CC BY
144
ИЗВЕСТИЯ ВУЗОВ. ПРИКЛАДНАЯ ХИМИЯ И БИОТЕХНОЛОГИЯ, 2014, №4 (9) УДК 543.64:[547.94:582.675.1]
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДИТЕРПЕНОВЫХ АЛКАЛОИДОВ В НАДЗЕМНОЙ ЧАСТИ АКОНИТА БАЙКАЛЬСКОГО
, А.Г. Горшков1, А.А. Семенов2
1
Лимнологический институт СО РАН, 664033, г. Иркутск, ул. Улан-Баторская, 3, 2Иркутский государственный технический университет, 664074, г. Иркутск, ул. Лермонтова 83, laps1936@mail.ru
А.Л. Верещагин1
Описан способ количественного определения алкалоидов в водно-спиртовой настойке аконита байкальского.
Ил. 1. Табл. 1. Библиогр. 12 назв.
Ключевые слова: дитерпеновые алкалоиды; аконит байкальский4 количественное определение.
QUANTITATIVE DETERMINATION OF DITERPENOID ALKALOIDS IN THE AERIAL PART OF ACONITUM BAICALENSE
A.L. Vereshchagin^^A.G. Gorshkov1, A.A. Semenov2
1Limnological Institute SB RAS, 3, Ulan-Batorskaya St., 664033, Irkutsk, Russia 2Irkutsk State Technical University,
83, Lermontov St., 664074, Irkutsk, Russia, laps1936@mail.ru
The quantitative determination of the alkaloids of Aconitum baicalense with HPLC method is described. Key words: diterpenoid alkaloids; Aconitum baicalense; quantitative determination.
ВВЕДЕНИЕ
Многолетнее травянистое растение аконит байкальский (Aconitum baicalense Turcz ex Rapaics, син. A. czekanovskyi) произрастает на юге Восточной Сибири. Надземная часть его пользуется популярностью в сибирской традиционной медицине при лечении злокачественных опухолей, заболеваний крови, гормональных расстройств, псориаза. Показано, что водно-спиртовая настойка аконита байкальского обладает сильным противометастатическим [8,10], антистрессовым [11,12] действием, регулирует секрецию гормонов щитовидной железы [2] при невысокой острой и хронической токсичности [6].
В составе травы аконита байкальского найдены алкалоиды [5, 7], флавоноиды и их глико-зиды, глюкозид дегидродикониферилового спирта, 3-метокси-4-гидроксифенилэтатнол [3, 4].
OH OMe
OCOC6H5
Me— -N
X/
R"' />ч -
Meo OMe R =H гипаконитин R = OH мезаконитин
Установлено, что за большинство фармакологических свойств экстракта ответственны дитерпеновые алкалоиды и для количественного определения их суммы предложен потенциомет-рический метод [9]. В настоящем сообщении для определения мезаконитина и гипаконитина, доминирующих алкалоидов в составе травы аконита, предложен метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Выбранный вариант ВЭЖХ с реализацией стадии хроматографии на коротких колонках малого диаметра отличается экспрессностью и экономичностью и является наиболее оптимальным при проведении серийных анализов, необходимых для стандартизации исходного растительного сырья и готовой продукции.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Хроматографический анализ
Траву аконита байкальского заготовляли в Иркутской области в период массового цветения (вторая половина июля, начало августа), высушивали при комнатной температуре. Затем траву измельчали до размеров частиц < 5 мм, заливали 30% этиловым спиртом (соотношение тра-
ва/спирт = 60 г/1 л) и настаивали при комнатной температуре не менее 4 дней. Полученный экстракт декантировали, оставляли при температуре 2-4 оС на два дня и фильтровали через бумажный фильтр. Перед началом анализа каждую пробу настойки дополнительно фильтровали через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм, к 1 мл настойки с помощью микрошприца добавляли 0,033 мл внутреннего стандарта (раствор колхицина в метаноле 0,1 мг/мл).
Анализ проводили на хроматографе Мили-хром А-02 (ЭкоНова, Новосибирск) с УФ детектированием путем прямого ввода в колонку 0,002 мл экстракта. Образец хроматографирова-ли на колонке (2 х 75 мм), упакованной сорбентом «Nucleosil 100-5 ^8» и имеющей эффективность не менее 4000 т.т. (по пику хризена), при температуре 40 оС в условиях градиентного элюирования. Элюэнт «А» - 0,05 М KH2PO4; рН 3,0 в 10% водном ацетонитриле; элюэнт «Б» -90% раствор ацетонитрила в воде. Пиков алкалоидов детектировали в при Л 232 и 240 нм, одновременно. Интегральное спектральное отношение пиков алкалоидов рассчитывали как отношение площадей пика, зарегистрированных при двух длинах детектирования.
