CC BY
86
при гипоксии // Бюлл. экс. биол. и мед. - 1990. - Т. 60. №3. -С.263-265.
8. Ронин В.С., Старобинец Г.М. Руководство к практическим занятиям по методом клинических лабораторных исследовании. - М.: Медицина, 1989. - 320 с.
9. Стрелков Р.Б. Статистические таблицы для ускоренной количественной оценки фармакологического эффекта // Фармакология и токсикология. - 1986. - №4. - С.100-104.
10. Удинцев Н.А., Иванов В.В. Антиоксидантное действие
глутаминовой кислоты // Патол.физиол. и эксп. терапия. -1984. - №4. - С.60-62.
11. Чучалин В.С., Теплякова Е.М. Коррекция патологий гепатобилиарной системы комплексным растительным средством // Бюллетень сибирской медицины. - 2007. - №4. -С.52-57.
12. Seifter S., Danton S., Hovia B., et al. Estimation et glycogen with antrone reagent // Aroh. Biochem. - 1950. - Vol. 25. - P.191-200.
Информация об авторах: Республика Узбекистан, г.Ташкент, 100002, ул. Усманходжаева, пр. К. Умарова, д. 16; Государственный центр экспертизы и стандартизации лекарственных средств МЗ РУз; тел. (998712) 49 47 93, 244 48 23, e-mail: farmaco_toxik@mail.ru, tashpmi@rambler.ru, факс: (99871) 244 48 23, Азизова Санат Собировна - д.м.н., профессор; Набиев Абдували Набиевич - старший научный сотрудник, к.м.н.; Абдусаматов Абдулазиз Абдулатипович - д.м.н.,
профессор; Каримова Г. - ассистент.
© ЛУБСАНДОРЖИЕВА П.Б., ДАШИНАМЖИЛОВ Ж.Б., ГАРМАЕВА Е.Д., АЖУНОВА Т.А. - 2011
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФЛАВОНОИДОВ В РАСТИТЕЛЬНОМ СРЕДСТВЕ «ЭРИТРОФИТ»
Пунцык-Нима Базыровна Лубсандоржиева, Жаргал Балдуевич Дашинамжилов, Евгения Дандаржаповна Гармаева,
Татьяна Александровна Ажунова (Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, Улан-Удэ, директор - д.б.н., проф. Л.Л. Убугунов)
Резюме. Разработана спектрофотометрическая методика определения содержания флавоноидов в растительном средстве «Эритрофит». Валидационная оценка методики показала, что методика определения флавоноидов в эритрофите воспроизводима, линейна в области концентрации флавоноидов в аликвоте - 0,086-0,648 мг/мл, и относительная ошибка среднего результата составляет 1,86%.
Ключевые слова: эритрофит, флавоноиды.
QUANTITATIVE DETERMINATION OF FLAVONOIDS IN VEGETABLE REMEDY «ERITHROPHYTE»
P.B. Lubsandorzhieva, Zh.B. Dazhinamzhilov, E.G. Garmaeva, T.A. Azhunova (Institute of General and Experimental Biology SD RAS, Ulan-Ude)
Summary. The spectrophotometric methods of the quantitave determination of flavonoids in vegetable remedy “Erythrophyte” have been developed. The validative evaluation of the proposed method showed that method of quantitave determination of flavonoids in vegetable remedy “Erythrophyte” is precise, linear in the field of flavonoids concentration 0,086-0,648 mg/ml in aliquot and relative standard deviation is 1,86%.
Key words: erythrophyte, flavonoids.
