CC BY
79
ISSN 0869-4362
Русский орнитологический журнал 2015, Том 24, Экспресс-выпуск 1123: 1072-1077
Количественная оценка пигментации скорлупы яиц у птиц: определение концентрации протопорфирина
С.А.Родионова, П.Д.Венгеров
Второе издание. Первая публикация в 2010*
Изучение биологии птиц тесным образом связано с исследованием оологического материала, в том числе окраски яиц. В понятие окраска яйца обычно вкладывают цвет основного фона и рисунок, то есть наличие пятен различной величины и формы, густоты и характера их размещения на поверхности и в толщине скорлупы, цвет этих пятен. Чаще всего описания окраски являются результатом визуальных наблюдений, и в разных литературных источниках они сильно расходятся или даже бывают противоречивы. В отношении рисунка предпринимались попытки относительной количественной оценки его густоты и особенностей размещения (Костин 1977; Климов 2003), но они оказались малопригодными для статистического анализа. Вместе с тем при характеристике окраски яиц ещё возможно использование показателей пигментации, то есть состава и количества пигментов, находящихся в скорлупе. Известно, что в формировании окраски скорлупы яиц у птиц принимают участие в основном два пигмента — биливердин, обусловливающий цвета от синего до зелёного, и протопорфирин, цвет которого изменяется от жёлтого до красного (Tammes 1964). Биливердин, самостоятельно или в сочетании с протопорфирином, создаёт фоновую окраску яиц, а протопорфирин обычно формирует рисунок в виде различных пятен, точек, штрихов и пр. Попытка определения уровня пигментации предпринималась и ранее (Титов и др. 1997), но она также носила относительный количественный характер.
Целью предлагаемой методики является точная оценка уровня пигментации скорлупы яйца, её количественное выражение. Полученные данные могут быть статистически обработаны и использованы при изучении внутрикладковой, внутрипопуляционной, межвидовой изменчивости окраски яиц, а также при сравнительном анализе пигментации скорлупы яиц более крупных таксонов. Методика основана на хорошо известном в химических исследованиях спектрофотометри-ческом анализе, который мы адаптировали к своим задачам.
* Родионова С.А., Венгеров П.Д. 2010. Количественная оценка пигментации скорлупы яиц у птиц: определение концентрации протопорфирина // Науч. ведомости Белгород ун-та. Сер. Естеств. науки 3 (74), 10: 56-60.
Для получения результатов высокой точности желательно анализировать скорлупу целого яйца. Использование небольших участков скорлупы не может дать точного представления о количественном содержании пигментов, поскольку они часто распределяются по поверхности скорлупы неравномерно. Выбранный участок может характеризоваться либо почти полным отсутствием пигментов, либо завышенным (по сравнению со средним для яйца) его содержанием.
В любом случае для проведения анализа пигментации необходимо знать промеры яйца — длину Ь и диаметр Д — которые можно снять с яйца при помощи штангенциркуля (с точностью до 0.1 мм). Используя эти исходные величины, по известным формулам вычисляют объём яйца (V = 0.51Ь\02) и площадь поверхности яйца (5Я = 4.83 Уя0-67). Полученные параметры необходимы для определения объёма экстрагирующей смеси для данного образца, а также при последующей математической обработке исследуемого материала.
В спектроскопических исследованиях пигментов яиц в качестве экстрагирующего реагента применяют смесь, состоящую из растворителя и концентрированной соляной кислоты в соотношении 1:2 (Калинин и др. 1971). В качестве растворителя удобнее всего использовать этиловый спирт С2Н5ОН, хотя возможно применение других веществ, способных растворять органические вещества билирубин-биливерди-нового ряда. Проведённые исследования с применением различных растворителей в экстрагирующей смеси показали идентичные результаты в выбранных образцах. Это даёт возможность сравнения результатов спектроскопических измерений вытяжек пигментов, полученных различными растворителями.
Экстрагирующая смесь готовится непосредственно перед анализом, т.к. её длительное хранение может привести к образованию различных перекислых и галогенсодержащих органических соединений, и хранится в ёмкости с притёртой крышкой во избежание изменения концентрации спирта при испарении (Большова и др. 2004).
Подготовленная скорлупа (предварительно очищенная от возможных загрязнений и подскорлуповых оболочек) помещается в пробирку или стаканчик (в зависимости от количества скорлупы), измельчается стеклянной палочкой (чем меньше будут осколки скорлупы, тем быстрее будет проходить реакция экстракции пигментов).
