CC BY
41
УДК 577.3
Т. А. Мрачковская, Н. А. Феоктистова, И. Г. Платима, Г. Е. Заиков
КОМПЛЕКСНАЯ КОАЦЕРВАЦИЯ ОВАЛЬБУМИНА И ХИТОЗАНА В ВОДНОМ РАСТВОРЕ
Ключевые слова: комплексная коацервация, хитозан, овальбумин, дифференциальная сканирующая микрокалориметрия.
Комплексная коацервация овальбумина и хитозана в водных растворах исследована методами турбидиметри-ческого и потенциометрического титрования, оптической микроскопии, фазового анализа и дифференциальной сканирующей микрокалориметрии (ДСК). Жидкофазное расслоение и максимальный выход коацерватов (76 - 86%) наблюдаются в узком диапазоне рН (5,9-6,1) и весовой доли хитозана в исходной смеси q0 (0, 050,10), в котором не зависят от суммарной концентрации полимеров. При постоянном значении рН смешения 6,0 состав коацерватов изменяется в зависимости от q0: количество молекул овальбумина, в среднем приходящееся на одну макромолекулу хитозана, варьирует от 65 (q0 = 0,03) до 45(q0 = 0,07). Данные ДСК свидетельствуют о дестабилизирующем действии хитозана на конформационную стабильность овальбумина в процессе образования комплексных коацерватов. Возможность применения коацерватов овальбумин-хитозан в целях инкапсулирования продемонстрирована на примере стабилизации ими эмульсий гвоздичного масла (максимальная эффективность эмульгирования 83%).
Keywords: complex coacervation, chitosan, ovalbumin, differential scanning microcalorimetry.
Complex coacervation of ovalbumin and chitosan in water was investigated by turbidimetric and potentiometric titration, optical microscopy, phase analysis as well as by differential scanning microcalorimetry (DSC) methods. Liquidliquid phase separation and maximal yield of coacervates (76-86%) occur within the narrow range of рН (5,9-6,1) and weight fraction of chitosan in initial polymer mixture q0 ¡0,05-0,10), where they do not depend on the total polymer concentration. At constant mixing pH value 6,0 the composition of coacervates is variable with q0: the average number of ovalbumin molecules per one chitosan macromolecule varies from 65(q0 = 0,03) to 45 (q0 = 0,07). DSC data testify to a destabilizing effect of chitosan on the conformational stability of ovalbumin during complex coacervate formation. The feasibility of ovalbumin-chitosan coacervates applying for the purposes of encapsulation has been demonstrated with examples of stabilization of clove oil emulsions (the maximal emulsifying efficiency 83%).
Введение
Ассоциативные взаимодействия между противоположно заряженными макромолекулами белков и полисахаридов в определенных условиях сопровождаются самопроизвольным расслоением системы полиэлектролитный комплекс-вода на две жидкие фазы: фазу с высокой плотностью, обогащенную обоими биополимерами (коацерват), и ее супернатант. Основной движущей силой этого процесса, называемого комплексной коацервацией, являются электростатические взаимодействия.
Важным аспектом применения комплексной коацервации является инкапсулирование пищевых ингредиентов и лекарственных веществ: образующаяся в водной смеси биополимеров коацерватная фаза способна обволакивать диспергированные в той же системе микрочастицы вещества непрерывной тонкой пленкой, которая отверждается на стадии выделения микрокапсул.
В настоящей работе исследовано влияние основных детерминант процесса комплексной коа-цервации (pH и ионной силы реакционной среды, количественного соотношения и суммарной концентрации макрокомпонентов в исходной смеси биополимеров) на выход, состав, морфологию, структуру и эмульгирующую способность коацерватов.
В качестве объектов исследования были выбраны линейный катионный полисахарид хитозан, 1^4(2-амино-2-дезокси)-р-Э-глюкан, и ценный пищевой белок овальбумин.
Комплексы хитозана с анионными полисахаридами, ДНК, белками, синтетическими полианионами служили предметом многочисленных ис-
следований [1], однако взаимодействию хитозана с овальбумином посвящено малое количество работ. Так, комплексы овальбумина и хитозана, полученные в виде коацерватов и предназначаемые для использования в качестве эффективных инкапсулянтов липофильных веществ описаны в [2,3]. Нано- и микрокапсулы на основе овальбумина и хитозана, предназначаемые для инкапсулирования и контролируемого релиза лекарственных веществ описаны в работах [4,5].
