КОЛОНИЗАЦИЯ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ПРЯМОЙ КИШКИ МИКРООРГАНИЗМАМИ С МАРКЕРАМИ РЕЗИСТЕНТНОСТИ У ДЕТЕЙ С ОНКОГЕМАТОЛОГИЧЕСКИМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ Текст научной статьи по специальности «Клиническая медицина»

DOI: 10.32364/2618-8430-2021-4-1-90-97

Колонизация слизистой оболочки прямой кишки микроорганизмами с маркерами резистентности у детей с онкогематологическими заболеваниями

Л.Г. Боронина12, Е.В. Саматова2, М.П. Кукушкина2, С.А. Панова2, С.С. Устюгова2, А.Г. Асновская2

1ФГБОУ ВО УГМУ Минздрава России, Екатеринбург, Россия 2ГАУЗ СО «ОДК», Екатеринбург, Россия

РЕЗЮМЕ

Введение: одной из важных проблем современной медицины являются неуклонный рост числа инфекционных заболеваний, вызванных резистентными штаммами микроорганизмов, и снижение эффективности антимикробных препаратов, используемых для их лечения.

Цель исследования: изучить колонизацию слизистой оболочки кишечника представителями порядка Enterobacterales с продукцией в-лактамаз расширенного спектра (ESBL), устойчивыми к карбапенемам, Pseudomonas aeruginosa, устойчивыми к карбапенемам, и ванкомицин-резистентными Enterococcus фенотипическими и молекулярно-генетическими методами.

Материал и методы: исследование проведено в период с 10 декабря 2019 г. по 30 марта 2020 г. Проанализировано 150 проб (131 проба с фекалиями на условно-патогенную микрофлору, 19 — мазки со слизистой оболочки прямой кишки) от 66 пациентов, находившихся на лечении в онкогематологическом центре. Все образцы засевали на хромогенные селективные среды. Результаты исследования: всего выделено 67 штаммов представителей порядка Enterobacterales, 71 изолят энтерококков и 7 изолятов P. aeruginosa. Колонизация кишечного тракта энтеробактериями с продукцией ESBL выявлена у 17 (25,8%) пациентов. Доминирующими представителями были Е. coli (44,8% — 13 штаммов) и K. pneumoniae (34,5% — 10 штаммов). У 5 (7,6%) детей выделены одновременно два и более штаммов, продуцирующих ESBL: Е. coli + K. pneumoniae (n=2); Е. coli + E. cloacae (n=2); Е. coli + K. pneumoniae + E. cloacae (n=1). Колонизация кишечного тракта ванкомицин-резистентными энтерококками выявлена у 18 (27,3%) пациентов, преимущественно выделялся E. faecium. У9 (13,6%) пациентов обнаруживались ванкомицин-резистентный энтерококк и энтеробактерия с продукцией ESBL. Штаммы с фенотипом множественной резистентности к антимикробным препаратам выделены среди Е. coli (n=1), K. pneumoniae (n=3), P. aeruginosa (n=1).

Заключение: по результатам проведенного исследования колонизация одним микроорганизмом с маркерами резистентности определялась у каждого 4-го (25,8—27,3%) пациента, двумя микроорганизмами — почти у каждого 7-го (13,6%). Среди энтеробак-терий преобладали Е. coli и K. pneumoniae, среди энтерококков — E. faecium. Хромогенные агары предназначены для исследования образцов от больных, и при их использовании заключение о наличии микроорганизмов с соответствующим маркером резистентности может быть выдано уже через 24 ч от момента поступления образцов в лабораторию.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: мониторинг, колонизация, маркер резистентности, микроорганизмы, дети, онкогематологические заболе-

ДЛЯ ЦИТИРОВАНИЯ: Воронина Л.Г., Саматова Е.В., Кукушкина М.П. и др. Колонизация слизистой оболочки прямой кишки микроорганизмами с маркерами резистентности у детей с онкогематологическими заболеваниями. РМЖ. Мать и дитя. 2021;4(1):90— 97. DOI: 10.32364/2618-8430-2021-4-1-90-97.

Colonization of rectal mucosa by microbes with antibiotic resistance markers in children with hematological malignancies

Background: the steadily increasing occurrence of the infections caused by antibiotic-resistant germs and the reduction in the efficacy of antimicrobials is one of the important issues of modern medicine.

Aim: to study the colonization of rectal mucosa by extended-spectrum beta-lactamase (ESBL) — producing carbapenem-resistant Enterobacterales, carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa, and vancomycin-resistant Enterococci using phenotypic methods and gene tests.

Patients and Methods: this study was performed from December 10, 2019, to March 30, 2020. 150 samples (131 fecal specimens and 19 rectal swabs) collected from 66 patients who were admitted to the Hematological Center were examined. All samples were inoculated into selective chromogenic media.

Results: 67 strains of Enterobacterales, 71 Enterococci, and 7 P. aeruginosa were isolated. Rectal colonization by ESBL-producing Enterobacterales was identified in 17 patients (25.8%). E. coli (13 strains, 44,8%) and K. pneumoniae (10 strains, 34,5%) prevailed.

L.G. Boronina12, E.V. Samatova2, M.P. Kukushkina2, S.A. Panova2, S.S. Ustyugova2, A.G. Asnovskaya2

2

1Ural State Medical University, Yekaterinburg, Russian Federation 2Regional Children's Clinical Hospital, Yekaterinburg, Russian Federation

ABSTRACT

In 5 children, two or more ESBL-producing strains were isolated, i.e., E. coli plus K. pneumoniae (n=2), E. coli plus E. cloacae (n=2), and E. coli plus K. pneumoniae plus E. cloacae (n=1). The colonization by vancomycin-resistant Enterococci (predominantly E. faecium) was identified in 18 patients (27.3%). Vancomycin-resistant Enterococci plus ESBL-producing Enterobacterales were isolated in 9 patients (13.6%). Multidrug-resistant strains were isolated among E. coli (n=1), K. pneumoniae (n=3), and P. aeruginosa (n=1).