Экстрагирующая смесь приливается из расчёта 0.6 мл смеси на 1 см2 скорлупы (при пересчёте на каждую пробу). Реакция, как правило, протекает бурно с выделением пузырьков газа (что следует учесть при выборе ёмкости для экстракции). После прекращения реакции раствор центрифугируют в течение 5 мин при 1000 об./мин. Полученная надосадочная жидкость используется для дальнейшего анализа. Можно также вместо центрифугирования применять фильтрацию рас-
твора через ватный фильтр. Оба способа позволяют получить прозрачный экстракт (мутность может быть следствием остатка в исследуемом образце подскорлуповой оболочки и белка) - необходимое условие при спектроскопических измерениях.
Спектроскопические методы анализа основаны на способности атомов и молекул вещества испускать, поглощать или рассеивать электромагнитные излучения (Большова и др. 2004). Для предлагаемой методики возможно использование спектроскопических приборов различных типов и марок. Мы проводили анализ на спектрофотометре СФ-46 (ЛОМО), предназначенном для измерения коэффициентов пропускания жидких и твёрдых прозрачных веществ в области спектра от 190 до 1100 нм.
Все приготовленные по вышеописанной методике солянокислые вытяжки были прозрачны, но имели различную интенсивность окраски. Насыщенные растворы разводили (в зависимости от степени окрашенности) экстрагирующей смесью в 2-20 раз для получения наиболее точных результатов при снятии спектра поглощения. В дальнейшем степень разведения учитывали при пересчёте оптической плотности на 1 см2 скорлупы яйца.
Для приготовленных солянокислых вытяжек производили измерения оптической плотности А на описанном выше спектрофотометре СФ-46 при различном монохроматическом свете (лампа накаливания 0П-33-0.3) в интервале от 290 до 710 нм с шагом 10 нм. В качестве контроля использовали экстрагирующую смесь, которую настраивали на 0 при 290 нм с использованием сурьмяно-цезиевого фотоэлемента, щелью 1.0.
Для проведения измерений по пигментации яиц наиболее приемлемы кюветы с толщиной оптического слоя 1.5-3.0 мм, в противном случае необходимо произвести перерасчёт объёма вытяжки с тем, чтобы полученного раствора хватило для заполнения кюветы. Кроме этого, кюветы, используемые при сравнительном анализе пигментации яиц, также должны быть равномерного объёма. Нами использовались кварцевые кюветы с толщиной оптического слоя 2.0 мм.
Дополнительно для каждого образца (без разведения) были измерены показатели оптической плотности в точках максимумов поглощения пигментов: 377, 411, 557, 602 нм — сурьмяно-цезиевый элемент, щель 1.0; для 680 нм — кислородно-цезиевый элемент, щель 0.5. Максимум поглощения у протопорфирина приходится на 411, 557 и 602 нм, а у биливердина — 377 и 680 нм (Калинин и др. 1971). Также для более точного сравнения распределения оптической плотности пигментов у разных видов были сняты спектры наиболее характерных пиков максимумов поглощения (557 нм — протопорфирин, 680 нм — биливер-дин). Для пика 557 нм интервал 530-590 нм, шаг — 10 нм, сурьмяно-
цезиевый элемент, щель 1.0; для пика 680 нм интервал 650-710 нм, шаг — 10 нм, кислородно-цезиевый элемент, щель 0.5.
По полученным данным строили графики распределения оптической плотности А см2 в зависимости от длины волны А, предварительно произведя расчёт на 1 см2 скорлупы: А см2 = ЛУ/Б, где А — оптическая плотность образца, У — количество миллилитров экстрагирующей смеси для данного образца и Б - площадь поверхности исследуемой скорлупы яйца.
Так как оптическая плотность пигментов прямо пропорциональна их концентрации в растворе, то полученные данные дают возможность относительного количественного сравнения содержания пигментов в скорлупе яиц у разных видов. Чем выше пик в точках максимумов поглощения на графике, тем больше концентрация пигмента в образце.
Рис. 1. Распределение оптической плотности вытяжек пигментов в растворе на примере скорлупы яиц некоторых видов.
чибис-полевой жаворонок
Рис. 2. Распределение оптической плотности вытяжек пигментов в области 557 нм.
Например, на графике распределения оптической плотности вытяжек пигментов из скорлупы яиц грача Св^ыв frugilegus, полевого
жаворонка Alauda агиеп8(8 и чибиса УапвНив уапе11и8 в области 411 нм наблюдается увеличение оптической плотности у всех видов. Особенно оно велико у чибиса, относительно слабое у грача, а у полевого жаворонка занимает промежуточное значение. Данный пик (411 нм) характерен для пигмента протопорфирина и свидетельствует о его наличии у всех видов, но не в равном количестве (рис. 1). Небольшие пики видны также в области 557 нм, свойственные тому же протопорфи-рину. Лучше они просматриваются при снятии дополнительного спектра поглощения раствора при данной длине волны (рис. 2), о чём было сказано выше.
