CC BY
52
Л. А. Смирнова, А. И. Ращенко, А. Ф. Рябуха, К. А. Кузнецов, Е. А. Сучков
Волгоградский государственный медицинский университет,
кафедра фармакологии, лаборатория фармакокинетики НИИ фармакологии ВолгГМУ
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОЕДИНЕНИЯ РУ-1205 В БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОБАХ
УДК 615.3:616-073
Разработан метод количественного определения нового биологически активного соединения производного бензимидазола РУ-1205 с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Были определены чувствительность метода, время удерживания вещества, максимум поглощения соединения в ультрафиолетовом спектре, а также произведен выбор экстрагента вещества из биологических проб.
Ключевые слова: ВЭЖХ, количественное определение, бензимидазол.
L. A. Smirnova, A. I. Raschenko, A. F. Riabuha, K. A. Kuznecov, E. A. Suchkov ASSAY OF COMPOUND RU-1205 IN BIOLOGICAL SAMPLES
We developed a method for chromatographic assay of a new biologically active compound, a benzimidazole derivative, RU-1205 using high performance liquid chromatography (HPLC). Sensitivity, time of substance retention, maximal absorption of the compound in the UV spectrum were determined. We also performed a selection of an extracting agent from biological samples.
Key words: HPLC, assay, benzimidazole.
Фармакокинетические показатели имеют большое значение при изучении новых высокоактивных соединений, так как они определяют тактику разработки лекарственных форм и изучение фармакоди-намики данных веществ [3]. Актуальной задачей является создание новых эффективных опиоидных анальгетиков, с отсутствующими серьезными побочными эффектами [4]. В данной области каппа-селективные агонисты представляют одну из наиболее перспективных групп соединений для создания новых отечественных препаратов [2]. Результаты предварительных исследований показывают, что производные бензимидазола могут считаться потенциальными обезболивающими средствами с каппа-опиоидной активностью [1].
В ходе настоящего исследования разработан метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с диодноматричным детектированием для проведения фармакокинетических исследований соединения РУ-1205, позволяющий определять изучаемое вещество в биологическом материале.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Разработка метода количественного определения производного бензимидазола соединения РУ-1205 с использованием ВЭЖХ.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использовался жидкостной хроматограф (Shimadzu, Япония). Определение соеди-
нения РУ-1205 осуществлялось при помощи ди-одноматричного ультрафиолетового детектора при длине волны 205 нм, на колонке SUPELCOSIL LC-18 (5 мкм; 100 х 4,6 мм). Мобильная фаза включала ацетонитрил (УФ210) (Россия) и буферную систему, состоящую из однозамещенного фосфата калия 50 тМоль.
В качестве модификаторов мобильной фазы рассматривались следующие соединения: гептан-сульфоновая кислота, тетрагидрофуран, триэтила-мин и додецилсульфат в различных процентных концентрациях.
Извлечение соединения РУ-1205 из биологического материала осуществлялось ацетонитрилом в соотношении 1:1.
Для количественного определения вещества применялся метод абсолютной калибровки. Зависимость площадей пиков от концентрации РУ-1205 анализировалась методом регрессионного анализа. Статистическая обработка результатов проводилась при помощи компьютерной программы Ехе1.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
При разработке метода использовались буферные системы с диапазоном рН от 2,5 до 7,0. При отклонении рН в кислую сторону было отмечено снижение времени удерживания вещества на хроматографической колонке. При рН = 3,0 время удерживания составило 3,5—4,0 мин. Значе-
ния рН выше 5,5—6 вызывали увеличение времени удерживания и снижение стабильности определения.
Температурный режим подбирался в диапазоне 30—75 оС. Уменьшение температуры приводило к резкому снижению чувствительности. В диапазоне 60—75 оС не выявлено значительных колебаний, соответственно окончательный выбор остановлен на значении 60 оС.
Соотношения водной и органической фаз: 30 % : 70 % v/v; 35 % : 65 % v/v; 40 % : 60 % v/v; 50 % : 50 % v/v и 55 % : 45 % v/v соответственно. Увеличение процента водной фазы приводило к значительному увеличению времени удерживания и снижению чувствительности. Увеличение доли органической фазы свыше 60 % вызывало уменьшение времени удерживания до 3—5 мин, неоправданно увеличивая риск интерференции эндогенными пиками биоматериала.
Модификаторы мобильной фазы не оказали положительного влияния на количественное определение соединения. Так, например, применение додецилсульфата приводило к резкому снижению высоты пика и увеличению его основания. При добавлении тетрагидрофурана происходило значительное снижение времени удерживания.
При разработке метода извлечения соединения РУ-1205 из биологического материала в качестве возможных экстрагентов рассматривались спирт этиловый, ацетонитрил, смесь спирт этиловый : ацетонит-рил в соотношении 1 : 1, а также спирт этиловый, подкисленный 0,1н соляной кислотой.
Образцы встряхивались в течение десяти минут в ультразвуковой ванне для преципитации белков и центрифугировали в течение 15 минут при 3000 об/мин на центрифуге Eppendorf, после чего надосадочная жидкость отбиралась и вводилась в инжектор с объемом петли 20 мкл.
В результате в качестве экстрагента был выбран ацетонитрил, обеспечивающий достаточную степень экстракции и удовлетворительную очистку пробы. Степень экстракции соединения РУ-1205 составила не менее 90 %.
