CC BY
139
(23)
УДК 615.033:611-018.5:543.544.2
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ МЕТАБОЛИТА ЛИДОКАИНА -МОНОЭТИЛГЛИЦИНКСИЛИДИДА В ПЛАЗМЕ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДИОДНО-МАТРИЧНОГО ДЕТЕКТОРА
Н. В. Рогова, К. А. Кузнецов, Л. А. Смирнова, А. А. Озеров
Кафедра клинической фармакологии ВолГМУ
Описан простой, точный и чувствительный способ количественного определения моноэтилглицинксилидида в плазме крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Для количественного определения использовался внутренний стандарт - триметоприм. Получена линейная зависимость в промежутке концентраций 20-1000 нг/мл с пределом чувствительности 10 нг/мл. Метод показал точные и повторяемые результаты.
Ключевые слова: высокоэффективная жидкостная хроматография, моноэтилглицинксилидид.
QUANTITATIVE DETERMINATION OF LIDOCAINE METABOLITE MONOETHYLGLYCINEXYLYDIDE IN SERUM BY HIGH-PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY USING DIODE-MATRIX DETECTOR
N. V. Rogova, K. A. Kuznetsov, L. A. Smirnova, A. A. Ozerov
Abstract. A simple, accurate and sensitive method of analysis of monoethylglycinexylydide (MEGX) in human serum by high-performance liquid chromatography is described. MEGX was measured after direct injection upon addition of the internal standard (trimethoprim). The procedure produced linear curves for the concentration range of 20-1000 ng/ml with a limit of detection 10 ng/ml. This assay produced accurate and repeatable results.
Key words: high-performance liquid chromatography, monoethylglycinexylydide.
В настоящее время для лечения любого заболевания практически невозможно обойтись монотерапией и приходится прибегать к назначению одновременно нескольких лекарственных средств. Проблема нежелательных реакций при межлекарственном взаимодействии на уровне биотрансформации в печени является актуальной.
Цитохромы подсемейства 111А составляют 30 % от всех изоферментов цитохрома Р450 в печени и 70 % всех изоферментов стенки желудочно-кишечного тракта, при этом в печени локализован преимущественно изофермент 3А4 (СУР3А4). СУР3А4 метаболизирует около 60 % всех известных лекарственных веществ, катализирует реакцию 6-р-гидроксилирования эндогенных и экзогенных стероидов, в том числе тестостерона, прогестерона, кортизола. На активность СУР3А4 влияют многие факторы, которые необходимо учитывать.
Субстратная специфичность определенных ферментов метаболизма лекарственных средств позволила разработать методы их фенотипиро-вания. Активность того или иного фермента метаболизма определяется по фармакокинетике специфического "маркерного" субстрата путем измерения его концентрации и концентрации его метаболита в плазме крови (или моче). Маркер-
ными субстратами для определения активности СУР3А4 являются дапсон, эритромицин, нифе-дипин, лидокаин [1, 8].
В настоящее время наиболее широко в качестве маркера активности СУР3А4 применяется лидокаин и его метаболит - моноэтилглицинксилидид (МЕЭХ). Для определения концентрации МЕЭХ в данном тесте применяется метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), в котором в качестве стандарта используется субстанция МЕЭХ [7].
Применение МЕЭХ-теста в клинике имеет очень важное значение. Например, для диагностики хронической патологии печени (значение МЕЭХ на 30-й минуте после введения лидокаина 50 мкг/л предложено использовать как дифференциально-диагностический критерий между хроническим гепатитом и циррозом печени); для прогнозирования исхода заболевания (значение концентрации МЕЭХ <25 мкг/л является критерием, позволяющим судить о высокой вероятности смертельного исхода при первичном билиарном циррозе) [9]; для оценки состояния донора при трансплантации печени (при показаниях МЕЭХ на 15-й минуте (90±9) мкг/л у донора - высокий риск осложнений в послеоперационном периоде у реципиента) [10]; для оценки фармакокинети-ческого взаимодействия лекарств на уровне био-
3 2007) ^ I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I вестник волгму I I I I I I I I I I I I I I и I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I
трансформации (снижение концентрации MEGX ческая колонка "SupelcoSil LC-8" (7,5 см х 4,6 мм на 20 % и более требует коррекции дозирования со средним размером частиц 3 ^m). лекарственных средств, являющихся субстратами CYP3A4). Таким образом, мониторинг функционального состояния CYP3A4 и организма в целом при помощи MEGX-теста позволяет улучшить качество лечения пациентов, повысить длительность и качество их жизни, сократить расходы на лечение.