Растительное средство (условное название «Эритрофит»), состоящее из экстрактов сухих листьев Urtica dioica L., травы Polygonum aviculare L., Achillea millefolium L., мелкоизмель-ченных порошков Zingiber officinalis L., и Cinnamomum cassia проявляло в эксперименте антианемическое, гепатопротек-торное и противовоспалительное действия [1,11]. Три вида сырья компонентов эритрофита стандартизируются по содержанию эфирных масел: Z. officinalis, C. cassia - по методу Гинзбурга, А. millefolium - по методу 3 с использованием декалина [3,4,5], и при содержании эфирных масел в траве А. millefolium не менее 0,1%, объем раствора эфирного масла в декалине получается на практике меньше объема самого декалина [6]. Также, при получении сухого экстракта из травы A. millefolium более летучая часть эфирных масел остается в растворителе, теряется при вакуумной сушке. Основными действующими веществами Z. officinalis L. и C. cassia являются эфирные масла [12,16], содержание которых должно составлять в Z. officinalis - не более 1,4%, C. cassia - не менее
0,5% [3,4]. В составе эритрофита используются сухие порошки этих пряностей с низким содержанием эфирных масел, что затрудняет определение их содержания в антианемиче-ском средстве методом Гинзбурга.
Для стандартизации листьев крапивы предусмотрена качественная реакция на витамин К, травы горца птичьего
- методика определения суммы флавоноидов в пересчете на авикулярин [5]. Листья U. dioica признаны источником витамина К (2-метил-3-фитил-1,4-нафтохинон), который осуществляет коферментные функции при биосинтезе ряда белков, связывающих кальций (в частности, протромбина), участвующих в процессе свертывания крови. В эксперименте наиболее высокий антитромботический эффект показывали липофильные вещества из U. dioica, в том числе и флавонои-ды [14]. В клинических условиях в качестве кровоостанавливающих средств применяют отвары и настои из A. millefolium,
P aviculare, U. dioica [7,8], в которых витамин К и другие гидрофобные вещества не извлекаются водой. Возможно, что наблюдаемые положительные эффекты от применения этих растений при анемии связаны с их этиотропным действием [8]. Кроме эфирных масел, широкий спектр фармакологических свойств A. millefolia во многом обусловливают фенольные соединения: флавоноиды - кровоостанавливающее, противовоспалительное [6,13], дикофеоилхинные кислоты
- спазмолитическое, желчегонное [13].
Таким образом, благоприятное влияние изучаемого средства на моделях анемии обусловлено содержанием не только витамина К, но и поливалентностью действия комплекса БАВ, в частности, флавоноидов. Антианемическое действие последних подтверждено исследованием флавоно-идных соединений (кверцетин, рутин, гесперидин и др.) на течение анемии в постинфекционный период, где наиболее активным антианемическим средством был кверцетин [15]. Представляется целесообразным проводить оценку качества «Эритрофита» по содержанию флавоноидов, как основных действующих веществ P. aviculare, A. millefolium, U. dioica.
Цель данной работы - разработка методики количественного определения флавоноидов в растительном средстве эритрофит.
Материалы и методы
Получены сухие экстракты из U. dioica, P. aviculare, A. millefolium, вышеназванных видов сырья последовательной экстракцией спиртом высокой и средней концентрации (80% и 40% этанол), и горячей водой. По описанным в литературе методикам определено содержание биологически активных веществ (БАВ) (табл. 1). Для определения фенолокислот извлечения предварительно очищали на колонке с окисью алюминия. Количественное содержание витамина К [10] и каро-
Таблица 1
Содержание биологически активных веществ в эритрофите и экстрактах
Наименование Эритрофит Экстракт U. dioica Экстракт P. aviculare Экстракт A. millefolium
Витамин К, % 0,15 ± 0,01 0,04 ± 0,01 0,18 ± 0,01 0,25 ± 0,01
Каротиноиды,мг% 3,98 ± 0,02 2,54 ± 0,01 5,04 ± 0,01 4,36 ± 0,02
Флавоноиды, % 1,51 ± 0,01* 3,96 ± 0,16* 7,20 ± 0,05* 3,89 ± 0,02**
Полифенолы, % 4,72 ± 0,03 9,18 ± 0.08 13,00 ± 0,17 17,97 ± 0,19
Фенолокислоты, % 0,96 ± 0,05 1,17 ± 0,05 1,20 ± 0,05 1,09 ± 0,05
Примечание: * - в пересчете на гиперозид, ** - в пересчете на лютеолин.
Для стандартизации эритрофита выбран спектрофотометрический метод с использованием реакции комплексообразования флавоноидов с алюминия хлоридом. В качестве стандарта выбран рутин, вместо менее распространенного и доступного гиперозида. Подобраны оптимальные условия для проведения количественного анализа флавоноидов в эритрофите (табл. 2).
