CC BY
26
12. Prostova M.A. Mutational robustness and resilience of a replicativecis-element of RNA virus: Q1 promiscuity, limitations, relevance / M.A. Prostova, A.P. Gmyl, D.V. Bakhmutov, A.A. Shishova, E.V. Khitrina, M.S. Kolesnikova, M.V. Serebryakova,
0.V. Isaeva, V. Agol // RNA Biology 0:0, 1-17; October
1, 2015.
13. Shapiro B.A., Bindewald, E. RNA secondary structure prediction from sequence alignments using a network of k-nearest neighbor classifiers // RNA. 2006. Vol. 12. P. 342-352.
14. Tuplin A. Replication enhancer elements within the open reading frame of tick-borne encephalitis virus and their evolution within the Flavivirus genus/ A. Tuplin, D.J. Evans, A. Buckley, I.M. Jones, E.A. Gould, T.S. Gritsun // Nucleic Acids Research. 2011. Vol. 39. P. 7034-7048.
12. Prostova M.A., et al. Mutational robustness and resilience of a replicativecis-element of RNA virus: Q1 promiscuity, limitations, relevance / M.A. Prostova,
A.P. Gmyl, D.V. Bakhmutov, A.A. Shishova, E.V. Khitrina, M.S. Kolesnikova, M.V. Serebryakova,
0.V. Isaeva, V. Agol // RNA Biology 0:0, 1-17; October
1, 2015.
13. Shapiro B.A., Bindewald, E. RNA secondary structure prediction from sequence alignments using a network of k-nearest neighbor classifiers/ E. Bindewald,
B.A. Shapiro // RNA. 2006. Vol. 12. P. 342-352.
14. Tuplin A., et al. Replication enhancer elements within the open reading frame of tick-borne encephalitis virus and their evolution within the Flavivirus genus/ A. Tuplin, D.J. Evans, A. Buckley, I.M. Jones, E.A. Gould, T.S. Gritsun // Nucleic Acids Research. 2011. Vol. 39. P. 7034-7048.
Тюлько Жанна Сергеевна - канд.биол.наук Tyul'ko Zhanna Sergeyevna - Cand. Sc.
доцент кафедры физики, математики, медицинской {Biology}, Associate Professor of Physics, Mathematics,
информатики ОмГМУ Medical Informatics Department of Omsk State Medical
Якименко Валерий Викторович - д-р биол. University.
наук, заведующий лабораторией арбовирусных Yakimenko Valeriy Viktorovich - Doctor of
инфекций отдела природно-очаговых вирусных Biology, Head of the Arbovirus Infection Laboratory at
инфекций ОНИИПИ. Natural Focal viral infections of ONIIPI Department.
УДК 578.8 ГРНТИ 34.25.19
КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА РЕПЛИКАЦИИ РНК ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА В КЛЕТКАХ ЕСТЕСТВЕННОГО ХОЗЯИНА
APODEMUS PENINSULAE
М.А. Хаснатинов, Н.А. Болотова, К.Е. Миловидов, И.Г. Кондратов1, Г.А. Данчинова ФГБНУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека», Россия, 664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16 khasnatinov@yandex.ru 1ФГБУН «Лимнологический институт СО РАН» Россия, 664033, Иркутск, ул. Улан-Баторская, 3, а/я 278.
Динамику репликации РНК вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) в культуре клеток естественного хозяина (почки восточноазиатской мыши Apodemus peninsulae) оценивали с помощью количественной ОТ-ПЦР. Первые дочерние копии геномной РНК (+РНК) выявлялись через 8 часов после заражения. Максимальных значений концентрация +РНК достигала на четвертый день и составляла приблизительно 45000 копий +РНК на каждую клетку. После этого концентрация +РНК ВКЭ выходила на плато и обнаруживалась в клетках в течение, по меньшей мере, 19 дней после заражения. Сравнение с динамикой репликации ВКЭ в клетках почки эмбриона свиньи (СПЭВ) позволяет предположить, что у A. peninsulae существует многоуровневый механизм контроля вирусной инфекции, действующий как на стадии входа вириона в клетку, так и, возможно, за счет ограничения скорости синтеза геномной и/или репликативных форм вирусной +РНК.
Ключевые слова: механизм вирусной инфекции, геномная и репликативная формы, культуры клеток.