Conclusions: our findings demonstrate that the colonization by one and two antibiotic-resistant microbe was seen in every forth patient (25.8— 27.3%) and every seventh patient (13.6%), respectively. E. coli and K. pneumoniae prevailed among Enterobacterales and E. faecium prevailed among Enterococci. Chromogenic agars are designed to examine the specimens collected from patients. Antibiotic-resistant microbes may be identified 24 hours after receiving specimen at a laboratory when using these media.

KEYWORDS: monitoring, colonization, resistance marker, microorganisms, children, hematological malignancies.

FOR CITATION: Boronina L.G., Samatova E.V., Kukushkina M.P. et al. Colonization of rectal mucosa by microbes with antibiotic resistance markers in children with hematological malignancies. Russian Journal of Woman and Child Health. 2021;4(1):90—97. DOI: 10.32364/26188430-2021-4-1-90-97.

Введение

Одной из важных проблем современной медицины являются неуклонный рост числа инфекционных заболеваний, вызванных резистентными штаммами микроорганизмов, и снижение эффективности антимикробных препаратов, используемых для их лечения. Развитие резистентности к антимикробным препаратам у возбудителей заболеваний требует использования альтернативных, нередко менее безопасных и эффективных антимикробных препаратов, что снижает качество оказания медицинской помощи. Мониторинг чувствительности/устойчивости штаммов в популяции бактерий, определенной одним из регламентированных методов (диско-диффузионным методом, определением минимальной подавляющей концентрации в различных вариантах), является важнейшим элементом медицинской практики. Инфекции, вызываемые полирезистентными бактериями и связанные с оказанием медицинской помощи, признаны глобальной проблемой. Результаты исследований, проведенных в Российской Федерации в последние годы, показали, что в этиологической структуре инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи, к ведущим возбудителям относятся Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumanii, а также Enterococcus faecalis и Enterococcus faecium [1]. Перечисленные микроорганизмы находятся под пристальным вниманием Европейской системы надзора за антибиотикорезистентностью (EARS-Net). К наиболее проблемным возбудителям с позиций выбора адекватной терапии относят: метициллино-резистентные штаммы S. aureus; устойчивые к цефало-споринам расширенного спектра и карбапенемам штаммы K. pneumoniae и E. coli; резистентные к карбапенемам штаммы P. aeruginosa и A. baumannii; устойчивые к ванкомицину штаммы E. faecalis и E. faecium.

Изучение механизмов резистентности микроорганизмов к антимикробным препаратам может проводиться с использованием как фенотипических (хромогенные среды, определение чувствительности к конкретным антимикробным препаратам диско-диффузионным методом или определение минимальной подавляющей концентрации в различных вариантах), так и молекулярно-генетических (детекция генов, ответственных за конкретные механизмы резистентности) методов [2].

С одной стороны, энтеробактерии являются представителями нормальной микрофлоры кишечника человека, с другой — могут быть возбудителями тяжелых как внебольничных, так и внутрибольничных инфекций. Бактерии, входящие в порядок Enterobacterales, коло-

низирующие кишечник, являются носителями генов как природной, так и приобретенной антибиотикорезистент-ности, которые могут передаваться от резистентных штаммов к чувствительным [3]. Частота обнаружения энтеробактерий с продукцией р-лактамаз расширенного спектра (Extended-spectrum beta-lactamase, ESBL) превышает 50% в большинстве стран мира [4]. Другими представителями нормальной микрофлоры кишечника являются энтерококки, которые становятся опасными при приобретении генов, ответственных за резистентность к ванкомицину. Колонизация слизистой оболочки кишечника ванкомицин-резистентными энтерококками (VRE) может сохраняться длительное время, от нескольких месяцев до нескольких лет [5].

Современные программы химиотерапии позволяют достичь высокой общей выживаемости у онкогематологи-ческих больных, но при этом увеличивается риск тяжелых инфекционных осложнений, частота которых достигает 80-90%. К данным осложнениям относится бактериемия, зачастую вызванная бактериями, обладающими каким-либо механизмом (маркером) резистентности: у энтеробакте-рий с высокой частотой встречаются изоляты, продуценты ESBL (43%), а у энтерококков — ванкомицин-резистентные штаммы (9%) [5-7].

В развитии инфекционных осложнений у больных, в первую очередь онкогематологических, преобладает эндогенный путь инфицирования, при котором бактерии со слизистой оболочки кишечника проникают в кровоток. В связи с этим микробиологический мониторинг слизистой оболочки кишечника у онкогематологических больных является неотъемлемой частью системы инфекционного контроля, позволяющей следить за циркуляцией возбудителей инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи, изменениями в их структуре, тенденциями развития устойчивости к антимикробным препаратам.

Цель исследования: изучить колонизацию слизистой оболочки кишечника представителями порядка Enterobacterales с продукцией ESBL, устойчивыми к карба-пенемам, Pseudomonas aeruginosa, устойчивыми к карбапенемам, и ванкомицин-резистентными Enterococcus фе-нотипическими и молекулярно-генетическими методами.

