CC BY
40КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ ПАРАМЕТРЫ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ЭРИТРОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА НА СЕВЕРЕ
QUANTITATIVE PARAMETERS AND FUNCTIONAL PROPERTIES OF HUMAN RED BLOOD CELLS IN THE NORTH
Н. Б. Петрова, Н. И. Гончаров, М. А. Нахимова
N. B. Petrova, N. I. Goncharov, M. A. Nakhimova
Особая структура климата северных территорий предъявляет повышенные требования к организму человека, заставляя его приспосабливаться к суровым климатическим условиям. Кровь тонко отражает действие на организм различных факторов. Показано, что доноры г. Сыктывкара по своим основным количественным параметрам красной крови близки к архангелогородцам. Имеются половые и сезонные различия в количестве эритроцитов и ретикулоцитов. Ответ на бета-блокатор со стороны мембраны эритроцитов снижен, что характеризует гиперадренергическое состояние с высокой активностью симпатоадреналовой системы. Между основными количественными показателями крови и функциональными свойствами мембраны эритроцитов не выявлено достоверной корреляционной связи.
The special climate structure of the northern territories places high demands on the human body, forcing it to adapt to harsh climatic conditions. Blood subtly reflects the effect on the body of various factors. It is shown that the donors of Syktyvkar in their main quantitative parameters of red blood are close to archangel residents. There are gender and seasonal differences in the number of red blood cells and reticulocytes. The response to the beta-blocker from the erythrocyte membrane is reduced, characterizes the hyperadrenergic state with high activity of the sympa-thoadrenal system. No reliable correlation was found between the main quantitative indicators of blood and the functional properties of the erythrocyte membrane.
Ключевые слова: эритроциты, гемоглобин, ретикулоциты, адренореактивность, бе-та-адреноблокатор, северяне.
Keywords: erythrocytes, reticulocytes, hemoglobin, adrenoreactivity, beta-adrenoblocker, northerners.
Введение
Среди функциональных систем, поддерживающих нормальную жизнедеятельность организма, система красной крови - эритрон (совокупность эритроидных предшественников и зрелых эритроцитов крови) - представляет сложную многоуровневую структуру, способную благодаря наличию обратных связей сохранять гомеостаз в условиях многофакторного воздействия, осуществлять важнейшую функцию газообмена [1]. Клетки крови являются хорошей моделью, отражающей глубокие физиологические, морфологические, биохимические процессы, обусловленные воздействием экологических факторов. Количественные и качественные показатели красной крови меняются при определенных состояниях или адаптациях к различным климатогеографическим условиям. Если климатические условия во времени резко не отличаются, то показатели крови варьируют в небольших преде-
лах. Так, у большинства жителей средней полосы нашей страны существенных сезонных различий в величине гематологических показателей нет. В некоторых географических регионах с резко различающимися природными условиями состояние системы крови по ряду показателей может отличаться от общепризнанных норм [2]. Климатические условия Севера накладывают свой отпечаток на состояние красной крови, поскольку на Севере действует целый комплекс климатических факторов (низкие температуры, жесткий аэродинамический режим, измененный фотопериодизм), оказывающих повреждающее или регулирующее действие на организм человека. Кроме этого, северные территории часто отличаются резко выраженными сезонными перепадами температуры и давления. Поэтому возникает необходимость в изучении состоянии красной крови человека в контрастные сезоны года. Традиционно эритроциты считались достаточно редуцированными клетками и рассматривались лишь в качестве простых резервуаров для транспорта кислорода. Однако было установлено, что эти клетки обладают значительным набором сигнальных молекул, что свидетельствует об участии красных клеток в сигнальных процессах, направленных на интеграцию функций организма [3]. Мембраны эритроцитов содержат функционально активные Р-адренорецепторы. В клетках крови порядка 1000-10000 молекул Р-адренорецепторов приходится на каждую клетку [4]. Связывание Р-адреноблокатора - пропранолола (1111) с эритроцитами конкурентно опосредуется концентрацией катехоламинов и хорошо отражает состояние Р-адренорецепторов в тканях [5]. Тесты с добавлением ПП в пробы крови имитируют состояние стресса in vitro и позволяют оценить адренореактивность организма. Как связаны количественные показатели красной крови и функциональные свойства мембраны эритроцитов - этот вопрос также не исследован.