Установлено, что оптимальными являются следующие параметры: экстрагент - 70% спирт этиловый, соотношение сырье:экстрагент -1:100, кратность экстракции - 1, температура экстракции - 90оС, время экстракции - 30 мин.
тиноидов определяли спектрофотометрическим методом в одной аналитической пробе гексанового извлечения. Валидацию методики проводили методом математической статистики [2,5].
Результаты и обсуждение
В ультафиолетовом (УФ) спектре спиртовых растворов отдельных экстрактов и эритрофита наблюдается батохромный сдвиг при добавлении 2% раствора алюминия хлористого: при 397 нм (экстракт A. millefolium), 410 нм (экстракт P аviculare), плато при 410 нм (экстракт U. dioica), 410 нм (эритрофит). Полоса поглощения при 410 нм в УФ спектре извлечения эритрофита совпадает с максимумом поглощения спектров гиперози-
Таблица 2
Результаты определения влияния условий экстракции
Таблица 4
Результаты эксперимента методом независимых определений
Наименование Содержание флавоноидов в эритрофите, %
повторность образец №1 образец №2 образец №3
Аналитик 1 1 1,42 1,71 2,08
2 1,40 1,70 2,03
3 1,39 1,69 2,07
Аналитик II 1 1,38 1,73 2,01
2 1,41 1,72 2,05
3 1,40 1,70 2,00
Среднее значение 1,40 1,71 2,04
Коэффициент вариации CV,% 1,01 0,86 1,58
на выход флавоноидов из эритрофита
Испытуемый параметр Флавоноиды,%
I. Выбор концентрации спирта этилового
40 % 1,21± 0,02
60 % 1,32 ± 0,02
70 % 1,41 ± 0,02
80 % 1,40 ±0,01
96 % 1,38 ± 0,01
II. Температура экстракции
100 о С (кипящая водяная баня) 1,30 ± 0,02
80-90 о С 1,32 ± 0,01
60-70 о С 1,18 ± 0,02
III. Время экстракции, мин
15 мин 1,28 ± 0,01
30 мин 1,30 ± 0,02
45 мин 1,35 ± 0,03
IV. Кратность экстракции и соотношение сырьеэкстрагент
1) 1:100 1,28 ± 0,01
2) 1:50; 1:50 (итого 1:100) 1,23 ± 0,02
3) 1:50; 1:50; 1:50 (итого (1:150) 1,38 ±0,01
Квалификацию методики (валидацию) проводили с использованием опытов с добавками, определения линейности методики, воспроизводимости. Правильность методики подтверждена опытами с добавками раствора стандарта рутина к исследуемому раствору (табл. 3).
Критерием приемлемости является средний процент восстановления, средняя величина которого должна находиться в пределах (100±5)%. Установлено, что процент восстановления находится в пределах от 98,77 до 101,04%, относительная ошибка составляет 0,69%.
Таблица 5
Результаты опытов для определения линейности методики
Концентрация флавоноидов (по отношению к декларированному содержанию суммы флавоноидов), % Объем аликвоты, мл Оптическая плотность растворов
25 0,5 0,081
50 1,0 0,166
75 1,5 0,239
100 2,0 0,335
125 2.5 0,408
150 3,0 0,472
175 3,5 0,550
200 4,0 0,610
Коэффициент корреляции, г 0,9985
да и рутина с алюминия хлоридом.
Таблица 3
Результаты опытов с добавками
Флавоноиды в эритрофите, мг Добавлено рутина, мг Должно быть, мг Найдено, мг Ошибка, %
8,187 4,0 12,187 12,208 100,17
12,102 99,30
12,314 101,04
8,187 6,0 14,187 14,066 99,14
14,013 98,77
14,066 99,14
8,187 8,0 16,187 16,080 99,33
16,135 99,68
16,243 100,34
Средний % восстановления: 99,83
Определение линейности проводили на 7 уровнях концентраций от теоретического содержания флавоноидов в испытуемом средстве (табл. 5.)
