 2015; 1: 35-42. [Bozo I.Ya., Deev R.V., Drobyshev A.Yu. et al. Efficacy of Gen-Activated Osteoplastic Material Based on Octacalcium Phosphate and Plasmid DNA containing vegf Gene for Critical-sized Bone Defects Substitution. N.N. Priorov Bulletin of Traumatology and Orthopedics 2015; 1: 35-42].
