CC BY
30
284
ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
Оригинальные статьи
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2020 УДК 616.637
Шедько Е.Д.1, Лазарева А.В.2, Зоркин С.Н.2, Новикова И.Е.2, Вершинина В.Г.2, Тимошина О.Ю.1, Головешкина Е.Н.1, Фисенко А.П.2, Акимкин В.Г.1
Количественная мультиплексная ПЦР в реальном времени как метод детекции значимой бактериурии у детей
'ФБУН Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, 111123, Москва, Россия;
2ФГАУ «Национальный медицинский исследовательский центр здоровья детей» Минздрава России, 119991, Москва, Россия
Введение. Инфекции мочевыводящих путей (ИМП) являются частыми формами патологии у детей. Бактериологические методы исследования требуют дорогостоящего оборудования и являются затратными. Целью работы явилось определение диагностических характеристик набора реагентов «АмплиСенс® ИМП-скрин-титр-FL» (Россия) для анализа бактери-урий и видового состава основных возбудителей ИМП у детей.
Материалы и методы. Проведён ретроспективный анализ 445 образцов мочи детей в возрасте от 4 нед до 17 лет. Образцы мочи анализировали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с детекцией в реальном времени с использованием набора реагентов «АмплиСенс® ИМП-скрин-титр-FL», предназначенного для количественного определения основных уропатогенов. Референсным методом явился посев биоматериала на селективной среде «URISELECT™» («Bio-Rad Laboratories») с последующей видовой идентификацией микроорганизмов методом MALDI-TOF MS («Bruker Daltonics»), а также с использованием баканализатора «Vitek 2» («BioMerieux»).
Результаты. Значимая бактериурия выявлена в 122 (27%) случаях. Самыми часто выявляемыми микроорганизмами являлись Escherichia coli (28%), Klebsiella pneumoniae (18%) и Enterococcus faecalis (14%). По данным ПЦР-анализа чувствительность и специфичность определения E. coli составили 100 и 99%, K. pneumoniae — 93 и 97%, E. faecalis — 91 и 94% соответственно. Чувствительность и специфичность ранее разработанной методики количественной ПЦР составили 92 и 95% соответственно.
Заключение. ПЦР с детекцией в реальном времени является многообещающим альтернативным методом определения как видовой принадлежности возбудителей ИМП, так и степени обсемененности при бактериурии.
Ключевые слова: уропатогенные бактерии; инфекции мочевыводящих путей; бактериурия; количественная ПЦР в реальном времени; дети.
Для цитирования: Шедько Е.Д., Лазарева А.В., Зоркин С.Н., Новикова И.Е., Вершинина В.Г. Тимошина О.Ю., Головешкина Е.Н., Фисенко А.П., Акимкин В.Г. Количественная мультиплексная ПЦР в реальном времени как метод детекции значимой бактериурии у детей. Российский педиатрический журнал. 2020; 23(5): 284-290. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/1560-9561-2020-23-5-284-290
Участие авторов: концепция и дизайн исследования — Шедько Е.Д., Лазарева А.В., Головешкина Е.Н.; сбор и обработка материала — Шедько Е.Д., Лазарева А.В., Новикова И.Е., Тимошина О.Ю.; статистическая обработка — Шедько Е.Д.; написание текста — Шедько Е.Д., Лазарева А.В.; редактирование — Зоркин С.Н., Вершинина В.Г., Фисенко А.П., Акимкин В.Г. Утверждение окончательного варианта статьи, ответственность за целостность всех частей статьи — все соавторы.
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Elizaveta D. Shedko1, Anna V. Lazareva2, Sergey N. Zorkin2, Irina E. Novikova2, Marina G. Vershinina2, Olga Yu. Timoshina1, Elena N. Goloveshkina1, Andrey P. Fisenko2, Vasily G. Akimkin1
Quantitative multiplex real-time PCR as a method for detection of significant bacteriuria in children
'Central Research Institute of Epidemiology, Moscow, 111123, Russia; 2National Medical Research Center for Children's Health, Moscow, 119991, Russia
Introduction. Urinary tract infections (UTIs) are the second most common of children's infections, yet current bacteriological methods often are time-consuming and require expensive equipment.
Aim of the study is evaluation of diagnostic characteristics of previously developed «AmpliSens® IMP-screen-titer-FL» kit (Central Research Institute of Epidemiology, Moscow) to quantitatively determine bacteriuria as well as the main species of uropatho-gens in children.
Materials and methods. A retrospective analysis of 445 urine samples collected in 2019 from patients of the urological department of the National Medical Research Center of Children's Health, aged from 4 weeks to 17 years was performed. Urine samples were analyzed with quantitative real-time PCR using the AmpliSens® IMP-screen-titer-FL reagent kit developed earlier for the quan-
Для корреспонденции: Шедько Елизавета Дмитриевна, мл. науч. сотр. лаб. молекулярной диагностики и эпидемиологии инфекций органов репродукции ФБУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора; e-mail: shedko@cmd.su
285
ORIGINAL ARTICLE
titative detection of significant uropathogens. As a reference method for assessing the diagnostic characteristics of the assay, we used the biomaterial inoculation method on URISELECT™ selective medium (Bio-Rad Laboratories, USA) followed by species identification of microorganisms using the MALDI-TOF MS method (Bruker Daltonics, Germany), as well as Vitek 2 bacterial analyzer (BioMerieux, France).