Установлено, что график зависимости имеет линейный характер в области концентрации флавоноидов в аликвоте 0,086-0,648 мг/мл и описывается уравнением у = 0,01504 + 0,1523 х. Коэффициент корреляции составляет 0,9985 и близок к единице (0,98 < г < 1) (табл. 5). Воспроизводимость методики устанавливали методом независимых определений на 3 образцах в трех повторностях (исполнители - 2 аналитика) (табл. 4).
Критерием приемлемости является коэффициент вариации (СУ<10%), который составил 1,58%, что свидетельствует об удовлетворительной воспроизводимости методики. Метрологические характеристики методики определения флавоноидов в эритрофите приведены в таблице 6.
Установлено, что относительная ошибка среднего результата не превышает 1,86%, отдельного определения - 4,93%.
Таблица б
Метрологические характеристики методики (n = 7, р = 0,95, t(P, f) = 2,447)
Наименование X, % S S X лх E, % Е, %
Серия 13.03.08. 1,38 0,02000 0,00755 0,01849 1,34 3,54
Серия 16.02.09. 1,65 0,03366 0,01272 0,03112 1,86 4,93
Серия 26.01.10. 1,87 0,03133 0,01184 0,02897 1,54 4,08
Содержание флавоноидов в пересчете на рутин в эритрофите составляет 1,38-2,04%. Показателем качества установлена следующая норма: содержание флавоноидов в пересчете на
рутин в эритрофите должно быть не менее 1,0%.
Таким образом, для проведения количественного анализа флавоноидов в эритрофите являются следующие оптимальные параметры: экстрагент - 70% спирт этиловый, соотношение сырье:экстрагент - 1:100, кратность экстракции - 1, температура экстракции - 90оС, время экстракции - 30 мин. Валидационная оценка методики показала, что избранная методика определения флавоноидов в пересчете на рутин в эритрофите воспроизводима, линейна в области концентрации фла-воноидов в аликвоте - 0,086-0,648 мг/мл, и относительная ошибка среднего результата не превышает 1,86%.
ЛИТЕРАТУРА
1. Гармаева Е.Д., Дашинамжилов Ж.Б., Ажунова Т.А., Лубсандоржиева П.Б. Влияние фитосредства «Эритрофит» на стадию альтерации воспалительного процесса. // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2009. - Т. 67. №3. - С.316-317.
2. ГОСТ Р ИСО 5725-3-2002. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 3. Промежуточные показатели прецизионности стандартного метода измерений.
3. ГОСТ 29046-91. Пряности. Имбирь. Технические условия.
4. ГОСТ 29049-91. Пряности. Корица. Технические условия.
5. Государственная фармакопея СССР: вып. 1. Общие методы анализа. МЗ СССР. - 11-е изд., доп. - М.: Медицина, 1987.
- 337 с.; вып. 2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье. МЗ СССР. - 11-е изд., доп. - М.: Медицина, 1990. - 400 с.
6. Евдокимова О.В. Разработка и валидация методики количественного определения суммы флавоноидов в траве тысячелистника. // Вестник ВГУ Серия: Химия. Биология. Фармация. - 2007. - №2. - С.155-160.
7. Коновалов Д.А., Коновалова О.А., Челомбитько В.А. Биологически активные вещества Achillea millefolium L.s.L. // Растит. ресурсы. - 1990. - Т. 26. Вып. 4. - С.598-608.
8. Круглов Д.С., Ханина М.А., Третьякова О.В. Исследование специфической активности некоторых растительных экстрактов // Успехи современного естествознания.
- 2006. - №5. - С.50-51.
9. Муравьева Д.А., Самылина И.А., Яковлев Г.П.
Фармакогнозия. - 4-е изд. - М.: Медицина, 2002. - 656 с.
10. Струкова М.П., Федорова Г.А., Шведов Б.Л., Сарычева И.К. Спектрофотометрическое и полярографическое определение витамина К1 в синтетических образцах // Химикофармацевтический журнал. - 1973. - Т. 7. №10. - С.53-55.
11. Azhunova T.A., Lubsandorzhieva P.B., Garmaeva E.D. The influence of a complex plant remedy on the indices of rat peripherial blood in experimental anemia. // Traditional medicine: a current situation and perspectives of development: Materials of the III International scientific conference. - Ulan-Ude, 2008. - P.90.