Целью данной работы является исследование количественных и функциональных характеристик клеток красной крови у человека на Севере.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Исследовать количественные показатели красной крови (количество эритроцитов, гемоглобина, ретикулоцитов) человека в разные сезоны года.
2. Изучить функциональные свойства мембраны эритроцитов (осмотическая резистентность и влияние на нее адреноблокатора - ПП) в разные сезоны года.
3. Провести корреляционный анализ связей между функциональными свойствами мембраны эритроцитов и количественными характеристиками красной крови.
Материал и методы
Исследование проводилось на базе СГУ им. Питирима Сорокина в институте естественных наук. Материалом исследования для определения концентрации эритроцитов и гемоглобина служила кровь мужчин (n = 64) и женщин (n = 41) в возрасте до 40 лет, полученная в летний (июнь 2018 г.) и зимний (декабрь 2018 г.) периоды. Среднеклеточный объем эритроцитов определяли только в летний период (2018 г), ретикулоциты и ретикулоцитарную формулу исследовали только у мужчин в оба сезона. Забор крови осуществлялся медицинским персоналом Республи-
канской станции переливания крови. Использовались одноразовые пробирки с литий-гепарином. Забор крови происходил за 2 дня до исследования.
Информация о погодных условиях на момент взятия крови взята из интернет-ресурса: https://www.gismeteo.ru/.
Для определения гемоглобина (Нв) использовался набор «Гемоглобин АГАТ». Метод основан на фотометрическом измерении степени окрашиваемости раствора ацетонациангидридомгемиглобинцианида. Количество эритроцитов определяли фотометрически (красный светофильтр), согласно калибровочному графику. Для определения осмотической резистентности эритроцитов (ОРЭ) и адренореактивно-сти использовался набор «Бета-АРМ АГАТ». Метод основан на факте торможения гемолиза эритроцитов, помещенных в гипоосмотическую среду, в присутствии бе-та-адреноблокатора - солей пропанолола (I II I). Величина бета-АРМ вычислялась по формуле:
Бета - АРМ = х 100%,
где бета-АРМ - величина показателя адренореактивности, усл. ед.; Ео1 и Ео2 - оптические плотности опытных проб, ед. опт. плотности; Ек1 и Ек2 - оптические плотности контрольных проб, ед. опт. плотности.
Величина бета-АРМ прямо пропорциональна активности симпато-адреналовой системы и обратно пропорциональна плотности адренорецепторов на мембранах клеток. Высокие значения бета-АРМ отражают высокую степень адренорецептор-ного обеднения мембраны в результате десенситизации при гиперадренергетиче-ских состояниях, а низкие показатели бета-АРМ характерны для гипосимпатикото-нии [6].
Определение концентрации ретикулоцитов (Rte). Rte окрашивали пробирочным методом по Гейльмейеру с использованием раствора бриллиантового крезило-вого синего и инкубацией 45 мин. По истечении времени делали мазок, который высушивали на воздухе. Подсчет Rte вели на окрашенных, воздушно-сухих мазках, под масляной иммерсией, двигаясь по мазку зигзагом, в 300 полях зрения, с диффе-ренцировкой клеток по стадиям зрелости по Гейльмейеру. Концентрацию Rte выражали в промиллях (%о на 1000 Эр). Доли клеток разных стадий зрелости выражают в процентах по отношению к их общему числу [7]. Статистическая обработка данных проводилась с помощью программы STATISTICA 12. Распределение переменных определяли с помощью критерия Шапиро-Уилка. Достоверность различий оценивалась по U-критерию Манна-Уитни для независимых выборок. Связь между переменными определяли с помощью ранговой корреляции Спирмена. Достоверными считали различия на уровне значимости p <0.05.
Результаты исследований и обсуждение
Данные по количеству гемоглобина, эритроцитов, ретикулоцитов, среднекле-точному объему эритроцитов в разные сезоны года представлены в табл. 1.