Материал и методы

Исследование проведено в период с 10 декабря 2019 г. по 30 марта 2020 г. Проанализировано 150 проб (131 проба с фекалиями на условно-патогенную микрофлору, 19 — мазки со слизистой оболочки прямой кишки) от 66 паци-

ентов, находившихся на лечении в онкогематологическом центре ГАУЗ СО «ОДКБ». В исследование были включены дети в возрасте от 3 мес. до 16 лет (до года — 7 детей, от года до 7 лет — 26, от 7 лет до 10 лет — 14, от 11 лет до 16 лет — 19) с диагнозами: острый лимфобластный лейкоз (n=17), нейробластома (n=6), острый миелоидный лейкоз (n=4), апластическая анемия (n=5), острый лейкоз (n=4), остео-саркома Юинга (n=3), гистиоцитоз (n=3), прочие (n=24). Соотношение мальчиков (n=27) и девочек (n=39) 1:1,4. Пациенты находились в отделении анестезиологии, реанимации и трансплантологии костного мозга (n=18), отделениях детской онкологии № 1 (n=8) и № 2 (n=18), детской онкологии и гематологии (n=13), и 9 пациентов переходили в реанимацию или, наоборот, из реанимации с учетом их состояния. Кратность обследования пациентов следующая: 1 проба — 35 пациентов; 2 пробы — 14; 3 пробы — 4; 4 пробы — 5; 5 проб — 5; 6, 7 и 15 проб — по одному пациенту.

Материал забирали и транспортировали в соответствии с методическими указаниями МУ 4.2.2039-05 [8].

Все пробы засевали на хромогенные селективные среды: «CHROMagar™ ESBL», «CHROMagar™ KPC», «CHROMagar™ VRE» (CHROMagar, Франция), затем инкубировали в термостате при температуре 36 °C в течение 18-24 ч. Среда «CHROMagar™ ESBL» предназначена для прямого выделения энтеробактерий с продукцией ESBL, «CHROMagar™ KPC» — для прямого обнаружения резистентных к карбапенемам грамотрицательных бактерий, «CHROMagar™ VRE» — для выявления и идентификации ванкомицин-ре-зистентных штаммов Enterococcus (E. faecalis, E. faecium). Посев фекалий на условно-патогенную микрофлору проводили на среды Плоскирева, Эндо, Сабуро, желточно-со-левой агар, 5% кровяной агар, висмут-сульфит агар (после 24-часового накопления на магниевой среде). Мазки со слизистой оболочки прямой кишки исследовали на среде Эндо. Идентификацию микроорганизмов проводили классическим бактериологическим методом, а также на полуавтоматическом анализаторе «ATB Expression» (bioMerieux, Франция) и автоматическом анализаторе «Phoenix M50» (Becton Dickinson, США).

Продукцию ESBL у энтеробактерий, полученных на хро-могенной селективной среде «CHROMagar™ ESBL», подтверждали методом «двойных дисков». Резистентность к карбапенемам у грамотрицательных бактерий, и в частности у K. pneumoniae, продуцирующей карбапенемазы (Klebsiella pneumoniae carbapenemase — KPC), полученных на хромогенной селективной среде «CHROMagar™ KPC», доказывали определением резистентности к соответствующим карбапенемам диско-диффузионным методом. Резистентность к ванкомицину у энтерококков, полученных на хромогенной селективной среде «CHROMagar™ VRE», подтверждали определением резистентности к ванкомици-ну диско-диффузионным методом.

Постановку и оценку антибиотикочувствительности диско-диффузионным методом проводили на агаре Мюллера — Хинтона (Sifin diagnostics with passion, Германия) в соответствии с действующей нормативной документацией [9, 10]. Для выявления штаммов с множественной лекарственной резистентностью все изоляты, дающие рост на хромогенных средах, тестировали также на чувствительность к другим классам антибиотиков (табл. 1). В связи с изменениями в интерпретации результатов определения зон задержки роста в клинических рекомендациях в версии 2018-03 [9] и рекомендациях EUCAST (European

Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) в версии 10.0, 2020 [10], которые внедрены с марта 2020 г., в таблице 1 указаны изменения в оценке результатов резистентно -сти к антибиотикам.

Для выявления продукции карбапенемаз без их дифференциации у P. aeruginosa и представителей порядка Enterobacterales применяли фенотипический метод инактивации карбапенемов (Carbapenem Inactivation Method, CIM) [11].

Молекулярно-биологическая детекция генов, кодирующих карбапенемазы у штамма Hafnia alvei, осуществлялась методом мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени с использованием наборов реагентов «АмплиСенс® MDR MBL-FL» и «АмплиСенс® MDR KPC/OXA-48-FL» (ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия). Выявлялись гены, кодирующие приобретенные сериновые карбапенемазы групп KPC и OXA-48-подобных (OXA-48 и OXA-162) и металло-бета-лактамазы с карбапенемазной активностью групп VIM, IMP и NDM.

Результаты и обсуждение

Всего выделено 67 штаммов представителей порядка Enterobacterales, 71 изолят энтерококков и 7 изолятов P. aeruginosa (табл. 2).

За исследуемый период было обследовано 66 детей. У 17 пациентов роста энтеробактерий, энтерококков, P. aeruginosa не обнаружено. У 26 пациентов зарегистрирована колонизация кишечника одним или несколькими штаммами вышеперечисленных бактерий. У 9 пациентов при первых обследованиях роста не выявлено, затем имело место заселение кишечника: у 44,4% произошла колонизация нормофлорой, не обладающей изучаемыми механизмами резистентности (E. faecalis, Enterococcus spp., E. coli), у 44,4% — резистентной флорой (E. faecium, H. alvei, P. aeruginosa), у 11,2% — при первоначальной колонизации нормофлорой из-за длительно проводимой терапии произошла смена на ванкомицин-резистентный E. faecium. У 6 пациентов при первичной колонизации кишечника преимущественно штаммами, не обладающими антибиотикорезистентностью, за исключением одного пациента с E. coli с продукцией ESBL, на фоне проводимой антибиотикотерапии рост данных микроорганизмов перестал обнаруживаться. У 6 пациентов произошла смена вида колонизирующего микроорганизма, на фоне постоянно выделяющегося ванкомицин-резистентного E. faecium или E. coli с продукцией ESBL менялись штаммы других видов энтеробактерий или энтерококков. У 2 пациентов внутри одного и того же чувствительного вида микроорганизма произошла селекция и колонизация резистентными штаммами: в первом случае место ванкомицин-чувствитель-ного штамма E. faecium занял ванкомицин-резистентный, во втором — место карбапенем-чувствительного штамма P. aeruginosa занял резистентный штамм.