Хитозан, благодаря поликатионной природе, занимает уникальное место в ряду полисахаридов, так как позволяет модифицировать функциональные свойства белков в области pH выше их изо-электрической точки.
Овальбумин - основной компонент белка куриного яйца (54% от общего содержания белка). Овальбумин является самым гидрофильным белком в нативном состоянии и самым гидрофобным в денатурированном [6], что создает предпосылки для его эффективного использования в процессах инкапсулирования липофильных соединений.
Экспериментальная часть
Материалы и методы исследования
В работе использовали хитозан производства ЗАО "СОНАТ". Степень дезацетилирования хитозана (ДА) определяли методом потенциометрического титрования на цифровом рН-метре Orion SA-520 .(USA). Точную навеску хитозана, растворенную в разбавленной соляной кислоте, титровали раствором NaOH с точно известным титром. Степень дезацетилирования (ДА,%) определяли по формуле:
ДА = 100У-^203/(Р+42У^, где N-нормальность №ОН, У-объем раствора N804, пошедший на титрование аминогрупп хитозана (мл), Р- навеска хито-зана в пересчете на сухой вес (мг).
Средневязкостную молекулярную массу хитозана Мц=180 000 г/моль определяли путем измерения характеристической вязкости [ц] в растворе 0,3 М СН3С00Н / 0,2 М CH3C00N8 в капиллярном вискозиметре Уббелоде ^ = 0,50 мм) при температуре 25±0,05оС. Мц рассчитана из уравнения Марка - Куна - Хаувинка: [ц] = КМца = 0,07б-Мц0,76 см3г-1 с использованием параметров К и а, приведенных в работе [7]
В работе использован 5 раз кристаллизованный овальбумин производства НПО "БИОЛАР" (Олайне, Латвия). Дифференциальная сканирующая микрокалориметрия (ДСК) исследуемого овальбу-мина показала наличие эндотермического пика при 77,3 оС, (скорость нагревания 2 С/мин, концентрация белка 4,4 мг/мл в 0,01 М Ма-фосфатном буфере, рН 6,7). Термограмма не содержала пиков, соответствующих более стабильному 8- овальбумину или его промежуточным формам.
Дифференциальная адиабатная сканирующая микрокалориметрия
Термодинамические параметры конформа-ционного перехода макромолекул нативного оваль-бумина и овальбумина в смесях с хитозаном определяли методом ДСК на микрокалориметре БЛ8М-4 (НПО "Биоприбор", Пущино, Россия) при скорости нагревания 2 °С/мин и избыточном давлении 0,2 МПа. Концентрация белка в рабочей ячейке составляла 4 мг/мл. Ячейку сравнения заполняли растворителем при исследовании растворов белка или раствором хитозана той же концентрации, что и в рабочей ячейке, при исследовании смеси белка с хитозаном. Хитозан в условиях эксперимента не проявлял способности к кооперативным переходам, сопровождающимся появлением пика теплопогло-щением. В случае гетерогенных образцов (комплексных коацерватов) анализируемые пробы с целью гомогенизации отбирались при непрерывном перемешивании.
Для регистрации первичных данных и превращения парциальной теплоемкости овальбумина в функцию избыточной теплоемкости денатурацион-ного перехода использовали программу СрСа1с, версия 2.1. Базовую линию, ограничивающую область перехода, проводили методом сплайн-интерполяции. Максимальную температуру кривой избыточной теплоемкости принимали за температуру денатурации Тс. Удельную энтальпию денатурации (ДИс) определяли интегрированием функции избыточной теплоемкости.
Приготовление растворов
Для получения исходных 1% растворов хи-тозана точную навеску биополимера (1г в пересчете на сухой вес) растворяли при энергичном перемешивании в течение суток в 100 мл 0,056 М уксусной кислоты (стехиометрическое отношение [Ас0Н]/[СЫ^Н2] = 0,94). Растворы центрифугиро-
вали при 13000 g в течение 40 минут при 20°C (Beckman-J2-21, Germany). Концентрацию хитозана в полученных растворах уточняли высушиванием аликвоты раствора до постоянного веса при температуре 100-110°C. Растворы хранились при комнатной температуре.
Овальбумин растворяли в дистиллированной воде при слабом перемешивании, не допуская образования пены, затем раствор центрифугировали при 13000 g в течение 40 минут при 20 °C (Beckman - J2-21, Germany).