Таблица 1
Количественные показатели красной крови у человека в разные сезоны года
Показатели Мужчины Женщины
Лето (июнь, 2018) Зима (декабрь, 2018) Лето (июнь, 2018) Зима (декабрь, 2018)
Гемоглобин, г/л 142 ± 18 134±17* 125 ± 14 121±12*
Эритроциты, млн 4.47 ± 0.69 4.03 ± 0.30 3.96 ± 0.61 3.67 ± 0.21
Ретикулоциты Rtc, %о 3.93 ± 2.63 5.68 ± 2.39* - -
Среднеклеточный объем Эр, мкм3 98.15 ± 3.1 - 94.69 ± 5.5 -
Примечание. * - различия статистически значимые (р <0.05).
Все исследуемые нами показатели красной крови находятся в пределах нормы, иногда выходя за нижнюю его границу [8]. Имеются статистически значимые (р <0.05) половые различия как по количеству эритроцитов, так и по гемоглобину. У мужчин показатель гемоглобина выше, чем у женщин на 12 %, а количество эритроцитов на 11 %. Такую разницу можно объяснить половыми различиями, так как у мужчин почти в 5 раз выше уровень андрогенов, в частности тестостерона, который стимулирует секрецию эритропоэтина, повышает чувствительность клеток эритропоэза к эритропоэтину и стимулирует рост мускулатуры [9].
На количественные показатели красной крови человека, согласно литературным данным, могут влиять вредные условия труда, возраст, эмоциональная и мышечная нагрузка, действие экологических факторов [10; 11].
Поскольку исследуемые - это жители г. Сыктывкара, территории, приравненной к Северу, их показатели красной крови могут отличаться от жителей средней полосы. По литературным данным, у жителей Севера в большинстве клинических исследований значения гемоглобина и эритроцитов соответствуют средним значениям. Это связано интенсификацией как эритропоэза, так и эритродиереза [1]. Эти данные подтверждаются и другими исследованиями, так как наряду с повышением эритропоэза снижается показатель средней продолжительности жизни эритроцита [1; 12]. При этом может увеличиваться среднеклеточный объем эритроцита, изменяться его форма в силу деэнергизации клетки и нарушения ионного транспорта через мембрану [1]. По данным литературы, средний объем эритроцита у мужчин в Заполярье достигает 100-118 мкм3, у жителей г. Архангельска - 94-98 мкм3, а у москвичей этот показатель варьирует в пределах 86-92 мкм3 [1]. У исследованных доноров г. Сыктывкара этот показатель приближен к жителям г. Архангельска. Для поддержания постоянства жизненно важных констант периферической крови в организме показатели эритропоэза могут изменяться в широком диапазоне. Число ретикулоцитов и суточный эритропоэз увеличивается у жителей регионов северного направления. У обитателей Заполярья число ретикулоцитов и суточный эритро-поэз значительно выше, чем у москвичей [1]. Наши данные по количеству ретикулоцитов соответствуют референсным значениям [13; 14; 15].
Из литературы известно, что у взрослого человека содержится от 2 до 10 Rtc на 1000 эритроцитов, при этом в норме встречаются только Rtc IV и V групп в соотношении 1/3 Rtс IV группы и 2/3 - V группы. При усиленной регенерации эритро-идного ряда клеток крови число Rtс увеличивается, кроме того, появляются Rtс I, II и III групп - левый сдвиг ретикулоцитарного ряда. По нашим данным, распределение Rtc по стадиям зрелости по Гейльмейеру соответствует нормальному кроветворению. Преобладают Rtc V стадии зрелости - среднее число их составляет (92.52 ± 3.47 %), Rtc IV стадии зрелости (3.88 ± 3.76 %) и меньше всего III стадии (0.60 ± 0.88%). Rtc II и I стадий не встречаются. Показано, что средняя концентрация Rtс крови мужчин-доноров составляет 4.94±2.05 %о. Среди мужчин-доноров концентрация Rtc 9.1 %о наблюдалась у одного человека, наименьшее количество Rtc от 2.42 %о до 3.66 %о встречалось у четверых мужчин.