Пятнадцать пациентов на момент обследования не получали антибиотикотерапию, у них кишечник был колонизирован преимущественно штаммами без маркеров резистентности. Остальные пациенты получали минимум один антибиотик, схема применяемого лечения зависела от диагноза основного заболевания, тяжести и стадии болезни, а также наличия осложнений.

Таблица 1. Оценка пограничных зон подавления роста для интерпретации результатов определения чувствительности Table 1. Assessment of growth inhibition zones to interpret the results of antibiotic susceptibility testing

Антибиотик Содержание антибиотика в диске, мкг Диаметр зоны, мм (согласно [9]) Diameter of zone, mm [9] Диаметр зоны, мм (согласно [10]) Diameter of zone, mm [10]

Antibiotic Concentration of antibiotic in the disc, ^g Ч> / S> Р< / R< Ч> / S> Р< / R<

Представители порядка Enterobacterales / Enterobacterales

Пенициллины с ингибиторами |3-лактамаз: Penicillin plus p-lactamase inhibitors: амоксициллин-клавулановая кислота amoxicillin-clavulanic acid пиперациллин-тазобактам piperacillin-tazobactam 20-10 30-6 19 20 19 17 19 20 19 17

Цефалоспорины: / Cephalosporins: цефотаксим / cefotaxime цефтазидим / ceftazidime 5 10 20 22 17 19 20 22 17 19

Аминогликозиды: / Aminoglycosides: гентамицин / gentamycin амикацин / amikacin 10 30 17 18 14 15 17 18 17 18

Карбапенемы: / Carbapenems: эртапенем / ertapenem меропенем / meropenem имипенем / imipenem 10 10 10 25 22 22 22 16 16 25 22 22 25 16 17

Фторхинолоны: / Fluoroquinolones: ципрофлоксацин / ciprofloxacin 5 26 24 25 22

P. aeruginosa

Пенициллины с ингибиторами |3-лактамаз: Penicillin plus p-lactamase inhibitors: пиперациллин-тазобактам Piperacillin-tazobactam 30-6 18 18 50 18

Цефалоспорины: / Cephalosporins: цефтазидим / Ceftazidime 10 17 17 50 17

Аминогликозиды: / Aminoglycosides: амикацин / amikacin 30 18 15 15 15

Карбапенемы: / Carbapenems: меропенем / meropenem имипенем / imipenem 10 10 24 20 18 17 24 50 18 20

Фторхинолоны: / Fluoroquinolones: ципрофлоксацин / ciprofloxacin 5 26 26 50 26

Enterococcus spp.

Пенициллины: / Penicillins: ампициллин / ampicillin 2 10 8 10 8

Аминогликозиды: / Aminoglycosides: гентамицин / gentamycin стрептомицин / streptomycin 30 300 8 14 8 14 8 14 8 14

Фторхинолоны: / Fluoroquinolones: норфлоксацин / norfloxacin 10 12 12 12 12

Гликопептиды: / Glycopeptides: ванкомицин / vancomycin 5 12 12 12 12

Оксазолидиноны: / Oxazolidinones: линезолид / linezolid 10 19 19 20 20

Примечание. Ч — чувствительные, Р — резистентные. Note. S, susceptible; R, resistant.

Все штаммы порядка Enterobacterales, рода Enterococcus и P. aeruginosa, не дающие рост на соответствующих средах «CHROMagar™», не тестировались на чувствительность к антимикробным препаратам. При повторном выделении у пациентов изолятов микроорганизмов, дающих рост на средах «CHROMagar™», чувствительность к антибиотикам не определяли. Чувствительность энтеробактерий, эн-

терококков и синегнойной палочки к антимикробным препаратам представлена в таблицах 3-5.

E. coli типичная, с гемолитическими свойствами и лактозонегативная объединены в одну группу, так как интерпретация антибиотикочувствительности не зависит от морфологических и биохимических свойств кишечной палочки. У всех штаммов энтеробактерий, выросших

Таблица 2. Спектр видов энтеробактерий и энтерококков Table 2. The spectrum of Enterobacterales and Enterococcus spp.

Вид микроорганизма Всего штаммов Без механизмов резистентности / нормобиота / не давших рост на хромогенных средах Рост на средах «CHROMagar™» Growth on CHROMagar™

Species Strains, in total No mechanisms or resistance / normobiota / no growth onto chromogenic media ESBL KPC VRE

E. coli 25 16 9 О -

E. coli гемолитическая / Hemolytic E. coli 6 5 1 О -

E. coli лактозонегативная / Lactose-negative E. coli 7 3 4 О -

K. pneumoniae 14 4 1О 2 -

Klebsiella oxytoca 1 1 О О -

Morganella morganii 1 1 О О -

Enterobacter aerogenes 3 3 О О -

Enterobacter cloacae 7 3 4 О -

Citrobacter koseri 1 О 1 О -

Havnia alvei 2 - 2 О -

Enterococcus spp. 3О 26 - - 4

E. faecalis 11 11 - - О

E. faecium 3О 1 - - 29

P. aeruginosa 7 4 - 3 -

Таблица 3. Распределение штаммов энтеробактерий по категории чувствительности Table 3. Susceptibility of Enterobacterales

Антибиотик Antibiotic E. ooli (n=13) K. pneumoniae (n=6) E. cloacae (n=4) C. koseri (n=1) H. alvei (n=1)