Существует несколько вариаций определения MEGX в плазме крови для различных условий хроматографирования. В частности, для детектирования определяемых веществ используются различные методики: с использованием флуоресцентного детектора, масс-спектроскопии, имму-ноферментного анализа [2, 3, 11]. Использование флуоресцентного детектора и масс-спектро-скопии требует наличия дорогостоящего оборудования и реактивов, что препятствует широкому распространению данного метода. В литературе в основном описаны методики определения концентрации MEGX и лидокаина с использованием ультрафиолетового детектора [5-7]. В связи с этим нами предложен метод определения концентраций лидокаина и MEGX с использованием ВЭЖХ с диодно-матричным детектором как наиболее распространенным и доступным.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Адаптировать методику количественного определения основного метаболита лидокаина (моноэтилглицинксилидида) для условий ВЭЖК с диодно-матричным детектором.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
В исследовании использовались следующие реагенты: раствор лидокаина 10 %-й производства Московского фармкомбината им. Семашко; MEGX - синтезирован по методике синтеза лидокаина (под руководством проф., д-ра хим. наук А. А. Озерова); раствор триметоприма 16 мг/мл (препарат "Бисептол" для внутривенных инфу-зий) производства завода "Polfa Warsaw".
Все используемые растворы приготовлялись ежедневно в день исследования. Требуемые концентрации приготовлялись из маточных растворов (1000 мкг/мл) методом последовательных разведений. Для экспериментов готовились серии из 3 параллельных проб по каждой концентрации. Для построения калибровочных кривых использовался средний результат параллельных проб.
Мы использовали высокоэффективный жидкостной хроматограф модели "HPLC-10Avp" ("Shimadzu Co., Ltd.", Kyoto, Japan), оборудованный диодно-матричным детектором "SPD-M10A" ("Shimadzu Co., Ltd.", Japan) и инжектором "Rheodyne" модели 7725i с петлей ввода на 20 мкл (Rheodyne, Cotati, CA 94928), хроматографи-
(23)
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
За основу методики определения МЕЭХ была взята методика, предложенная на кафедре клинической фармакологии и пропедевтики внутренних болезней ММА им. Сеченова (Кукес В. Г.). В качестве мобильной фазы была использована смесь ацетонитрила для ВЭЖХ и буферного раствора в соотношении 87:13. Условия хромато-графирования: температура - 25 °С, длина волны - 205 нм, скорость потока - 1 мл/мин.
Для подбора методики с наибольшей чувст-чительностью использовались следующие буферные растворы с различными значениями рН: калий-фосфатный буфер (раствор КН2Р04, рН = 7,2); калий-фосфатный буфер (рН = 5,9); цитрат-но-фосфатный буфер (рН = 5,0); натрий-фосфатный буфер (Ыа2НР04+ЫаН2Р04, рН = 4,65); калий-фосфатный буфер (раствор КН2Р04, рН = 4,0). Для определения чувствительности использовалась тестовая проба 20 мкл раствора МЕЭХ 10 мкг/мл.
Исходя из того, что МЕЭХ - вещество основной природы и в кислой среде будет находиться в виде соли, что будет препятствовать определению, первоначально нами был выбран калий-фосфатный буфер (рН = 7,2). При испытании тестовой пробы выяснилась недостаточная чувствительность данного метода - пики на хро-матограмме получаются нечеткими и растянуты-
ми по времени, что препятствует количественному определению. Использование калий-фосфатного буфера с более низкими значениями рН (5,9) также показало недостаточную чувствительность. Так как чувствительность метода может зависеть не только от рН, но и от состава буфера, были опробованы цитратно-фосфатный (рН = 5,0) и натрий-фосфатный (рН = 4,65) буферы, которые также показали низкую чувствительность. В некоторых работах [5] используется калийфосфатный буфер с более низким рН (4,0). При испытании тестовой пробы он показал наибольшую чувствительность по сравнению с остальными. В результате для нашей методики мы решили остановиться на следующем составе мобильной фазы: 87 % ацетонитрила и 13 % калий-фосфатного буфера (рН = 4,0) как наиболее чувствительной среди опробованных (рис. 1).