Таким образом, оптимальными условиями количественного определения субстанции РУ-1205 являются следующие: буферная система, состоящая из 50 мМ однозамещенного фосфата калия, рН = 5; соотношение водной и органической фазы 50 % : 50 % v/v; температурный режим 60 оС; длина волны детекции 205 нм; скорость потока 1 мл/мин. При данных условиях время удерживания составило 8—8,5 мин (рис. 1, 2).
Количественное определение проводилось в диапазоне концентраций от 0,5 до 25 мкг/мл. В результате было установлено, что калибровочные кривые носят линейный характер, с коэффициентом регрессии (R2) равным 0,998 (рис. 3).
Были определены внутридневные процентные колебания (повторяемость метода), которые не превышали 20 % в изучаемых диапазонах концентраций. Междневные процентные колебания (воспроизводимость метода) для изучаемого соединения не превышали в основном 15 % (табл.).
При повторном проведении анализа, после 72 часов хранения водных растворов соединения при комнатной температуре, средние абсолютные процентные колебания находились в тех же пределах, показывая стабильность изучаемого вещества.
Рис. 1. Хроматограмма соединения РУ-1205 в водном растворе
Рис. 2. Хроматограмма соединения РУ-1205 в биологическом материале
с, мкг/мл
Рис. 3. Зависимость площади под хроматографическим пиком от концентрации вещества РУ-1205
Чувствительность метода для изучаемого соединения составляет 1 мкг/мл. Средняя ошибка измерения не превышает 15 %.
Показатели воспроизводимости и повторяемости метода
количественного определения соединения РУ-1205 в диапазоне линейной зависимости площади хроматографического пика от концентрации растворов (М ± т)
Концентрация, мкг/мл Внутридневные колебания концентрации, мкг/мл Повторяемость, + А % Воспроизводимость (средняя ошибка измерения), %
день 1 день 2 день 3 день 1 день 2 день 3
0,5 0,89 ± 0,07 0,81 ± 0,08 1,06 ± 0,08 77,42 62,98 111,36 83,92
1 1,20 ± 0,06 1,18 ± 0,24 1,24 ± 0,12 20,4 18,04 24,31 20,91667
5 4,24 ± 0,51 4,25 ± 0,53 3,91 ± 0,21 -15,27 -14,99 -21,73 17,33
25 25,13 ± 6,24 21,6 ± 3,51 30,05 ± 5,10 0,54 -13,41 20,19 2,44
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В результате проведенных исследований разработан хроматографический метод количественного определения соединения РУ-1205, обладающий достаточной чувствительностью и селективностью. Чувствительность метода составляет 1 мкг/мл, воспроизводимость 15 %.
Таким образом, разработанный метод количественного определения является высокоселективным и высокочувствительным, что позволяет эффективно использовать его для проведения
фармакокинетических исследований соединения РУ-1205.
ЛИТЕРАТУРА
1. Гречко О. Ю, Васильев П. М., Черников М. В. и др. // Психофармакол. биол. наркол. — 2007. — Т. 7. — С. 1666.
2. Спасов А. А., Гречко О. Ю, Васильев П. М. и др. // Вопр. биол. мед. фарм. химии. — 2011. — № 8. — С. 52—57.
3. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Хаб-риев Р. У. — М., 2005. - С. 217—229.
4. Kivell B., Prisinzano T. E. // Psychopharm. — 2010. — Vol. 210. — P. 109—119.
О. Ю. Гречко, Н. В. Елисеева, Д. М. Чикун, А. А. Спасов, В. А. Анисимова
Волгоградский государственный медицинский университет, кафедра фармакологии
ИЗУЧЕНИЕ АНАЛЬГЕТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ НОВОГО ПРОИЗВОДНОГО БЕНЗИМИДАЗОЛА ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ПУТЯХ ВВЕДЕНИЯ
УДК 615.212.7:616-092.9
Выполнены экспериментальные исследования по изучению эффективности соединения под лабораторным шифром РУ-1203, проявляющего каппа-агонистическую активность, при различных путях введения. Установлено, что соединение РУ-1203 проявляет наибольшую анальгетическую эффективность при внутривенном введении, а также обладает активностью при пероральном применении в отличие от препарата сравнения буторфанола.
Ключевые слова: каппа-опиоидный рецептор, агонист, опиоидные анальгетики.
O. Y. Grechko, N. V. Eliseeva, D. M. Chikun, A. A. Spasov, V. A. Anisimova
A STUDY OF ANALGESIC ACTIVITY OF NEW BENZIMIDAZOLE DERIVATIVES WITH DIFFERENT ROUTES OF ADMINISTRATION
We studied the efficacy of RU-1203 compound exhibiting kappa-agonist activity with different routes of administration. It is established that the compound RU-1203 shows the greatest analgesic efficacy when administered intravenously; it is also active when administered orally, in contrast to butorphanol, the reference drug.
Key words: kappa-opioid receptor, agonist, opioid analgesics.
Арсенал анальгетических средств в настоящее время достаточно многообразен, среди которых максимальное обезболивание обеспечивают опиоидные анальгетики, которые по-прежнему остаются препара-
тами первого выбора при сильных болевых синдромах, связанных с травмой, хирургическими операциями, злокачественными новообразованиями и инфарктом миокарда [4, 9]. Однако выраженные побочные явления