Ч / S У-Р/У / M/S-l Р / R Ч / S У-Р/У / M/S-l Р / R Ч / S Р / R Ч / S Р / R Ч / S Р / R

Амоксициллин-клавулановая кислота Amoxicillin-clavulanic acid 7 1 5 О О 6 О 4 О 1 О 1

Пиперациллин-тазобактам Piperacillin-tazobactam 3 О 1 2 О 2 1 О 1 О О 1

Цефотаксим / Cefotaxime О О 13 О О 6 О 4 О О 1

Цефтазидим / Ceftazidime О О 13 О О 6 О 4 О О 1

Гентамицин / Gentamycin 6 О 7 1 О 5 2 2 О 1 О

Амикацин / Amikacin 12 О 1 1 2 3 2 2 О 1 О

Эртапенем / Ertapenem 9 О 4 2 О 4 3 1 О О 1

Меропенем / Meropenem 4 О О 4 1 1 1 О 1 О О 1

Имипенем / Imipenem 4 О О 4 1 1 1 О 1 О О 1

Ципрофлоксацин / Ciprofloxacin S 1 4 О 1 5 4 О 1 О 1 О

Примечание. Здесь и в табл. 4,5: Ч — чувствительные, У-Р — умеренно-резистентные, У — чувствительные при увеличенной экспозиции, Р — резистентные.

Note. Here and in table 4 and table 5: S, susceptible; M, moderately susceptible; S-I, susceptible, increased exposure strains; R, resistant.

на хромогенной среде «CHROMagar™ ESBL», продукция ESBL подтверждена методом «двойных дисков»: у E. coli, K. pneumoniae, C. koseri путем использования дисков с цеф-тазидимом (10 мкг) и цефотаксимом (5 мкг) и диска, содержащего комбинацию амоксициллина с клавулановой кислотой (20-10 мкг), а у энтеробактерий с индуцибельны-ми хромосомными AmpC: E. cloacae, H. alvei в дополнение к этому определялось наличие синергизма между диском цефепима (30 мкг) и диском, содержащим комбинацию амоксициллина с клавулановой кислотой (20-10 мкг) [12]. Два штамма K. pneumoniae, резистентных к карбапене-

мам и давших рост на среде «CHROMagar™ KPC», продуцировали ESBL и выросли на среде «CHROMagar™ ESBL». Резистентность к карбапенемам у продуцентов ESBL описана также рядом исследователей и может быть связана с комбинацией продукции ESBL и снижением проницаемости внешней мембраны [3].

При определении чувствительности к карбапенемам у представителей порядка Enterobacterales диско-диффузионным методом в первую очередь тестировали эртапе-нем как наиболее чувствительный к карбапенемазам антибиотик этой группы, но данный антимикробный препарат

Таблица 4. Распределение штаммов энтерококков по категории чувствительности Table 4. Susceptibility of Enterococci

Антибиотик Antibiotic E. faecium Enterococcus spp. (n=16) (n=3)

Ч/S Р/R Ч/S Р/R

Ампициллин / Ampicillin 0 16 0 3

Гентамицин / Gentamycin 0 16 0 3

Стрептомицин / Streptomycin 12 4 3 -

Норфлоксацин / Norfloxacin 1 15 0 3

Ванкомицин / Vancomycin 0 16 0 3

Линезолид / Linezolid 16 0 3 0

Таблица 5. Распределение штаммов P. aeruginosa по категории чувствительности (n=3)

Table 5. Susceptibility of P. aeruginosa

Антибиотик Antibiotic Ч/S У-Р/У/M/S-I Р/R

Пиперациллин-тазобактам Piperacillin-tazobactam 1 1 1

Цефтазидим / Ceftazidime 1 0 2

Амикацин / Amikacin 2 0 1

Меропенем / Meropenem 0 0 3

Имипенем / Imipenem 0 0 3

Ципрофлоксацин Ciprofloxacin 3 0 0

обладает меньшей специфичностью, поэтому изоляты, обладающие ESBL и AmpC, могут проявлять устойчивость к нему и в отсутствие карбапенемаз [12]. При выявлении умеренной резистентности или резистентности к эртапе-нему определялась чувствительность к меропенему и ими-пенему, для обнаружения карбапенемаз класса А ставили дополнительно диск с пиперациллином-тазобактамом, а также проводили CIM-тест. По результатам нашего исследования, если штамм энтеробактерий был только резистентен к эртапенему, он не давал роста на среде «CHROMagar™ KPC». Только у одного штамма K. pneumoniae CIM-тест был положительный, и он был резистентен к имипенему, меро-пенему, эртапенему, пиперациллину-тазобактаму, в данном случае, скорее всего, имела место продукция карбапенемаз класса А. У второго штамма K. pneumoniae CIM-тест был отрицательный, он резистентен к эртапенему, пиперацил-лину-тазобактаму и чувствителен при увеличенной экспозиции (ранее считался умеренно-резистентным) к имипене-му и меропенему, скорее всего, в данном случае продукции карбапенемаз не было, а было снижение проницаемости внешней мембраны или имел место другой механизм [3]. Все остальные штаммы энтеробактерий, резистентные к эртапенему, были чувствительны к меропенему и имипе-нему, CIM-тест отрицателен.