При сравнении сезонных показателей доноров показано, что мужчины в летний период имеют статистически значимые ф <0.05) отличия по количеству эритроцитов и превышают зимние показатели на 10 %, но не имеют различий ф> 0.05) по уровню гемоглобина. Женщины-доноры показывают схожую с мужчинами ситуацию - летние показатели превышают зимние на 7 %, ф <0.02) по количеству эритроцитов, но не имеют различий по уровню гемоглобина. Это может быть связано с гипоксическим воздействием (зимой) на систему эритрона и сопутствующими адаптациями [12]. Сходная сезонная динамика показана у доноров Дальнего Востока, где климатические условия достаточно контрастны [2]. Обратную зависимость от географического фактора имеет показатель средней продолжительности жизни эритроцитов (СПЖЭ). Изменение СПЖЭ у северян в широтном расположении регионов с юга на север показывает резкое снижение по направлению к северу срока функционирования эритроцитов [1]. Наши данные по количеству Rtc также подтверждают адаптацию системы эритрона к зимнему периоду, который характеризуется гипоксическим синдромом. В зимний период количество ретикулоцитов достоверно выше на 7.6 %, чем в летний.
Таблица 2
Показатели оптической плотности надосадочной жидкости (ОПн.ж) крови доноров
Пол Количество проб ОПн.ж.
Мужчины 64 0.286 ± 0.146
Женщины 41 0.237 ± 0.136
Сокращение продолжительности функционирования эритроцитов в кровяном русле и усиление кроветворения является результатом компенсаторно-приспособительной перестройки системы крови в ответ на сочетанное воздействие экстремальных климатогеографических и экологических факторов окружающей среды. Это приводит к снижению физиологических резервов организма и в конечном счете к его ускоренному старению [1]. Последнее отражается в изменении функциональных свойств мембраны эритроцитов: в их устойчивости к гипоосмо-тическому раствору и адренореактивности. Для определения ОРЭ был применен
метод гипоосмотического гемолиза в буферном растворе, соответствующем 0.45 % №С1. Так как статистически значимых сезонных различий не наблюдается ни у мужчин, ни у женщин, объединены данные летнего и зимнего сезонов для обоих полов (табл. 2). Индивидуальная изменчивость в способности эритроцитов выдерживать внутриклеточное давление довольно сильно варьирует как у мужчин, так и у женщин.
Характер распределения проб крови у мужчин и женщин одновершинен, однако кривая распределения эритроцитарной популяции у женщин более пологая, без четкого пика, имеется плато в области средних значений 0.2-0.4. Это свидетельствует о большей неоднородности в эритроцитарной популяции женщин с увеличением доли высоко- и среднестойких эритроцитов. Доля старых эритроцитов вдвое ниже, чем у мужчин. ОРЭ может зависеть от многих факторов: отношения объема клетки к площади поверхности цитоплазматической мембраны, эластичности мембраны, концентрации осмотически активных веществ в клетке и вне ее, изменения свойств мембраны под действием физических и экологических факторов [16; 17]. Имеется также гипотеза о наличии различных фракций эритроцитов, в мембране которых имеются аквапорины разных типов, обеспечивающих транспорт воды из среды в эритроцит и обратно [18]. Авторы предполагают, что с возрастом число их увеличивается, ускоряя транспорт воды в клетку и снижая ОРЭ. ОПн.ж. мужчин статистически значимо (р <0.05), превышает показатель у женщин примерно на 17 %. В крови обследованных доноров присутствуют эритроциты с различным структурно-функциональным состоянием мембраны, что проявляется изначально достаточно большим диапазоном полученных данных и различным характером влияния солей 1111 на устойчивость мембраны в гипотонической среде.
Данные по ответу на соли ПП и показателю адренореактивности представлены в табл. 3.
Таблица 3
Показатели ответа на соли пропранолола (ОПн.ж. под действием адреноблокатора)
и адренореактивности доноров
Группа Количество проб ОПн.ж. под действием адреноблокатора Адренореактивность, усл. ед.