© М.А. Хаснатинов, Н.А. Болотова, К.Е. Миловидов, И.Г. Кондратов, Г.А. Данчинова, 2016
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
QUANTATIVE ESTIMATION OF TICK-BORNE ENCEPHALITIS VIRUS RNA REPLICATION IN NATURAL HOST'S CELLS APODEMUS PENINSULAE
M.A. Hasnatinov, N.A. Bolotova, K.E. Milovidov, I.G. Kondrato1, G.A. Danchinova Federal State Budgetary Scientific Institution "Scientific Centre of Family and Human Reproduction Health Aspects "
Russia, 664003, Irkutsk, ul. Timiryazeva, 16, khasnatinov@yandex.ru
1Limnological Institute of the Siberian Branch of the Rus-sian Academy of Science
Russia, 664033, Irkutsk, ul. Ulan-Batorskaya, 3, a/ya 278
The dynamics of RNA replication of tick-borne encephalitis virus (TBEV) in vitro of the natural host (kidney tissue culture of Korean field mouse Apodemus peninsulae) was estimated with the aid of quantitative RT-PCR. The first copies of newly synthesized genomic RNA (+RNA) were detected in eight hours post infection. The highest concentration of +RNA was got on the fourth day post infection and comprised approximately 45000 copies +RNA per cell. Thereafter, the +RNA TBEM's concentration achieved a plateau and +RNA appeared in cells during 19 days' post infection. Comparison of TBEV replication in pig's embryo kidney cells (SPEV) indicates that A. peninsulae has a multilevel mechanism of viral infection control, act as both by restricting the virion entry into the host cell and possibly by limiting the rate of synthesis of the genomic and/or replicative forms of viral +RNA.
Keywords: mechanism of viral infection, genome and replicative forms, cell culture.
Клещевой энцефалит (КЭ) остается одной из наиболее опасных и широко распространенных природно-очаговых болезней в Российской Федерации. Возбудителем заболевания является вирус клещевого энцефалита (ВКЭ), который относится к семейству Flavmridae и передается человеку при укусах иксодовых клещей. В России ВКЭ вызывает до 10 тысяч случаев заболевания человека ежегодно [Злобин, 2005; Никитин, 2016].
В природе существование ВКЭ поддерживается за счет непрерывной циркуляции между теплокровными позвоночными хозяевами и членистоногими переносчиками -клещами. Наиболее важными естественными хозяевами ВКЭ являются дикие млекопитающие мелких и средних размеров, прежде всего, мышевидные грызуны, рукокрылые, насекомоядные и зайцеобразные. На территории Восточной Сибири основными резервуарами ВКЭ и прокормителями таежных клещей являются красносерая полевка (Myodes г^осапш), полевка-экономка (Мю^ш оесопотш), восточноазиатская лесная мышь (Apodemus ретти1ае) и сибирский бурундук (Tamias sibiricus) [Злобин, 1996]. При этом зараженность восточноазиатских мышей ВКЭ может превышать 20 % [Балахонов, 2012].
Для изучения инфекции ВКЭ в организме естественных хозяев, в лаборатории
трансмиссивных инфекций ФГБНУ НЦ ПЗСРЧ была создана перевиваемая культура клеток почки восточноазиатской мыши Apodemus ретти1ае, которая является одним из основных прокормителей иксодовых клещей и резервуарным хозяином для многих трансмиссивных инфекций, в том числе и для ВКЭ.
Цель работы состояла в изучении процесса репликации внутриклеточной РНК ВКЭ в клетках естественного хозяина вируса А. ретти1ае.
Материалы и методы. Перевиваемая адгезивная линия клеток почки А. ретти1ае АрпК была получена в лаборатории трансмиссивных инфекций ФГБНУ НЦ ПЗСРЧ (Иркутск), идентичность культуры установлена с помощью анализа нуклеотидной последовательности митохондриального гена цитохрома В (тЮуВ, номер доступа GenBank КТ983422) и последовательности D-петли митохондри-ального генома ^-1оор, КТ983423). Культура клеток почки эмбриона свиньи СПЭВ была приобретена в Коллекции клеточных линий человека и животных для исследований в области вирусологии (ФГБУ «НИИ гриппа» МЗ России, Санкт-Петербург). Для заражения использовали монослои клеток, выращенные в 24-луночных планшетах с плотностью 150 000 клеток на лунку.
Для изучения репликации ВКЭ в клетках использовали изолят ВКЭ сибирского субтипа 92М [Хаснатинов, 2012]. Заражение культур клеток производили с множественностью инфекции 1 БОЕ на клетку. Отбор образцов для оценки внутриклеточной концентрации РНК ВКЭ положительной полярности (+РНК) производили сразу после нанесения среды поддержки (0 часов после заражения), а также через 4, 8, 16, 20, 24 часа после заражения. Кроме того, производили отбор проб на поздних стадиях инфекции через 4, 7 и 19 дней после заражения. Лизис клеток и выделение РНК производили немедленно после сбора. Эксперимент проводили в трех независимых повторах.