Интересным представляется изолят H. alvei, резистентный к имипенему, меропенему, эртапенему, пипера-циллину-тазобактаму, при этом, скорее всего, имели место продуцируемые карбапенемазы класса А. Культура не дала роста на среде «CHROMagar™ KPC», но согласно инструкции к данной среде она рассчитана на карбапе-нем-резистентные штаммы E. coli, группу KEC (Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter), Pseudomonas, Acinetobacter, Stenotrophomonas. У H. alvei CIM-тест отрицательный. Данный штамм был тестирован на гены резистентности методом ПЦР в реальном времени. Использованными нами ПЦР-наборами не определены гены резистентности: VIM, IMP, NDM, KPC, OXA-48, 162. Ни один фенотипиче-ский метод не обладает 100% чувствительностью. По данным литературы, чувствительность CIM-теста составляет 82% [13, 14]. Существует модификация CIM-теста, разработанная с целью повышения его чувствительности, когда при приготовлении суспензии тестируемого изолята стерильную дистиллированную воду или 0,9% физиологический раствор заменяют на триптиказо-соевый бульон,

что, с одной стороны, повышает чувствительность до 93%, но, с другой стороны, удорожает методику, поэтому она не используется в рутинной практике [14]. Наличие умеренно активных ферментов (карбапенемаз), в частности типа OXA-48, снижает чувствительность их определения [14]. Кроме того, при постановке CIM-теста необходимо строгое соблюдение методики — 24-часовое тестирование культуры и контрольных штаммов. В настоящее время «золотым стандартом» обнаружения продуцентов карбапенемаз являются молекулярные методы [14]. Однако разрешенные к применению в нашей стране ПЦР-наборы не включают весь спектр генов, ответственных за выработку карбапенемаз различных классов, поэтому точный механизм резистентности к карбапенемам у H. alvei выяснить не удалось.

В нашем исследовании колонизация кишечного тракта энтеробактериями с продукцией ESBL выявлена у 17 (25,8%) пациентов. Доминирующими представителями были Е. coli (44,8% — 13 штаммов) и K. pneumoniae (34,5% — 10 штаммов). У 5 (7,6%) детей выделены одновременно два и более штаммов, продуцирующих ESBL: Е. coli + K. pneumoniae (n=2); Е. coli + E. cloacae (n=2); Е. coli + K. pneumoniae + E. cloacae (n=1).

Существует два типа ванкомицин-резистентности. Первый тип, когда бактерия несет гены резистентности (главным образом типа VanC, а также VanD, VanE, VanF и т. д.), характерен для Enterococcus gallinarum, Enterococcus casseliflavus и Enterococcus flavescens, уровень резистентности в этом случае низкий. При втором типе имеет место приобретенная резистентность (типы VanA и VanB), часто обнаруживаемая у E. faecium и E. faecalis. Поэтому, чтобы вовремя обнаружить резистентные штаммы и предотвратить распространение резистентности, крайне важно детектировать VRE и дифференцировать их от других энтерококков.

В нашем исследовании колонизация кишечного тракта ванкомицин-резистентными энтерококками, преимущественно E. faecium, выявлена у 18 (27,3%) пациентов. У 9 (13,6%) пациентов обнаруживался ванкомицин-рези-стентный энтерококк и энтеробактерия с продукцией ESBL.

У всех протестированных штаммов P. aeruginosa (n=3) продукция карбапенемазы фенотипическим методом (CIM) не выявлена, что, скорее, свидетельствует о других механизмах резистентности к карбапенемам.

Часто штаммы грамотрицательных бактерий имеют фенотип множественной резистентности к антимикробным препаратам (multiple drug resistanc, MDR), как минимум к трем препаратам, относящимся к различным категориям/классам антимикробных препаратов [15]. В нашем исследовании такие штаммы были среди Е. coli (n=1), K. pneumoniae (n=3), P. aeruginosa (n=1).

Несмотря на значительные успехи, достигнутые в онко-гематологии, инфекционные осложнения остаются одной из причин, ухудшающих прогноз при оказании высокотехнологичной помощи. В связи с этим необходима система надзора за ведущими возбудителями госпитальных инфекций и их резистентностью к антимикробным препаратам — микробиологический мониторинг, который позволит: 1) своевременно выявлять госпитальные штаммы микроорганизмов и разрабатывать стратегию и тактику борьбы с ними; 2) своевременно корректировать лекарственный формуляр на основе организации рационального взаимодействия клинических фармакологов, сотрудников лаборатории клинической микробиологии и госпитальных эпидемиологов; 3) активно выявлять пациентов с риском инфицирования, связанного с оказанием медицинской помощи.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, на основании фенотипических и мо-лекулярно-генетических исследований штаммов со слизистой толстого кишечника от пациентов, находящихся на лечении в онкогематологическом центре, практически у каждого 4-го (25,8-27,3%) определялась колонизация слизистой оболочки кишечника микроорганизмом с маркером устойчивости, и почти у каждого 7-го (13,6%) больного обнаружено 2 микроорганизма с маркерами резистентности. Среди энтеробактерий преобладали Е. coli и K. pneumoniae, среди энтерококков — E. faecium. Применение хромогенных сред для исследования образцов со слизистой кишечника позволило сделать заключение о наличии микроорганизмов с соответствующим маркером резистентности уже через 24 ч от момента поступления образцов в лабораторию. Информирование онкологов о колонизации резистентными бактериями слизистой кишечника позволяет корректировать назначение антибактериальной терапии на различных этапах лечения, в т. ч. у больных, перенесших трансплантацию костного мозга.

Литература

1. Кафтырева Л.А., Зуева Л.П., Колосовская Е.Н. и др. Принципы организации мониторирования устойчивости ведущих возбудителей инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи, к антимикробным препаратам в лечебно-профилактических медицинских организациях здравоохранения. Федеральные клинические рекомендации. М.; 2014.

2. Гончаров А.Е., Зуева Л.П., Колоджиева В.В. и др. Молекулярно-ге-нетический мониторинг в системе эпидемиологического надзора за инфекциями, связанными с оказанием медицинской помощи. Федеральные клинические рекомендации. М.; 2014.

3. Шилова А.Н., Ильина В.Н., Субботовская А.И. и др. Характеристика энтеробактерий с множественной резистентностью, колонизирующих кишечный тракт у детей раннего возраста с врожденными пороками сердца при поступлении в кардиохирургический стационар. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2016;18(1):68-74.