Приготовление комплексных коацерватов
Для приготовления коацерватов к 15 г раствора хитозана по каплям при перемешивании добавляли 15 г раствора овальбумина при температуре 25°C. Предварительно pH исходных растворов были доведены до заданных значений добавлением разбавленного раствора NaOH. Суммарная концентрация полимеров в смеси (Cs) варьировала в пределах 0,40-3,0%, а весовая доля хитозана по отношению к суммарному весу полимеров (qo) в пределах 0,030,15. После смешения перемешивание продолжалось 20 минут. При pH смешения (рНт) 6,0 коацер-ватные капли выделялись на стенках и дне реакционного сосуда, образуя сплошную жидкую коацер-ватную фазу. Все смеси выдерживали для созревания в течение 18 часов. Далее их подвергали центрифугированию при 13000g в течение 40 минут. Супернатанты отделяли декантацией, а выход сухого коацервата определяли высушиванием коацер-ватной фазы до постоянного веса в токе горячего воздуха при температуре 75-79 °C. Содержание белка в комплексном коацервате определяли по разности содержания белка в исходной смеси и в супер-натантах.
Определение концентрации овальбумина в исходных растворах и супернатантах осуществляли следующим образом: аликвоту раствора, содержащего овальбумин, разбавляли ацетатным буфером (pH 3,6; I=0,05), затем измеряли оптическую плотность раствора при 280 нм. Концентрацию белка рассчитывали по значению удельной экстинкции Е1мг/мл1см = 0,74. Измерения проводили на спектрофотометре Specord UV-VIS (Carl Zeiss, Jena, Germany).
Оптическая микроскопия
Для наблюдения за образованием микро-коацерватных капель использовали оптический микроскоп AMPLIVAL (Carl Zeiss, Jena, Germany), оснащенный цифровой фотокамерой.
Турбидиметрическое титрование
Для проведения турбидиметрического титрования равные объемы растворов овальбумина и хитозана смешивали при заданных значениях pHm. C2 в получаемых смесях составляла 0,02%, q0 варьировала от 0,03 до 0,15. Полученные смеси перемешивали в течение 30 минут при 25оС. Титрование осуществляли при перемешивании, добавляя с постоянной скоростью 0,01N NaOH. Мерой выхода нерастворимого комплекса служила величина оптической плотности при 450 нм. Регистрацию оптической плотности осуществляли на спектрофотометре
Specord UV-VIS, регистрацию pH diometer (Danmark).
на рН-метре Ra-
Получение эмульсий гвоздичного масла
К 15 г раствора хитозана (рН 6,0) по каплям при энергичном перемешивании добавляли точное количество гвоздичного масла (10-33% по отношению к суммарному весу хитозана и овальбумина в эмульсии). Смесь гомогенизировали при 17000 об/мин в течение 5 минут с помощью гомогенизатора Diax 900 Heidolph (Germany). Затем к смеси по каплям при перемешивании добавляли 15 г раствора овальбумина (рН 6,0). 02 и q0 в дисперсионной среде варьировали в тех же пределах, что и при получении комплексных коацерватов. После 15 минут перемешивания полученные эмульсии оставляли при комнатной температуре на сутки, затем центрифугировали при 13000g в течение 40 минут. После разделения эмульсии центрифугированием определяли содержание свободного масла в супернатантах. Количество заэмульгированного коацерватом масла определяли как разность между количеством введенного и свободного масла. Эффективность эмульгирования определяли как отношение количества заэмульгированного масла к количеству введенного масла.
Для определения содержания гвоздичного масла в супернатантах аликвоту супернатанта экстрагировали двумя объемами гексана. Экстракт разбавляли требуемым количеством гексана и измеряли оптическую плотность образца при длине волны 283 нм. Концентрацию гвоздичного масла в экстракте рассчитывали по значению удельной экстинкции
Е1 мг/мл ,, ,г
1 см = 16,45.
Результаты и обсуждение
Условия образования комплексных коацерватов
При выборе оптимальных условий получения комплексных коацерватов в системе овальбу-мин-хитозан-вода исходили из того, что явления комплексной коацервации наблюдаются в системах, содержащих противоположно заряженные полиэлектролиты. Выбор оптимальных значений рН ограничен узким диапазоном, лежащим выше изоэлек-трической точки овальбумина (pI 4.7), в котором он заряжен отрицательно, и ниже области рН 6.3^6.5, в которой хитозан утрачивает значительную часть положительного заряда вследствие депротонирова-ния и начинает терять растворимость. Для установления границ фазового расслоения использовали метод турбидиметрического титрования. На всех кривых турбидиметрического титрования растворов смесей овальбумина и хитозана с различными значениями весовой доли хитозана q0 максимальная оптическая плотность Dmax достигается при значениях рН 6.1^6.3 (pHmax), причем наибольшие абсолютные значения Dmax приходятся на узкий диапазон q0=0.03^0.07 (рис.1). Согласно методу непрерывных изменений [8], состав смеси, обладающей максимальной мутностью, соответствует максимальному выходу нерастворимого комплекса.