Калибровка хроматографа
Исходные растворы алкалоидов в метаноле с концентрацией 1 мг/мл готовили с использованием мезаконитина и гипаконитина, выделенных из аконита байкальского с чистотой < 95 % основного вещества. Внутренний стандарт раствор
колхицина (ООО «Сим-Фарма») в метаноле с концентрацией 0,3 мг/мл. Хроматограф калибровали по растворам алкалоидов в интервале концентраций от 0,1 до 0,3 мг/л с добавкой в каждый раствор алкалоидов 0.1 мл раствора колхицина. Для каждой точки калибровочного графика готовили 10 растворов, записывали хроматограммы, рассчитывали соотношения площадей пика стандарта к пикам алкалоидов (S^/S^ и S^ /Sram где: S^n, Sмез Sn^ - площади пиков колхицина, мезаконитина и гипаконитина, соответственно). Калибровочные зависимости имели коэффициенты корреляции R2 > 0,0020.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Для анализа образцов настойки аконита был применен метод ВЭЖХ на коротких колонках малого диаметра - экономичный и селективный метод, используемый для серийного анализа. Выбранные условия обращено-фазовой ВЭЖХ в градиентом режиме разделения дает возможность регистрировать индивидуальные пики алкалоидов при прямом вводе образца в колонку без его предварительного концентрирования образца на стадии подготовки пробы. При концентрации мезаконитина и гипаконитина в настойке аконита в интервале от 0,1 до 0,3 мг/л пики алкалоидов регистрируются при соотношении сигнал/шум S/N > 10 (рисунок).
Пики алкалоидов на хроматограммах идентифицировали по двум параметрам - время
Время, мин
Рисунок. Хроматограмма смеси алкалоидов. Условия хроматографии: - увеличение доли элюента «Б» с 10% до 60% за 16 мин, затем в течение 8 мин 100 % элюента «Б», расход элюэнта 0,15 мл/мин, объем пробы 0,002 мл, температура колонки 40 оС. Концентрации: колхицина 0,03мг/мл; мезаконитина 0,27 мг/мл; гипаконитина 0,2мг/мл.
Таблица
Интегральные спектральные отношения алкалоидов (Я)* в калибровочном растворе и трех партиях настойки
Аналит R (S232/S240)
Мезаконитин Гипаконитин
Стандарт Настойка № 45 Настойка № 46 Настойка № 46 1,28 ± 0,05 1.27 ± 0,05 1.28 ± 0,05 1.29 ± 0,05 1.28 ± 0,05 1.29 ± 0,05 1,29 ± 0,05 1,28 ± 0,05
* aR = ± 4 % при n = 2, Р = 0,95
удерживания и интегральное спектральное отношение (Р). Учитывая низкую пиковую емкость короткой колонки и прямой ввод в колонку образца настойки, характеризующийся сложной матрицей, выбранный способ идентификации повысил не только точность идентификации пиков алкалоидов, но и дал возможность оценки их гомогенности (по значению К [1]). В случае наложения пиков мешающих компонентов матрицы на пик аналита при выбранном методе ВЭЖХ возможна быстрая корректировка условий хроматографии с целью регистрации гомогенного пика определяемого алкалоида.
Метрологическая оценка методики - воспроизводимости и правильности (методом добавок), свидетельствуют о высокой точности результатов определения. Суммарная погрешность алкалоидов не превышает 4% при единичном определении концентрации в настойке.
ВЫВОДЫ
Предложенный метод позволяет с высокой точностью определять количественное содержание основных алкалоидов в водно-спиртовой настойке надземной части аконита байкальского и пригоден для её стандартизации.
1. Горшков А.Г., Маринайте И.И., Барам Г.И., Соков И.А. // ЖАХ. 2003. 58. № 8. С. 861-868.
2. Васильева Л.С., Изатуллин В.Г., Манюк Е.С., Семенов А.А. // Хим.-фарм. журн. 2005. 39. № 5. С. 23-25.
3. Жапова Ц., Модонова Л.Д., Семенов А.А. // Хим. природ. соед. 1992. № 5. С. 484-493.
4. Жапова Ц., Погодаева Н.Н., Семенов А.А. // Хим. природн. соед. 1993. № 4. С. 617-618.