4. Клясова Г.А., Коробова А.Г., Фролова И.Н. и др. Детекция энтеробактерий с продукцией бета-лактамаз расширенного спектра у больных острыми миелоидными лейкозами и лимфомами при поступлении в стационар. Гематология и трансфузиология. 2016;61(1):25—32.

5. Федорова А.В., Клясова Г.А. Использование селективной хромо-генной среды для детекции ванкомицинрезистентных энтерококков. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2018;20(1):55—61. DOI: 10.36488/cmac.2018.1.55-61.

6. Коробова А.Г., Клясова Г.А. Энтеробактерии с продукцией в-лак-тамаз расширенного спектра: источники инфицирования и значение колонизации слизистой оболочки кишечника у больных гемобласто-зами. Гематология и трансфузиология. 2018 63 (2):174-183.

7. Коробова А.Г. Мониторинг энтеробактерий с продукцией бета-лак-тамаз расширенного спектра, выделенных у больных с гемобластоза-ми при химиотерапии: дис. ... канд. мед. наук. М.; 2018.

8. Техника сбора и транспортирования биоматериалов в микробиологические лаборатории. Методические указания 4.2.2039-05. М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России; 2005.

9. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. Межрегиональная ассоциация по клинической микробиологии и антимикробной химиотерапии. Клинические рекомендации. М.; 2018.

10. Европейский комитет по определению чувствительности к антимикробным препаратам. Таблицы пограничных значений для интерпретации значений МПК и диаметров зон подавления роста. Версия 10.0, 2020. (Электронный ресурс.) URL: http://www.eucast.org. (дата обращения: 21.05.2020).

11. Zwaluw K., Haan A., Pluister G.N. et al. The Carbapenem Inactivation Method (CIM), a Simple and Low-Cost alternative for Carba NP Test to Assess Phenotypic Carbapenemase Activity in Gram Negative Rjds. PLos One. 2015;10(3):е0123690. DOI: 10.1371/journal.pone.0123690.

12. Руководство EUCAST по выявлению механизмов резистентности и резистентности, имеющей особое клиническое и/или эпидемиологическое значение. Версия 2.0, 2017. [EUCAST Guidelines for the identification of resistance and resistance mechanisms of particular clinical and / or epidemiological significance. Version 2.0, 2017 (in Russ.)].

13. Гаязова Д. Выявление микроорганизмов, продуцирующих кар-бапенемазы. (Электронный ресурс.) URL: https://fedlab.ru/upload/ medialibrary/000/prezentatsii-/prezentatsii-samara/%D0%93%D0%B0 %D1%8F%D0%B7%D0%BE%D0%B2%D0%B0.pdf (дата обращения: 21.05.2020).

14. Попов Д.А. Сравнительная характеристика современных методов определения продукции карбапенемаз. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия; 2019;21(2):125-133. DOI: 10.36488/ cmac.2019.2.125-133.

15. Полищук А.Г., Якубович Е.И., Полухина О.В. и др. Карбапенема-зопродуцирующие грамотрицательные бактерии в специализированном стационаре ФГБУ «Российский научный центр радиологии и хирургических технологий Санкт-Петербурга». Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2017;19(3):235-242.

References

1. Kaftyreva L.A., Zueva L.P., Kolosovskaya E.N. et al. The principles of monitoring the resistance of leading pathogens of infections associated with the provision of medical care to antimicrobial agents in medical and preventive health care organizations. Federal clinical guidelines. M.; 2014 (in Russ.).

2. Goncharov A.E., Zueva L.P., Kolodzhieva V.V. et al. Molecular genetics monitoring in the system of epidemiological surveillance of infections associated with the provision of medical care. Federal clinical guidelines. M.; 2014 (in Russ.).

3. Shilova A.N., Ilyina V.N., Subbotovskaya A.I. et al. Characterization of enterobacteria with multiple resistance colonizing the intestinal tract in young children with congenital heart defects upon admission to a cardiosurgical hospital. Clinical microbiology and antimicrobial chemotherapy. 2016;18(1):68-74 (in Russ.).

4. Klyasova G.A., Korobova A.G., Frolova I.N. et al. Detection of enterobacteria with the production of extended-spectrum beta-lactamases in patients with acute myeloid leukemia and lymphomas upon admission to the hospital. Hematology and transfusiology. 2016;61(1):25-32 (in Russ.).

5. Fedorova A.V., Klyasova G.A. The use of selective chromogenic medium for the detection of vancomycin-resistant enterococci. Clinical Microbiology and Antimicrobial Chemotherapy. 2018;20(1):55-61 (in Russ.). DOI: 10.36488/cmac.2018.1.55-61.

6. Korobova A.G., Klyasova G.A. Enterobacteria with the production of extended-spectrum ß-lactamases: sources of infection and the importance of colonization of the intestinal mucosa in patients with hemoblastoses. Hematology and transfusiology. 2018;63(2):174-183 (in Russ.).

7. Korobova A.G. Monitoring of enterobacteria with the production of extended-spectrum beta-lactamases isolated in patients with hemoblastoses during chemotherapy: Thesis. M.; 2018 (in Russ.).

8. The technique of collecting and transporting biomaterials in microbiological laboratories. Guidelines 4.2.2039-05. M.: Federal Center for Sanitary Inspection of the Ministry of Health of Russia; 2005 (in Russ.).

9. Determination of the sensitivity of microorganisms to antibacterial drugs. Interregional Association of Clinical Microbiology and Antimicrobial Chemotherapy. Clinical recommendations. M.; 2018 (in Russ.).

10. European Committee for the Determination of Antimicrobial Susceptibility. Tables of boundary values for the interpretation of IPC values and diameters of zones of growth suppression. Version 10.0, 2020. (Electronic resource.) URL: http://www.eucast.org (access date: 05.21.2020 (in Russ.).