Следует отметить, что значения рН, при которых начинается резкое возрастание оптической плотности и вблизи которых появляются первые микрокоацерватные капли, лежат в узком интервале рН0=4.8^5.2 и лишь слегка превышают р1 овальбу-мина.
q0= 0,03
^^ q0= 0,05
q0= 0,07
^^ q0= 0,10
^^ q0= 0,15
Рис. 1 - Турбидиметрическое титрование смесей овальбумина и хитозана с различными значениями Яо. СЕ = 0,02, рНт = 4,0, СМаС| = 0,005 моль/л
Влияние ионной силы на процесс образования нерастворимых комплексов было изучено методом турбидиметрического титрования смесей овальбумина и хитозана с весовой долей хитозана q0=0.07, содержащих №С1 в различных концентрациях. Как видно из рис. 2, максимальный выход коацервата достигается в системе, содержащей минимальное количество добавленной соли (С№а=0.005М).
0,5т
0,40,3-
s ■ qe0,2-
0,1
0,0
0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0 моль*л-1
NaCl '
Рис. 2 - Зависимость йтах от концентрации №С1 при турбидиметрическом титровании смесей овальбумина и хитозана (Я0 = 0,07, рНт = 4,0, С^ = 0,02%)
Далее, с увеличением концентрации №С1 выход коацервата падает и уже при См8а=0.05М наблюдается десятикратное уменьшение значения максимальной оптической плотности йт8Х, что свидетельствует о практически полном подавлении образования нерастворимого комплекса.
Препаративное получение комплексных коацерватов осуществляли при значении рНт 6.0, значительно превышающем р1 овальбумина и рН0, но лежащем ниже значений рНт8Х, так как выше рНт8Х происходят нежелательные морфологические изменения, и вместо жидкофазного расслоения наблюдается преципитация. Пример микрофотографии, иллюстрирующий жидкофазное расслоение в системе хитозан-овальбумин, приведен на рис.3.
Рис. 3 - Микрофотография комплексного коа-цервата хитозан-овальбумин рНт 6,0, qo = 0,08, С ^ = 2,7% (коэффициент увеличения 190)
Учитывая отрицательное влияние ионной силы на выход полиэлектролитных комплексов овальбумина и хитозана, получение коацерватов осуществляли без специального добавления ЫаО!. Важным критерием эффективности процесса коа-цервации, применяемого в целях микрокапсулиро-вания, является выход сухого коацервата У, определяемый в процентах от общего содержания полимеров в исходной реакционной смеси. Мы исследовали влияние на выход коацервата таких переменных, как и суммарная концентрация овальбумина и хитозана С^
90 807060 £ 50 403020-
0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16
Рис. 4 - Зависимость выходов комплексных коа-церватов от весовой доли хитозана в смеси ^0) при различных суммарных концентрациях (С^ ); рНт = 6,0
Как видно из рис.4, максимальные выходы коацерватов приходятся на узкий диапазон (0,05^0,10) и слабо зависят от С^, при этом количество коацерватной фазы в системе линейно возрастает с увеличением С^.
Содержание воды в коацерватах с увеличением Cz падает от 90% (СЕ = 0,04%) до 73%, достигая минимума вблизи максимального выхода при Ч0=0,07 (данные не приведены).
Состав коацерватов
Количество белка, вошедшего в состав коа-цервата, определяли по разности концентраций белка в исходной реакционной смеси и в супернатанте,
полученном после отделения коацерватной фазы. Из таблицы 1 видно, что при всех значениях Cs содержание овальбумина в супернатантах Сдакон с возрастанием сначала падает, а затем, начиная со значений = 0.1^ 0.15, возрастает. Такой характер изменения равновесной концентрации белка в суперна-танте, происходящего с увеличением количества вводимого в систему хитозана на фоне избыточной и слабо меняющейся (почти постоянной) в данном диапазоне исходной концентрации белка Covисх, свидетельствует о том, что начиная с Ч0 = 0.1 часть овальбумина удерживается в растворе в виде растворимого комплекса с хитозаном.