Выделение РНК проводили с помощью коммерческого комплекта реагентов «РИБО-преп» (Amplisens Москва), свободной от РНКаз ДНКазы I, (Thermo Fisher Scientific, США) и набора RNAgents Total RNA isolation system (Promega, США). Очищенную суммарную РНК растворяли в 30 мкл стерильной би-дистиллированной воды и немедленно использовали для синтеза кДНК к вирусной +РНК. Специфичную кДНК получали с помощью набора для обратной транскрипции RevertAid M-Mlv reverse transcriptase (Fermentas, Литва). В качестве праймера использовали олигонук-леотид 11154R 5 - AGCGGGTGTTTTTCCG-3. В количественной ПЦР использовали 1 мкл полученной кДНК. Количественную ПЦР проводили согласно методике M. Schwaiger и P. Cassinotti [Schwaiger, 2003] с незначительными модификациями в объеме 25 мкл. Реакцию и учет результатов проводили в амплифи-каторе DT-Prime (ДНК-технология, Москва). Количество кДНК в тестируемых образцах определяли на основе стандартной кривой, полученной при параллельной амплификации стандартов концентрации специфичной одно-цепочечной ДНК и выражали в количестве копий в одном микролитре образца.
Результаты представлены в виде средних значений трех независимых воспроизведений эксперимента. Статистическую обработку материалов проводили с использованием общепринятых методов описательной статистики. Для оценки вариабельности наблюдений рассчитывали стандартное отклонение средних значений. Выпадающие значения концентрации РНК исключали с помощью квратильного метода [Walpole, 2007]. Оценку достоверности межгрупповых различий про-
изводили с помощью t-критерия Стьюдента, различия считали достоверными при p <0,05. Расчеты производили с помощью программы MS Office EXCEL 2003.
Результаты и обсуждение. На начальном этапе инфицирования (0 часов после заражения) в клетках ApnK отмечено меньшее количество внутриклеточной +РНК, чем в клетках СПЭВ - порядка 20 копий на клетку против 150 копий соответственно. Поскольку наблюдаемая нами сразу после заражения внутриклеточная +РНК является преимущественно вирионной, ее количество отражает количество вирусных частиц, проникших внутрь клеток. Можно предположить, что в культуре ApnK проникновение ВКЭ внутрь клетки затруднено на самых ранних стадиях инфекции - при адгезии вирионов к поверхностным рецепторам или при слиянии ви-рионной и клеточной мембран.
Через 4 часа после заражения в обеих культурах клеток отмечено некоторое снижение концентрации +РНК по сравнению с моментом непосредственно после заражения (2 и 50 копий соответственно), хотя различия и не были статистически достоверны (p>0,05). Концентрация +РНК в культуре ApnK оставалась в 10-15 раз ниже, чем в СПЭВ. Появление дочерних копий +РНК было выявлено только через 8 часов инфекции. Далее динамика репликации РНК ВКЭ в обеих культурах клеток была сходной, однако в течение первых 24 часов инфекции, концентрация +РНК в клетках ApnK была в 10-50 раз ниже, чем в клетках СПЭВ (p <0,05). Далее концентрация +РНК постепенно нарастала и на четвертые сутки после заражения достигала максимальных значений. При этом, в клетках ApnK максимальная концентрация +РНК составила порядка 45 000 копий на клетку, тогда как в СПЭВ - более 150 000 копий на клетку. После этого количество внутриклеточной +РНК в культуре ApnK оставалось стабильным на уровне 20 000 копий/клетку и обнаруживалось вплоть до 19 дня после заражения.
В культуре СПЭВ количество +РНК постепенно снижалось и на 7-й день после заражения составляло порядка 2000 копий/клетку, то есть в 10 раз меньше чем в ApnK. По нашему мнению, наиболее вероятным объяснением различий на поздних сроках инфекции является более сильное цитопатическое действие ВКЭ на клетки СПЭВ по сравнению с ApnK.
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Таким образом, пониженное содержание геномной РНК ВКЭ в клетках ApnK непосредственно после контакта в вирусом, меньшая концентрация внутриклеточной +РНК в течение первых 24 часов инфекции, а также замедленная, более плавная динамика накопления +РНК в течение 4 суток после заражения указывают на то, что у естественного хозяина ВКЭ, A. peninsulae, существует многоуровне-
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Балахонов С.В., Никитин А.Я. и др. Эколо-го-паразитологическая характеристика совмещенных очагов инфекций, передаваемых клещами, на территории проведения саммита АТЭС (2012 г.) // Сибирский медицинский журнал. Иркутск, 2012. Т. 111. № 4. С. 67-71.
2. Злобин В.И. Клещевой энцефалит в Российской Федерации: современное состояние проблемы и стратегия профилактики // Вопросы вирусологии. 2005. Т. 50. № 3. С. 26-31.
3. Злобин В.И., Горин О.З. Клещевой энцефалит: Этиология. Эпидемиология и профилактика в Сибири. Новосибирск: Наука. Сибирская издательская фирма РАН, 1996. 177 с.