Мужчины 64 0.080 ± 0.011 30.11 ± 2.06
Женщины 41 0.067 ± 0.011 32.80 ± 2.42
Пропранолол изменяет текучесть мембраны эритроцита. Причина - взаимодействие ПП с фосфолипидными ацильными цепочками и стерольными кольцами в гидрофильных участках мембраны, которое дистантно вызывает нарушения в гидрофильной области мембраны [4; 5]. Мембраностабилизирующее действие адреноблокатора (уменьшение жидкостности мембраны и тем самым уменьшение проницаемости воды) напрямую зависит от количества адренорецепторов в эритроците, а десенситизация адренорецепторов мембран при различных состояниях отражает увеличение количества катехоламинов в крови [7]. Между показателями ОРЭ и ответом на 1111 имеется корреляционная связь средней и высокой силы (0.8; р <0.05). Чем выше ОРЭ и ниже значения ОПн.ж., тем сильнее мембраностабилизи-
рующее действие бета-блокатора. Так, у лиц с высокой ОРЭ и с ОПн.ж. в пределах 0-0.2 ед. эффект 1111 достигал 70 % и более. В группе лиц, где гемолиз эритроцитов шел более активно и ОПн.ж. составляла 0.4-0.6 ед., эффект 1111 достигал 50 %, т. е. ПП оказывал в 1.5 раза меньшее действие. Показатель адренореактивности и ответа на 1111 не имеет статистически значимых половых различий (табл. 3). Наши данные превышают показатели нормы (2-20 усл. ед.), предложенные разработчиками метода [7], но соответствуют регионарным показателям для северных территорий
[19].
Существенным фактором является сезон года. На протяжении года человек проходит циклы естественной сезонной акклиматизации. Для понимания механизмов формирования приспособительных реакций в организме важен анализ зависимости показателей систем гомеостазирования - кровообращения, дыхания, обмена веществ у человека, состояние этих систем отражается на свойствах мембраны и, в частности, на ее адренореактивности. Наибольшие средние величины и вариабельность показателя бета-АРМ эритроцитов человека были нами получены зимой 2011 года - 32 усл. ед., летом 2012 года - 46 усл. ед. В эти периоды была зафиксирована аномально низкая, либо аномально высокая температура в сочетании с очень низкими величинами влажности и геомагнитной активности [19; 20].
Таблица 4
Корреляционные связи между адренореактивностью и параметрами крови
и температурой среды
Показатели Адренореактивность, усл. ед.
Мужчины Женщины
Эритроциты, млн/мм3 Г = -0.05, p> 0.05. Г = -0.02, p> 0.05.
Гемоглобин, г/л Г = 0.08, p> 0.05 Г = 0.13, p> 0.05.
Температура воздуха во время забора крови Г = -0.02, p> 0.05. г = -0.04, p> 0.05.
Наличие гиперадренергического состояния у большинства северян связано с комплексом адаптивных изменений, реализующихся на организменном, органном и клеточных уровнях: активацией систем неспецифической адаптации, увеличенным обменом катехоламинов, интенсификацией обменных механизмов и гомеостатиче-ских систем, поддерживающих температурный гомеостаз [19; 20].
Корреляционный анализ показал отсутствие связи между ОПн.ж. и другими показателями крови (количество эритроцитов и гемоглобина). Статистически достоверной корреляции между адренореактивностью и показателями красной крови, а также погодными условиями (температурой) не обнаружено (табл. 4).
Заключение
Воздействие жестких экологических факторов северных территорий на организм человека со стороны системы красной крови характеризуется изменениями, связанными с компенсаторно-приспособительными реакциями интенсификации эритропоэза на фоне усиленного эритродиереза. У доноров г. Сыктывкара нами обнаружены достоверные сезонные различия в количестве эритроцитов и ретику-
лоцитов. При этом изменяются функциональные свойства мембраны эритроцитов, которые выражаются в значительной неоднородности реакции в ответ на гипоос-мотическое воздействие и влияние бета-адреноблокатора. Показатели ответа на бе-та-блокатор и адренореактивность превышают нормы для средней полосы России, что отражает высокую активность симпатоадреналовой системы и десентизацию клеточных мембран у северян. Статистически достоверной корреляционной связи между адренореактивностью и количественными показателями красной крови (Эр
и Нв), а также погодными условиями (температура) нами не было обнаружено.