Таблица 1 - Концентрационные параметры процесса получения комплексных коацерватов
Cь % вес gch ,мг Г* исх Оov , %вес кон, Сov % вес
0,400 0,03 3,60 0,388 0,202
0,05 6,00 0,380 0,095
0,07 8,40 0,372 0,058
0,10 12,0 0,360 0,091
0,15 18,0 0,340 0,174
1,00 0,03 9,0 0,970 0,580
0,05 15,0 0,950 0,331
0,07 21,0 0,930 0,152
0,10 30,0 0,900 0,166
0,15 45,0 0,850 0,314
2,00 0,03 18,0 1,94 0,969
0,05 30,0 1,90 0,511
0,07 42,0 1,86 0,296
0,10 60,0 1,80 0,431
0,15 90,0 1,70 0,727
3,00 0,03 27,0 2,91 1,75
0,05 45,0 2,85 1,16
0,07 63,0 2,79 0,52
0,10 90,0 2,70 0,61
0,15 135,0 2,55 1,09
* 9сЬ- общее количество хитозана, введенного в систему
При дальнейшем увеличении доли вводимого в систему хитозана выходы коацерватов падают, и при > 0.2 нерастворимые комплексы в данных условиях практически не образуются.
Напротив, при низких значениях с увеличением степени заселенности макромолекул хитоза-на молекулами овальбумина положительно заряженных аминогрупп хитозана, гидрофилизирующих матрицу, уже недостаточно, чтобы удержать образующиеся комплексы в растворе. Сформировавшиеся нерастворимые комплексы не удается разрушить действием высокой ионной силы, что свидетельствует о необратимости комплексообразования, по-видимому, за счет дополнительного вклада сил не-кулоновской природы.
Известно, что такого рода нерастворимые интерполиэлектролитные комплексы, образующиеся
в условиях низкой ионной силы, очень стабильны. Их эффективная константа диссоциации на исходные компоненты практически равна нулю [ 9 ]. На основании вышеизложенного можно утверждать, что в нашем случае при низких значениях (р0 < 0,1) в условиях большого избытка вводимого в систему овальбумина, суммарный отрицательный заряд которого близок к суммарному положительному заряду хитозана или значительно его превышает, весь вводимый в систему хитозан входит в состав нерастворимого комплекса.
Первичная структура овальбумина хорошо изучена, и, следовательно, известны все ионизируемые боковые аминокислотные группы, а также их количество. В работе [10] методом потенциометри-ческого титрования овальбумина в 6М растворе гуанидингидрохлорида, в котором овальбумин имеет конформацию клубка, обеспечивающую максимальную доступность титруемых групп, определены рКа всех ионизируемых групп. Это позволило нам рассчитать приблизительный суммарный заряд овальбумина при рН 6.0, который складывается из отрицательных зарядов ионизируемых боковых карбоксильных групп аспарагиновой и глютаминовой кислот и положительных зарядов ионизированных аминогрупп лизина и имидазольных групп гистиди-на. Полученное значение заряда (-15,62) достаточно близко к значению избыточного заряда овальбумина при рН 6.0, определенного ранее титрованием овальбумина в 0.1 М ЫаО! и равного -15,50 [11 ].
По данным потенциометрического титрования образец хитозана, используемый в настоящей работе, имеет степень дезацетилирования ДА = 83,4%, его рКа=6,5 и при рН 6.0 степень протониро-вания а равна 0,8. Каждая макромолекула хитозана с молекулярной массой 180.000 и степенью дезацетилирования 83,4% несет на себе в среднем 893,5 аминогруппы, следовательно средний заряд макромолекулы О+ равен +714,8.
Максимальный выход коацерватов приходится примерно на значение р0=0,08 (рис.4), при котором в исходной реакционной смеси на одну макромолекулу хитозана приходится 46 молекул овальбумина, а суммарный заряд молекул овальбу-мина, приходящихся на одну макромолекулу хитозана О", составляет -717,6. Таким образом, в области максимального выхода при рН 6.0 в широком диапазоне ОЕ соотношение суммарных зарядов реагирующих биополимеров ~ 1. Тот факт, что максимальный выход комплексного коацервата наблюдается в области эквивалентности зарядов реагирующих биополимеров, свидетельствует: во первых, о главенствующей роли электростатических взаимодействий в процессе комплексообразования (об этом же свидетельствует и сильная зависимость процесса комплексообразования от ионной силы среды (рис. 2)); во-вторых, о том, что макромолекула овальбу-мина в комплексе имеет неупорядоченную конфор-мацию, вследствие чего все ионизированные группы доступны для взаимодействия с хитозаном.