11. Zwaluw K., Haan A., Pluister G.N. et al. The Carbapenem Inactivation Method (CIM), a Simple and Low-Cost alternative for Carba NP Test to Assess Phenotypic Carbapenemase Activity in Gram Negative Rjds. PLos One. 2015;10(3):e0123690. DOI: 10.1371/journal.pone.0123690.

12. EUCAST Guidelines for the identification of resistance and resistance mechanisms of particular clinical and / or epidemiological significance. Version 2.0, 2017 (in Russ.).

13. Gayazova D. Identification of microorganisms producing carbapenemase. (Electronic resource.) URL: https://fedlab.ru/upload/ medialibrary/000/prezentatsii-/prezentatsii-samara/%D0%93%D0%B0%D 1%8F%D0%B7%D0%BE%D0%B2%D0% B0.pdf (access date: 05.21.2020) (in Russ.).

14. Popov D.A. Comparative characteristics of modern methods for determining the production of carbapenemases. Clinical Microbiology and Antimicrobial Chemotherapy. 2019;21(2):125-133 (in Russ.). DOI: 10.36488/cmac.2019.2.125-133.

15. Polishchuk A.G., Yakubovich E.I., Polukhina O.V. et al. Carbapenemase-producing gram-negative bacteria in a specialized hospital of St. Petersburg Russian Scientific Center for Radiology and Surgical Technologies. Clinical Microbiology and Antimicrobial Chemotherapy. 2017;19(3):235-242 (in Russ.).

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:

Боронина Любовь Григорьевна — д.м.н., профессор кафедры клинической лабораторной диагностики и бактериологии ФГБОУ ВО УГМУ Минздрава; 620028, Россия, г. Екатеринбург, ул. Репина, д. 3; секретарь научного отдела ГАУЗ СО «ОДКБ»; 620149, Россия, г. Екатеринбург, ул. С. Дерябиной, д. 32. ORCID iD 0000-0003-0152-962X. Саматова Елена Валерьевна — к.м.н., врач-бактериолог лаборатории клинической микробиологии ГАУЗ СО «ОДКБ»; 620149, Россия, г. Екатеринбург, ул. С. Дерябиной, д. 32. ORCID iD 0000-0003-3154-6201. Кукушкина Марина Павловна — заведующая лабораторией клинической микробиологии ГАУЗ СО «ОДКБ»; 620149, Россия, г. Екатеринбург, ул. С. Дерябиной, д. 32; ORCID iD 0000-0003-1980-9099.

Панова Светлана Анатольевна — врач-бактериолог лаборатории клинической микробиологии ГАУЗ СО «ОДКБ»; 620149, Россия, г. Екатеринбург, ул. С. Дерябиной, д. 32; ORCID iD 0000-0003-4347-0929.

Устюгова Светлана Сергеевна — врач-бактериолог лаборатории клинической микробиологии ГАУЗ СО «ОДКБ»; 620149, Россия, г. Екатеринбург, ул. С. Дерябиной, д. 32; ORCID iD 0000-0002-0053-4884.

Асновская Анна Геннадьевна — врач-бактериолог лаборатории клинической микробиологии ГАУЗ СО «ОДКБ»; 620149, Россия, г. Екатеринбург, ул. С. Дерябиной, д. 32. ORCID iD 0000-0003-1649-1310.

Контактная информация: Саматова Елена Валерьевна, e-mail: lavrinenko@eka-net.ru. Прозрачность финансовой деятельности: никто из авторов не имеет финансовой заинтересованности в представленных материалах или методах. Конфликт интересов отсутствует. Статья поступила 02.07.2020, поступила после рецензирования 27.07.2020, принята в печать 19.08.2020.

ABOUT THE AUTHORS:

Lyubov' G. Boronina — Doct. of Sci. (Med.), professor of the Department of Clinical Laboratory Diagnostics & Bacteriology, Ural State Medical University; 3, Repin str., Yekaterinburg, 620028, Russian Federation; secretary of the Scientific Division, Regional Children's Clinical Hospital; 32, S. Deryabina str., Yekaterinburg, 620149, Russian Federation; ORCID iD 0000-0003-0152-962X.

Elena V. Samatova — Cand. of Sci. (Med.), bacteriologist of the Laboratory of Clinical Microbiology, Regional Children's Clinical Hospital; 32, S. Deryabina str., Yekaterinburg, 620149, Russian Federation; ORCID iD 0000-0003-3154-6201. Marina P. Kukushkina — Head of the Laboratory of Clinical Microbiology, Regional Children's Clinical Hospital; 32, S. Deryabina str., Yekaterinburg, 620149, Russian Federation; ORCID iD 0000-0003-1980-9099.

Svetlana A. Panova — bacteriologist of the Laboratory of Clinical Microbiology, Regional Children's Clinical Hospital; 32, S. Deryabina str., Yekaterinburg, 620149, Russian Federation; ORCID iD 0000-0003-4347-0929. Svetlana S. Ustyugova — bacteriologist of the Laboratory of Clinical Microbiology, Regional Children's Clinical Hospital; 32, S. Deryabina str., Yekaterinburg, 620149, Russian Federation; ORCID iD 0000-0002-0053-4884. Anna G. Asnovskaya — bacteriologist of the Laboratory of Clinical Microbiology, Regional Children's Clinical Hospital; 32, S. Deryabina str., Yekaterinburg, 620149, Russian Federation; ORCID iD 0000-0003-1649-1310.

Contact information: Elena V. Samatova, e-mail: lavrinenko@ eka-net.ru. Financial Disclosure: no authors have a financial or property interest in any material or method mentioned. There is no conflict of interests. Received 02.07.2020, revised 27.07.2020, accepted 19.08.2020.