***
1. Дегтева Г. Н. Состояние эритрона у жителей северных территорий // Биологические аспекты экологии человека. 2004. С. 53-57
2. Каменщикова О. Н. Природные факторы юга Дальнего Востока и здоровье человека : учебное пособие. Хабаровск: Изд-во ДВГРУ, 2006. С. 86-96
3. Трошкина Н. А., Дворянский С. А., Циркин В. И. Клиническое значение оценки ад-ренореактивности эритроцитов // Здоровье человека на Севере. 2008. № 2. С. 43-45.
4. Авакян А. Э., Ткачук В. А. Структурная и функциональная организация систем передачи сигнала через рецепторы, сопряженные с G-белками // Рос. физиол. журнал им. И. М. Сеченова. 2003. Т. 89. № 2. С. 219-239.
5. Соминский В. Н., Бардышев Л. В., Блюма К. Использование эритроцитов для прижизненной оценки функционального состояния адренорецепторов // Рос. физиол. журнал им. И. М. Сеченова. 1989. Т. 75. № 2. С. 189-193.
6. Длусская И. Г., Стрюк Р. И. Адренореактивность и сердечно-сосудистая система. М.: Медицина, 2003. 160 с.
7. Назаренко Г. И., Кишкун А. А. Клиническая оценка результатов лабораторных исследований : практическое руководство. М.: Медицина, 2007. 539 с.
8. Данилова Л. А. Анализы крови, мочи и других биологических жидкостей человека в различные возрастные периоды. СПб.: Спец-Лит, 2014. 111 с.
9. Верин В. К., Иванов В. В. Гормоны и их эффекты : справочник. СПб.: ООО «Издательство "ФОЛИАНТ"», 2012. 136 с.
10. Елифанов А. В., Соловьев В. С., Лепунова О. Н. и др. Влияние профессиональных факторов на показатели красной крови доноров // Гигиена и санитария. 2017. № 96 (6). С. 548-551.
11. Липунова Е. А. Скоркина М. Ю. Система красной крови. Сравнительная физиология : монография. Белгород: Изд-во БелГУ, 2004. 216 с.
12. Александров Н. П. Изменения в системе красной крови человека (эритроне) при адаптации к новым условиям // Земский врач. 2010. № 1. С. 24-27.
13. Агаджанян Н. А., Шастун С. А, Игнатьев А. В. Особенности процессов свободно-радикального окисления крови у людей с различным уровнем физической нагрузки // Вестник Российского университета Дружбы народов. Сер. Медицина. 2002. №3. С. 23-31.
14. Козинец Г. И., Макарова В. А. Исследование системы крови в клинической практике. М.: Триада-Х, 1997. 480 с.
15. Banfi G., Fabbro M. D. Behaviour of reticulocyte counts and immature reticulocyte fraction during a competitive season in elite athletes of four different sports // Int. J. Lab. Hematol. 2007. Vol. 29. Pp. 127-131.
16. Антонов В. Ф. Липидные поры: стабильность и проницаемость мембран // Соросов-ский образовательный журнал. 1998. № 10. С. 10-17.
17. Потапенко А. Я., Кягова А. А., Тихомиров А. М. Осмотическая устойчивость эритроцитов : учебное пособие. М.: ГОУ ВПО ГРМУ, 2006. 40 с.
18. Mola M. Automated cell-based assay for screening of aquaporin inhibitors // Anal. Chem. 2009. № 81. Pp. 61-69.
19. Петрова Н. Б., Азарова В. А., Бушля Т. А., Петрова П. А. Адренореактивность эритроцитов человека в условиях Севера при разных температурах in vivo и in vitro // В мире научных открытий. 2014. № 2 (50). С. 269-275.
20. Петрова Н. Б. Адренореактивность человека на Севере // Разнообразие, структура и функционирование биологических систем на севере : монография / под ред. С. В. Загировой и др. Сыктывкар: Изд-во СыктГУ им. Питирима Сорокина, 2015. С. 172-196.