В таблице 2 для разных концентрационных условий процесса коацервации (Ое , р0) приведены
значения 2, равные молярным отношениям овальбумина, вошедшего в состав коацервата, и всего хитозана, вводимого в реакционную систему (20 -молярные отношения этих компонентов в исходной реакционной смеси). Значениям < 0,08, лежащим ниже точки эквивалентности зарядов |О+/О-| < 1), соответствуют значения 2, характеризующие состав коацервата (количество молекул овальбумина, в среднем приходящееся на одну макромолекулу хи-тозана).
Таблица 2 - Параметры состава комплексных коацерватов
Ое , % вес Ро 2о По 2 П
0,03 129,3 8,3 62,0 17,3
0,05 76,0 14,1 57,0 18,8
0,04 0,07 53,1 20,2 44,8 23,9
0,10 36,0 29,8 26,9 39,8
0,15 27,7 47,2 11,1 96,5
0,03 129,3 8,3 56,0 19,1
0,05 76,0 14,1 50,8 21,1
1,00 0,07 53,1 20,2 44,8 23,9
0,10 36,0 29,8 29,7 36,1
0,15 27,7 47,2 14,6 73,4
0,03 129,3 8,3 65,3 16,4
0,05 76,0 14,1 55,7 19,2
2,00 0,07 53,1 20,2 44,8 23,9
0,10 36,0 29,8 27,5 39,0
0,15 27,7 47,2 13,1 81,9
0,03 129,3 8,3 55,2 19,4
0,05 76,0 14,1 46,6 22,3
3,00 0,07 53,1 20,2 42,6 25,0
0,10 36,0 29,8 29,7 36,0
0,15 27,7 47,2 13,1 81,9
Соответствующие им значения п означают количество моносахаридных звеньев хитозана, в среднем приходящиеся на одну молекулу овальбу-мина в составе коацервата (п0 - соответствующее отношение в исходной реакционной смеси).
Выше точки эквивалентности зарядов (р0 > 0,08, |О+/О-| > 1) значения 2 и п уже не отражают состав комплексных коацерватов, так как вводимый в систему хитозан частично присутствует в суперна-танте в виде растворимых комплексов с овальбуми-ном. Характерно, однако, что в этой области сосуществования растворимых и нерастворимых комплексов значения 2 и п достаточно близки между собой и не зависят от О2.
Из таблицы 2 видно, что состав комплексных коацерватов (р0 =0,03^0,07, |О+/О| < 1) не зависит от О2, является переменным и колеблется от 65,3 (д0=0,03) до 44,8 ^=0,07). Наличие обратной корреляции между и содержанием овальбумина в коацерватах позволяет предположить, что в точке эквивалентности зарядов на макромолекуле хитоза-
на еще остаются свободные сайты, незанятые молекулами белка.
Характерно, что вблизи точки эквивалентности (qo=0,07) Z и n практически совпадают при всех значениях Cs. Более сильный разброс данных при q0<0,07 (в условиях избытка лиганда) связан, по-видимому, с большей гетерогенностью системы в условиях фазового расслоения.
Овальбумин является глобулярным белком, и в процессе комплексообразования контакт между всеми отрицательно заряженными карбоксильными группами его нативной формы и положительно заряженными аминогруппами хитозана не возможен по стерическим причинам. С другой стороны, образование электронейтрального комплекса, наблюдаемое в области максимального выхода коацервата, осуществимо только в случае полной доступности всех ионогенных групп овальбумина для образования ионных пар с положительно заряженными аминогруппами хитозана. Такая ситуация возможна только в том случае, когда овальбумин в процессе комплексообразования подвергается денатурации и его конформация приобретает неупорядоченный характер. Термодинамические параметры конфор-мационного перехода макромолекул овальбумина в составе комплексов с хитозаном определены нами методом ДСК.
Термодинамическая стабильность овальбумина
Изучение влияния взаимодействия белков с различными лигандами на структуру и стабильность молекулы белка имеет важное фундаментальное и прикладное значение. Взаимодействие белков с ли-гандами часто приводит к изменению их термостабильности. Эти изменения являются следствием наложения процесса денатурации белка и процесса комплексообразования. Изменение стабильности белка коррелирует с изменением подвижности молекулы и, следовательно, с ее функционированием. Гидрофобно-гидрофильный баланс как нативной, так и денатурированной форм белков определяет их физико-химические и функциональные свойства. В процессе денатурации макромолекулы белка облегчается доступ к ее гидрофобным участкам, в результате чего происходит увеличение числа сайтов связывания с липофильными лигандами.