12. Badreldin H.A., Blunden G., Tanira M.O., Nemmar A. Some phytochemical, pharmacological and toxicological properties of ginger (Zingiber officinale Roscoe): A review of recent research // Food and Chemical Toxicology. - 2008. - Vol. 43. - P.409-420.
13. Benedek B., Kopp B., MelzigM. Achillea millefolium L. s.l. -Is the anti-inflammatory activity mediated by protease inhibition? // J. Ethnopharmacology. - 2007. - Vol. 113. - P.312-317.
14. Chrubasik .E., Roufogalis B.D., Wagner H., Chrubasik S.A. A comprehensive review on nettle effect and efficacy profiles, Part I: herba urticae // Phytomedicine. - 2007. - Vol. 14. - P.423-435.
15. Sen G., Mandal S., Roy S.S., et al. Therapeutic use of quercetin in the control of infection and anemia associated with visceral leishmaniasis // Free Rad. Biol. & Med. - 2005. - Vol. 8.
- P.1257-1264.
16. Tomaino A., Cimino F., Zimbalatti V., et al. Influence of heating on antioxidant activity and the chemical composition of some spice essential oils // Food Chemistry. - 2005. - Vol. 89. -P.549-554.
Информация об авторах: 670047, Улан-Удэ, ул. Сахъяновой, 6, ИОЭБ СО РАН, тел. 89146300703, e-mail: bpunsic@mail.ru, Лубсандоржиева Пунцык-Нима Базыровна - с.н.с., к. фарм.н.; Дашинамжилов Жаргал Балдуевич - с.н.с., к.м.н.; Гармаева Евгения Дандаржаповна - аспирант; Ажунова Татьяна Александровна - в.н.с., д.б.н.
© ШОБОЛОВА Н.А., БАЛЬЖИРОВ Д.Б., ПРОКАЕВА Т.А, НАЗАРОВА-РЫГДЫЛОН А.Н., ЖИГАЕВ Г.Ф. - 2011
ПОРАЖЕНИЕ ПОЧЕК У БОЛЬНЫХ САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ II ТИПА
Надежда Андреевна Шоболова, Доржи Баирович Бальжиров, Татьяна Александровна Прокаева,
Алима Николаевна Назарова-Рыгдылон, Геннадий Федорович Жигаев (Республиканская клиническая больница им. Н.А. Семашко г. Улан-Удэ, гл. врач - к.м.н. Е.Ю. Лудупова)
Резюме. Специфическое для сахарного диабета поражение почек часто развивается на фоне пиелонефрита, кистозного перерождения паренхимы, атеросклеротического и гипертонического артериосклероза.
Ключевые слова: сахарный диабет, диабетическая нефропатия, пиелонефрит, «Арура-ТАН-3».
RENAL FAILURE IN PATIENTS WITH DIABETES MELLITUS
N.A. Shobolova., D.B. Balzhirov, T.A. Prokayeva, АЖ Nazarova-Rygdylon, G.F. Zhigaev (Respublican Clinical Hospital, Ulan-Ude)
Summary. Renal damage, specific for diabetes mellitus, develops on the background of pyelonephritis, cystic degeneration of parenchyma, hypertension and other types of arteriolosclerosis.
Key word: diabetes mellitus, diabetic nephropathy, pyelonephritis, «Aruro-TAN-3».
Сахарный диабет - одна из частных причин, приводящих к необходимости заместительной терапии функции почек, и с постоянной тенденцией к росту нарушений [8,7,11,15].
У 30-40% больных, страдающих сахарным диабетом, развивается диабетическая нефропатия, 35-45% случаев смерти от уремии приходится на больных сахарным диабетом [2].
Факторами риска возникновения диабетической не-
фропатии (ДН) являются артериальная гипертензия, избыточная масса тела, длительность заболевания (более 10 лет), недостаточная компенсация диабета. Имеются сведения о генетической [10] и этнической предрасположенности [12] к развитию ДН, а также о неблагоприятном влиянии курения на ее формирование [13].
Из сопутствующих заболеваний у лиц пожилого воз-