Для расчёта абсолютных значений концентрации протопорфирина в исследуемом материале вычислен коэффициент по градуировочному графику по стандартной методике (Алимарина, Иванова 1987). Для построения градуировочного графика были сняты спектры поглощения чистого протопорфирина*. Для этого приготовили ряд эталонных растворов данного вещества с известными концентрациями (5, 10, 20, 30, 40, 50 мкг) из 1 мг сухого протопорфирина, растворённого в 1 мл экстрагирующей смеси. Оптическую плотность всех растворов измеряли в точках максимумов поглощения: 557, 411, 602 нм.
С помощью коэффициента, отражающего зависимость между концентрацией эталонного протопорфирина и его оптической плотностью, определены абсолютные значения концентрации протопорфирина для каждого образца при пиках поглощения 411 и 557 нм (см. таблицу). Видно, что вычисленные средние значения концентрации по указанным пикам практически совпадают, так что не имеет смысла проводить дублирующие измерения, а можно ограничиться проведением анализа по одному из указанных выше пиков поглощения. Единицей измерения концентрации протопорфирина является мкг (микрограмм) на 1 см2 скорлупы.
Количественное содержание протопорфирина в скорлупе яиц некоторых видов птиц (мкг/см2)
Вид Величина выборки Среднее значение при А = 411 нм SE Среднее значение при А = 557 нм SE
Corvus frigilegus 10 58.13 0.126 58.13 0.263
Vanellus vanellus 8 218.9 0.942 218.9 1.515
Alauda arvensis 12 117.4 0.438 117.9 0.222
Предложенная методика исследования пигментов яиц открывает достаточно широкие возможности для исследования различных сторон биологии птиц. Протопорфирин, например, выполняет ведущую роль в
* Protoporphyrin IX disodium salt, Bio Chemika, for fluorescence, >90% (HPLC) 82512 Fluka 5086501-5 C34H32N4Na2O4 606,62 2-80C
создании покровительственной окраски яиц. Поэтому между его концентрацией в скорлупе и маскирующей функцией окраски должна наблюдаться положительная связь. Это хорошо иллюстрируют данные, приведённые в таблице. Чибис строит совершенно открытые гнезда на земле, в случае опасности его заранее покидает, покровительственная окраска яиц для него очень важна; концентрация протопорфирина наибольшая. У полевого жаворонка гнёзда также располагаются на земле, но они обычно скрыты в траве, самка насиживает очень плотно, необходимость в покровительственной окраске несколько ослабевает; концентрация протопорфирина снижается. Грачи гнездятся на деревьях, кладки во многом недоступны для наземных хищников, защищены большой колонией птиц; концентрация протопорфирина заметно меньше. Аналогичные сравнения в пределах семейства, рода или вида могут способствовать вскрытию механизмов гнездовых адаптаций птиц, важных для решения проблем экологии и эволюции.
Следует также отметить, что в последнее время исследователи стали отмечать взаимосвязь между интенсивностью окраски (фоновой и рисунка) и физиологическим состоянием самок (Moreno et al. 2006; Martinez-de et al. 2007). Кроме того, на интенсивность пигментации могут влиять негативные факторы внешней среды, связанные с химическим загрязнением. Точные оценки уровня пигментов для исследования данных феноменов совершенно необходимы.
Литер атур а
Алимарина И.П., Иванова В.М. (ред.). 1987. Практическое руководство по физико-
химическим методам анализа. М.: 1-208. Большова Т.А, Брыкина Г.Д., Гармаш А.В. и др. 2004. Основы аналитической химии. М.: 1-504.
Калинин Ф.Л., Лобов В.П., Жидков В.А. 1971. Справочник по биохимии. Киев: 1-739. Климов С.М. 2003. Эколого-эволюционные аспекты изменчивости ооморфологических
показателей птиц. Липецк: 1-208. Костин Ю.В. 1977. О методике ооморфологических исследований и унификации описаний оологических материалов // Методики исследования продуктивности и структуры видов птиц в пределах их ареалов. Вильнюс: 14-22. Титов С.В., Муравьев И.В., Логунова И.Ю. 1997. К вопросу изучения пигментации
скорлупы яиц птиц // Зоол. журн. 76, 10: 1185-1192. Martinez-de la P.J., Merino S., Moreno J., Tomas G., Morales J., Lobato E., Garcia-Fraile S., Martinez J. 2007. Are eggshell spottiness and colour indicators of health and condition in blue tits Cyanistes caeruleus? // J. Avian Biol. 38, 3: 377-384. Moreno J., Lobato E., Morales J., Merino S., Tomas G., Martinez-de la P.J., Sanz J.J., Mateo R., Soler J.J. 2006. Experimental evidence that egg color indicates female condition at laying in a songbird // Behav. Ecol. 17, 4: 651-655. Tammes P.M.L. 1964. Bird's egg shells, colour prints of nature // Ardea 52, 1/2: 99-110.