4. Никитин А.Я., Носков А.К., Андаев Е.И. и др. Эпидемиологическая ситуация по клещевому вирусному энцефалиту в Российской Федерации в 2015 г. и прогноз на 2016 г. // Пробл. особо опасных инф. 2016; 1:40-43.
5. Хаснатинов М.А., Данчинова Г.А., Злобин В.И. и др. Вирус клещевого энцефалита в Монголии // Сибирский медицинский журнал. Иркутск, 2012. Т. 111. № 4. С. 9-12.
6. Schwaiger M., Cassinotti P. Development of a quantitative real-time RT-PCR assay with internal control for the laboratory detection of tick borne encephalitis virus (TBEV) RNA // J Clin Virol. 2003; 27 (2):136-45.
7. Walpole R.E. et al. Probability & Statistics for Engineers & Scientists, 8th edition. ©2007, Pearson Cloth, p237.
Хаснатинов Максим Анатольевич - канд. биол. наук, ведущий научный сотрудник лаборатории трансмиссивных инфекций Научного центра проблем здоровья семьи и репродукции человека.
Болотова Наталья Андреевна - младший научный сотрудник лаборатории трансмиссивных инфекций Научного центра проблем здоровья семьи и репродукции человека; e-mail: nataly2193@mail.ru
Миловидов Константин Сергеевич - лаборант-исследователь лаборатории трансмиссивных инфекций Научного центра проблем здоровья семьи и репродукции человека.
Кондратов Илья Геннадьевич - старший научный сотрудник лаборатории аналитической биоорганической химии Лимнологического института СО РАН; e-mail: kondratovig@mail.ru
Данчинова Галина Анатольевна - д-р биол. наук, руководитель лаборатории трансмиссивных инфекций Научного центра проблем здоровья семьи и репродукции человека; e-mail: dan-chin@yandex.ru
вый механизм контроля вирусной инфекции, действующий как на стадии входа вириона в клетку так и, возможно, за счет ограничения скорости синтеза геномной и/или репликатив-ных форм вирусной +РНК.
Исследование выполнено с использованием оборудования Центра коллективного пользования «ПЦР-диагностика» ФГБНУ НЦ ПЗСРЧ.
REFERENCES
1. Balahonov S.V., Nikitin A.Ya. i dr. Ekologo-parazitologicheskaya harakteristika sovmeschennyh ochagov infektsiy, peredavaemyh kleschami, na territorii provedeniya sammita ATES (2012 g.) // Sibirskiy med-itsinskiy zhurnal. Irkutsk, 2012. T. 111. № 4. S. 67-71.
2. Zlobin V.I. Kleshchevoy entsefalit v Ros-siyskoy Federatsii: sovremennoe sostoyanie problemy i strategiya profilaktiki // Voprosy virusologii. 2005. T. 50. № 3. S. 26-31.
3. Zlobin V.I., Gorin O.Z. Kleschevoy encefalit: Etiologiya. Epidemiologiya i profilaktika v Sibiri. Novosibirsk: Nauka. Sibirskaya izdatel'skaya firma RAN, 1996. 177 s.
4. Nikitin A.Ya., Noskov A.K., Andaev E.I. i dr. Epidemiologicheskaya situatsiya po kleschevomu virus-nomu entsefalitu v Rossiyskoy Federatsii v 2015 g. i prognoz na 2016 g. // Probl. osobo opasnyh inf. 2016; 1:40-43.
5. Hasnatinov M.A., Danchinova G.A., Zlobin V.I. i dr. Virus kleschevogo entsefalita v Mongolii // Si-birskiy medicinskiy zhurnal. Irkutsk, 2012. T. 111. № 4. S. 9-12.
6. Schwaiger M., Cassinotti P. Development of a quantitative real-time RT-PCR assay with internal control for the laboratory detection of tick borne encephalitis virus (TBEV) RNA // J Clin Virol. 2003; 27 (2):136-45.
7. Walpole R.E. et al. Probability & Statistics for Engineers & Scientists, 8th edition. ©2007, Pearson Cloth, p237..
Hasnatinov Maxim Anatolyevich -
Cand.Biol.Sci., leading researcher of laboratory of inoculable infections of Scientific center of problems of health of a family and reproduction of the person.
Bolotova Natalya Andreevna - junior researcher of laboratory of inoculable infections of Scientific center of problems of health of a family and reproduction of the person.
Milovidov Konstantin Sergeyevich - laboratory research assistant of laboratory of inoculable infections of Scientific center of problems of health of a family and reproduction of the person.
Kondratov Ilya Gennadevich - senior research associate of laboratory of analytical bioorganic chemistry of Limnological institute of the Siberian Branch of the Russian Academy of Science.
Danchinova Galina Anatolyevna - Doctor of Biology, Head of the Arthropod-borne Infection Laboratory at Scientific Centre of Family and Human Reproduction Health Aspects.