Тестовая проба 10 мкг/мл МЕЭХ дает на хроматограмме пик высотой в 30 ед. В крови человека концентрации МЕЭХ находятся в диапазоне 20-100 нг/мл, т. о. при концентрации 100 нг/мл пик МЕЭХ на хроматограмме будет сливаться с нулевой линией. В связи с этим нами было предложено производить концентрирование исходного раствора (экстракция раствора, упаривание и растворение сухого остатка в меньшем объеме растворителя), что позволит значительно увеличить чувствительность.
Рис.1. Хроматограмма раствора МЕОХ 10 мкг/мл
Впервые для экстракции МЕЭХ из раствора нами была предложена экстракция хлороформом -доступным и недорогим реагентом, относительно малотоксичным (в отличие от используемого в других методиках дихлорметана).
Экстракцию проводили следующим образом. К 5 мл раствора МЕЭХ 50 нг/мл добавляли 2 капли 0,1Ы раствора ЫаОН (для повышения рН и соответственно перевода МЕЭХ в основную форму) и по 1 мл хлороформа, встряхивали на
vortex в течение 1 минуты, после чего центрифугировали при 3000 об/мин в течение 3 минут. Затем нижний (органический) слой количественно переносили в пустую пробирку. Данный процесс экстракции повторяли 3 раза с одним образцом. Полученные экстракты затем объединяли в одну пробу. После каждой экстракции оценивалось оставшееся количество MEGX в водной фазе. Выяснилось, что после трехкратной экстракции в водном растворе остаются неопределяемые концентрации MEGX, что позволяет говорить о практически полном переходе MEGX в органическую фазу. Полученный экстракт испаряли методом барботирования, после чего сухой остаток растворяли в ацетонитриле для ВЭЖХ.
Тестовая проба показала значительное увеличение чувствительности, однако повышение чувствительности оказалась недостаточным. Мы предположили, что MEGX плохо растворяется в ацетонитриле и, следовательно, не полностью переходит в раствор из сухого остатка. В связи с этим нами был предложен в качестве растворителя этанол. При его использовании удалось еще более повысить чувствительность метода.
В связи с увеличением количества стадий пробоподготовки, на каждой из которых возможны потери определяемого вещества, необходимо использовать внутренний стандарт для учета этих потерь и определения изначальной концентрации вещества в растворе.
По литературным данным в качестве внут-
пользуются различные вещества, основными критериями использования которых является оп-ределяемость при тех же условиях хроматогра-фирования, причем время выхода не должно совпадать с определяемыми веществами.
В качестве внутреннего стандарта на основании сходства физико-химических свойств нами были опробованы следующие вещества - адреналин, новокаин, дибазол и триметоприм.
Используемые нами условия хроматогра-фирования показали очень низкую степень чувствительности метода по отношению к дибазолу и новокаину, что препятствует их использованию в качестве внутреннего стандарта. По отношению к адреналину метод, напротив, показал очень высокую чувствительность, но использованию адреналина в качестве внутреннего стандарта препятствует очень маленькое время удерживания, в результате чего четко определить границы пика на хроматограмме не представляется возможным и, помимо этого, возможно присутствие эндогенного адреналина в плазме крови человека, что, учитывая высокую чувствительность метода к нему, будет оказывать заметное влияние на точность определения. Вышеперечисленных недостатков при использовании в качестве внутреннего стандарта лишен триметоприм - его время выхода заметно отличается от времени выхода определяемого МЕЭХ, чувствительность метода к триметоприму оказалась вполне достаточной и сравнимой с та-
Рис. 2. Хроматограмма смеси MEGX, триметоприма, сульфометоксазола и лидокаина
Для оценки линейности зависимости между площадями пиков и концентрациями тримето-прима и МЕЭХ в водном растворе был построен
калибровочный график зависимости площади пика МЕЭХ и триметоприма от концентрации и график зависимости площади пика МЕЭХ от площа-
(23) ' ' ' ' '
ди пика внутреннего стандарта в тех же концентрациях. Используемые концентрации - 20, 10, 5, 1 мкг/мл (рис. 3):
Ошибка! Объект не может быть создан из кодов полей редактирования.