Проведено сравнительное исследование термодинамических параметров термоденатурации овальбумина в бинарных (белок-растворитель) и смешанных с хитозаном растворах (q0=0,07-0,6) при рН 6,0. Установлено, что удельная энтальпия (Ahd) и температура денатурации (Td) овальбумина, входящего в состав комплексного коацервата, полученного в области, непосредственно примыкающей к области эквивалентности зарядов (q0=0,07, C2=1,0%), резко понижаются в момент приготовления коацер-вата:
Ahd=21,47 Дж/г и Td=77,3 C (для нативного овальбумина);
Ahd=6,3 Дж/г и Td=76,5 C (для овальбумина в составе коацервата).
Такой характер изменения термодинамических параметров денатурации овальбумина свиде-
тельствует о значительной дестабилизации третичной структуры макромолекулы овальбумина, входящего в состав комплексного коацервата, что, в конечном счете, и обеспечивает образование сте-хиометрического комплекса. Следует отметить, что в условиях эксперимента происходит наложение эндотермического эффекта денатурации белка и экзотермического эффекта агрегирования молекул комплекса в результате денатурации овальбумина. Можно предположить, что определяющий вклад в понижение энтальпии денатурации вносят межмолекулярные взаимодействия белок-белок, как между частицами комплекса, так и между соседними глобулами, связанными с полисахаридной матрицей, так как подобный эффект наблюдается лишь при высокой степени заселенности цепи.
Известно, что образованию коацерватов предшествует стадия образования растворимых комплексов, поэтому представляло значительный интерес сравнить термодинамические параметры конформационного перехода свободного овальбу-мина и овальбумина, входящего в состав растворимых комплексов с хитозаном (табл.3). Комплексы смешения получали по стандартной методике, добавляя раствор овальбумина к равному объему раствора хитозана, при этом концентрация белка в смеси биополимеров была постоянной и составляла 0,4%, а весовая доля хитозана q0 возрастала от 0,1 до 0,6. Термограммы полученных комплексов прописывали дважды: сразу же после их получения и спустя неделю после хранения при 22оС. Все термограммы содержали эндотермические пики, соответствующие конформационному переходу молекулы овальбумина глобула-клубок.
Из таблицы 3 видно, что в области сосуществования растворимых и нерастворимых комплексов (q0 = 0,10) энтальпия и температура денатурации овальбумина в свежеприготовленных комплексах понижаются по сравнению с аналогичными параметрами для нативного овальбумина. Этот эффект свидетельствует о предпочтительном взаимодействии хитозана с денатурированной формой молекулы овальбумина [12]. Однако, понижение температуры и энтальпии денатурации в данных условиях не так велико, как в случае вышеописанного коацервата, полученного при q0=0,07 (вблизи точки эквивалентности). По мере увеличения доли вводимого в реакцию хитозана (q0=0,20-0,40) и, соответственно, увеличения в системе доли растворимого комплекса, температура денатурации выходит на постоянный уровень, в то время как энтальпия денатурации проходит через максимум, при этом значение Ahd в области максимума слегка превышает таковое для свободного овальбумина.
В результате хранения полученных комплексов происходят процессы углубления комплек-сообразования. Так, в области коацервации при q0=0,1 наблюдается дальнейшее понижение энтальпии денатурации Ahd от 17,6 до 12,7 Дж/г при практически неизменной температуре денатурации. При q0=0,2-0,3 Ahd возрастает, т.е. эти составы характеризуются более высокой долей упорядоченной кон-формации белка, возможно, в результате эффекта
исключенного объема макромолекул хитозана. Наконец, при ро=0,4-0,6 прозрачные растворы свежеприготовленных растворимых комплексов постепенно мутнеют вследствие образования нерастворимых комплексов, при этом наблюдается падение Д^, Этот эффект, весьма вероятно, является следствием явления диспропорционирования, проявляющегося в перераспределении макромолекул оваль-бумина с менее заселенных цепей хитозана на более высоко заселенные цепи вплоть до образования комплексов стехиометрического состава.