5. Жапова Ц., Семенов А.А. // Хим. природн. соед.1993. № 6. С. 888-892.
6. Карпова Г.В., Фомина Т.И., Ветошкина Т.В., Боровская Т.Г., Воронова О.Л., Дубская Т.Ю., Суслов Н.И., Абрамова Е.В., Лоскутова О.П., Шерстобоев Е.Ю., Пашинский В.Г., Поветь-ева Т.Н., Семенов А.А. // Экспер. и клин. фарма-кол. 2002. 65. № 3. С. 62-65.
7. Модонова Л.Д., Жапова Ц., Семенов А.А.
ЖИЙ СПИСОК
// Хим. природ. соед. 1982. № 6. С. 717-718; 1982. № 3. С. 392.
8. Пат. РФ, 2002, № 2189832. Средство, обладающее противометастатической активностью. Пашинский, А.А. Семенов, Т.Н. Поветьева.
9. Н.Н. Погодаева, Ц. Жапова, А.А. Семенов // Раст. ресурсы. 1997. 33. № 1. С. 87-89.
10. Поветьева Т.Н., Пашинский В.Г., Семенов А.А., Жапова Ц., Погодаева Н.Н., Хоружая Т.Г. // Сиб. онкол. журн. 2002. № 4. С. 138-141.
11. Пушкарский С.В., Пашинский В.Г., Поветьева Т.Н., Нестерова Ю.В., Гайдамович Н.Н.; Семенов А. А.; Жапова Ц.; Погодаева Н.Н. // Раст. ресурсы. 2006. 42. № 2. С. 115-118.
12. Пушкинский В. Г, Пушкарский С. В., По-ветьева Т. Н., Нестерова Ю. В, Гайдамович Н. Н., Семенов А. А., Жапова, Ц., Погодаева, Н. Н., Жданов В. Н. // Сиб. журн. гастроэтерол. и гепа-тол. 2004. № 18. С. 112-113.
1. Gorshkov A.G., Marinaite I.I., Baram G.I., Sokov I.A. Zhurnal analiticheskoi khimii - Journal
of Analytical Chemistry, 2003, vol. 58, no. 8, pp. 861-868.
2. Vasil'eva L.S., Izatullin V.G., Manyuk E.S., Semenov A.A. Khimiko-farmatsevticheskii zhurnal - Pharmaceutical Chemistry Journal, 2005, vol. 39, no. 5, pp. 23-25.
3. Zhapova Ts., Modonova L.D., Semenov
A.A. Khimiya prirodnykh soedinenii - Chemistry of Natural Compounds, 1992, no. 5, pp. 484-493.
4. Zhapova Ts., Pogodaeva N.N., Semenov A.A. Khimiya prirodnykh soedinenii - Chemistry of Natural Compounds, 1993, no. 4, pp. 617-618.
5. Zhapova Ts., Semenov A.A. Khimiya prirodnykh soedinenii - Chemistry of Natural Compounds, 1993, no. 6, pp. 888-892.
6. Karpova G.V., Fomina T.I., Vetoshkina
T.V. [et al.] Eksperimental'naya i klinicheskaya farmakologiya - Experimental and Clinical Pharmacology, 2002, vol. 65, no. 3, pp. 62-65.
7. Modonova L.D., Zhapova Ts., Semenov A.A. Khimiya prirodnykh soedinenii - Chemistry of Natural Compounds, 1982, no. 6, pp. 717-718; 1982, no. 3, p. 392.
8. Pashinskii V.G., Semenov A.A., Povet'eva T.N. RF patent no. 2189832, 2002.
9. Pogodaeva N.N., Zhapova Ts., Semenov A.A. Rastitel'nye resursy - Plant resources, 1997, vol. 33, no. 1, pp. 87-89.
10. Povet'eva T.N., Pashinskii V.G., Semenov A.A., Zhapova Ts., Pogodaeva N.N., Khoruzhaya T.G. Sibirskii onkologicheskii zhurnal -Siberian Journal of Oncology, 2002, no. 4, pp. 138-141.
11. Pushkarskii S.V., Pashinskii V.G., Povet'eva T.N. [et al.] Rastitel'nye resursy - Plant resources, 2006, vol. 42, no. 2, pp. 115-118.
12. Pushkinskii V.G, Pushkarskii S.V., Povet'eva T.N. [et al.] Sibirskii zhurnal gastroenterologii i gepatologii - Siberian Journal of Gastroenterology and Hepatology, 2004, no. 18, pp. 112-113.
Поступило в редакцию 15 октября 2014 г.