Рис. 3. Зависимость Э (М) от Э (Т)
Из представленного графика видно, что зависимость получается линейной с коэффициентом аппроксимации >0,999, что позволяет использовать триметоприм в качестве внутреннего стандарта.
В дальнейшем необходимо было адаптировать вышеописанную методику концентрирования водных растворов к аналогичной методике, но используя плазму крови человека.
Для этого нами была использована плазма крови практически здоровых людей, не употребляющих какие-либо лекарственные препараты в течение последних 2 недель. Процедура про-боподготовки аналогична таковой для водного раствора. Чувствительность метода оказалась сопоставима с таковым при использовании водного раствора.
Для проверки повторяемости результатов каждую пробу определяли 3 раза и рассчитывали среднее значение и внутридневную ошибку. Для проверки воспроизводимости результатов анализ образцов повторяли в течение 3 дней и рассчитывали среднее значение и междневную ошибку.
Для количественной оценки содержания МЕЭХ в образце плазмы была построена калибровочная кривая зависимости отношения площади пика триметоприма к площади пика МЕЭХ от концентрации последнего (концентрация триме-топрима была постоянной во всех пробах и составляла 1 мкг/мл).
2007
Данный метод показал линейную зависимость в промежутке концентраций 20-1000 нг/мл, что позволяет использовать его для количественного определения MEGX с минимальным порогом обнаружения - 10 нг/мл. Метод показал высокую степень повторяемости и воспроизводимости результатов, меж- и внутридневная ошибка не превышает 5 %.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, нами была адаптирована методика количественного определения MEGX методом ВЭЖХ для хроматографической системы "Shimadzu" с диодно-матричным детектором. Данная методика позволяет определят MEGX в плазме крови в концентрациях 20-100 нг/мл.
ЛИТЕРАТУРА
1. Кукес В. Г., Фисенко В. П. Метаболизм лекарственных препаратов. - М., 2004.
2. Andreeva M., Niedmann P.-D., et al. // Clin. Chem. - 1997. - Vol. 43 (6). - Р. 1081-1083.
3. Chen Y., Potter J. // Clin. Chem. - 1992. - Vol. 38. -Р. 2426-2430.
4. Chen Y., Potter J. // J. Chromatogr. - 1992. -Vol. 574. - Р. 361-364.
5. Cox S., Hamner T., et al. // J. Pharm. and Bio-med. Anal. - 2005. - Vol. 37. - Р. 801-804.
6. Kohda Y., Kakiuchi Y., et al. // J. Appl. Ther. Res. -1998. - Vol. 2. - Р. 33-38.
7. Lehmann U., Armstrong V., et al. // Therap. Drug Monit. - 1995. - № 17 (2). - Р. 125-132.
8. Nebert D. W, Russel D. W. // Lancet. - 2002. -Vol. 360. - Р. 1155-1162.
9. Oellerich M., Burdelski M., et al. // Там же. -1989. - Vol. 1. - Р. 640-642.
10. Oellerich M., Burdelski M., et al. // Therap. Drug Monit. - 1990. - № 12 (3). - Р. 219-286.
11. Streit F., Niedmann P.-D., et al. // Clin. Chem. -2001. - Vol. 47 (10). - Р. 1853-1856.
УДК 616.33-085.31:614.2
ФАРМАКОЭКОНОМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЬНЫХ
С НЕЭРОЗИВНОЙ ФОРМОЙ ГАСТРОЭЗОФАГЕАЛЬНОЙ РЕФЛЮКСНОЙ БОЛЕЗНИ В ОБЩЕЙ ВРАЧЕБНОЙ ПРАКТИКЕ
М. М. Осадчук
Самарский государственный медицинский университет
В работе описан фармакоэкономический анализ лечения пациентов с неэрозивной формой гастроэзофаге-альной рефлюксной болезни. Разработаны алгоритмы лечения больных с учетом их социального статуса.
Ключевые слова: гастроэзофагеальная рефлюксная болезнь, лечение, общая врачебная практика.
PHARMACOECONOMIC ANALYSIS OF TREATMENT OF PATIENTS WITH NON-EROSIVE FORM OF GASTROESOPHAGEAL REFLUX DISEASE IN GENERAL MEDICAL PRACTICE