Таблица 3 - Зависимость термодинамических параметров конформационного перехода оваль-бумина от весовой доли хитозана в составе комплексов
Свежеприготовлен- Комплексы после
qo ные комплексы 7 суток хранения
Td, C Ahd, Дж/г Td, C Ahd, Дж/г
0 77,3 21,5 - -
0,1 74,7 17,6 74,7 12,7
0,2 74,5 23,0 74,1 25,5
0,3 74,4 22,7 74,5 23,1
0,4 74,4 22,5 74,2 14,8
0,6 74,9 16,6 74,2 10,7
С целью выяснения возможности использования получаемых комплексных коацерватов для стабилизации дисперсных систем нами изучены процессы эмульгирования гвоздичного масла в системе овальбумин-хитозан-вода. Для получения эмульсий, стабилизированных комплексными коа-церватами, мы использовали тот же алгоритм, что и при получении самих коацерватов, отличие состояло лишь в том, что раствор овальбумина добавлялся к раствору хитозана, уже содержащему диспергированное гвоздичное масло. В случае 33% эмульсии, стабилизированной комплексным коацерватом, полученным вблизи точки эквивалентности зарядов ^0=0,07, Се=2,00%), эффективность эмульгирования достаточно высока (83,1%), что создает предпо-
сылки для использования системы овальбумин-хитозан-вода для инкапсулирования гидрофобных веществ.
Заключение
Таким образом, в результате проведенных исследований установлены оптимальные условия препаративного получения комплексных коацерва-тов овальбумин-хитозан в водной среде и продемонстрирована возможность их использования для эффективной стабилизации эмульсий гвоздичного масла, что является предпосылкой успешного использования комплексных коацерватов овальбумин-хитозан для инкапсулирования липофильных веществ, в частности, эссенциальных масел.
Литература
1. М.А. Краюхина, Н.А. Самойлова, И.А. Ямсков, Успехи химии, 77, 9, 854-869 (2008)
2. T.A. Mrachkovskaya, A.S. Klemeshov, P.V. Yakimovich, I.G. Plashchina, II Moscow International Congress. Biotechnology: State of the Art and Prospects of Development (Moscow, Russia, November 10-14, 2003). Abstracts. Moscow, 2003, part 2. P. 117-118
3. T.A. Mrachkovskaya, N.A. Feoktistova, Yu.A. Glotova, I.G. Plashchina, VI Moscow International Congress. Biotechnology: State of the Art and Prospect of Development (Moscow, Russia, March 21-25, 2011). Abstracts. Moscow, 2011, part 2. P. 169-170
4. S.Yu, J. Hu, X. Pan, P. Yao, M. Jiang, Langmuir, 22, 27542759 (2006)
5. M. Bayomi, Drug Dev. Ind. Pharm, 30, 4, 329-339 (2004)
6. S. Nakai, E. Li-Chan, S. Hayakawa, Nahrung, 30, 327-336 (1986)
7. M. Rinaudo, G. Pavlov, J. Desbrieres, Polymer, 40, 70297032 (1999)
8. P. Job, Ann. Chim., 113-203 (1928)
9. В.А. Кабанов, Успехи химии, 74, 1, 5-23 (2005)
10. J.C. Masini, O.E.S. Godinho, L.M. Alexio, Fresenius J. Anal. Chem., 360,104-111 (1998)
11. Ч.Тенфорд, Физическая химия полимеров. Химия, Москва, 1965, С.486
12. T.V. Burova, N.V. Grinberg, V. Y. Grinberg, Y. C. Tang, G. Z. Zhang, A. R. Khokhlov, Macromol. Biosci, 9, 543-550
(2009).
© Т. А. Мрачковская - кандидат химических наук, старший научный сотрудник Института биохимической физики им. Н.М. Эмануэля, Москва, Россия, [email protected], Н. А. Феоктистова - аспирант Института биохимической физики им. Н.М. Эмануэля, Москва, Россия, И. Г. Плащина- кандидат химических наук, заведующий лабораторией Института биохимической физики им. Н.М. Эмануэля, Москва, Россия, Г. Е. Заиков - профессор кафедры ТПМ КНИТУ.
© T. A. Mrachkovskaya - Ph.D., Senior Researcher, Emanuel Institute of Biochemical Physics, Moscow, Russia, [email protected], N. A. Feoktistova - Post-Graduate Student, Emanuel Institute of Biochemical Physics, Moscow, Russia, 1 G. Plashchina - Ph.D., Head of Laboratory, Emanuel Institute of Biochemical Physics, Moscow, Russia G. E. Zaikov - professor of KNRTU plastics technology department.