Results. All urine samples were analyzed with significant bacteriuria detected in 122 cases (27%). The most common bacteriuria causing pathogens were Escherichia coli (28%), Klebsiella pneumoniaе (18%), and Enterococcus faecalis (14%). Specificity and sensitivity of quantitative real-time PCR for E. coli were 100% and 99%, for K. pneumoniae were 93% and 97%, and for E. faecalis — 91% and 94%, respectively. The sensitivity and specificity for assay previously established in our laboratory were determined as 92% and 95%, respectively.
Conclusion. The established real-time quantitative PCR assay is a promising alternative method for determining both the UTI species identification and the titer of bacteria in bacteriuria.
Keywords: uropathogenic bacteria; urinary tract infections; bacteriuria; quantitative real-time PCR; children. For citation: Shedko E.D., Lazareva A.V., Zorkin S.N., Novikova I.E., Vershinina M.G., Timoshina O.Yu., Goloveshkina E.N., Fisenko A.P., Akimkin V.G. Quantitative multiplex real-time PCR as a method for detection of significant bacteriuria in children. Rossiyskiy Pediatricheskiy Zhurnal (Russian Pediatric Journal). 2020; 23(5): 284-290. (In Russian). DOI: http://dx.doi.org/10.18821/1560-9561-2020-23-5-284-290
For correspondence: Elizaveta D. Shedko, MD, junior researcher of the laboratory of molecular diagnostics and epidemiology of infection of reproductive organs, Central Research Institute of Epidemiology, Moscow, 111123, Russia. E-mail: shedko@cmd.su
Information about the authors:
Shedko E.D., Lazareva A.V., Zorkin S.N., Novikova I.E., Vershinina M.G., Timoshina O.Yu., Goloveshkina E.N., Fisenko A.P., Akimkin V.G.,
://orcid.org/0000-0003-4556-7513 ://orcid.org/0000-0003-3896-2590 ://orcid.org/0000-0002-4038-1472 ://orcid.org/0000-0003-4234-0209 ://orcid.org/0000-0001-6051-5231 ://orcid.org/0000-0001-8727-9734 ://orcid.org/0000-0002-0536-2874 ://orcid.org/0000-0001-8586-7946 ://orcid.org/0000-0003-4228-9044 Contribution: research concept and design — Shedko E.D., Lazareva A.V., Goloveshkina E.N.; material collection and processing — Shedko E.D., Lazareva A.V., Novikova I.E., Timoshina O.Yu.; statistical processing — Shedko E.D.; text writing — Shedko E.D., Lazareva A.V.; editing — Zorkin S.N., Vershinina V.G., Fisenko A.P., Akimkin V.G. Approval of the final version of the article, responsibility for the integrity of all parts of the article — all co-authors. Conflict of interest. The authors declare that there is no conflict of interest.
Received: September 17, 2020 Accepted: October 23, 2020 Published: November 06, 2020
https: https: https: https: https: https: https: https: https:
Введение
Инфекции мочевыводящих путей (ИМП) являются вторыми по частоте встречаемости формами патологии у детей [1]. Риск развития ИМП у детей младше 6 лет составляет 6,2% [2]. Распространенность ИМП в России составляет 18 случаев на 1000 детей, причём при госпитализации детей грудного и раннего возраста с лихорадочными состояниями в 10-15% случаев причиной тяжёлого состояния являются ИМП.
ИМП чаще встречается у девочек и нециркумизиро-ванных мальчиков [3], при этом до трёхмесячного возраста ИМП чаще встречается у мальчиков вне зависимости от циркумизации. Так, в возрасте до 6 лет 8% девочек и 2% мальчиков имеют хотя бы один эпизод ИМП [4]. ИМП у детей является причиной проблем мочеиспускания в 7,8% (95% доверительный интервал (ДИ) 6,6-8,9) случаев [5]. У младенцев ИМП является причиной заболевания при лихорадке в 7% случаев (95% ДИ 5,5-8,4) [5].
Распространёнными этиологическими агентами, вызывающими ИМП у детей, являются энтеробактерии, в особенности E. coli (79,7% случаев) [6, 7], а также бактерии родов Klebsiella, Serratia, Pseudomonas, Streptococcus [8]. В последнее время все чаще у новорождённых обнаруживаются ИМП, вызванные Staphylococcus saprophyticus и Streptococcus agalactiae [7].
Для скрининга мочи на лейкоцитурию и наличие микроорганизмов используются тестовые полоски и микроскопия осадка мочи [3]. Эти методы не являются специфич-
ными и не обладают чувствительностью по отношению к ИМП, однако имеют высокую отрицательную предсказательную ценность, если ИМП — наименее вероятный диагноз [9]. «Золотым стандартом» диагностики ИМП является бактериологический посев мочи. Критерии диагностики ИМП значительно различаются в зависимости от лабораторных данных и наблюдаемых клинических симптомов. Для диагностики ИМП у детей пороговое значение для бессимптомных пациентов составляет 105 КОЕ/мл, а для пациентов с симптомами ИМП — 104 КОЕ/мл. Количество бактерий ниже пороговых значений может быть показателем начала инфекции, бессимптомной бак-териурии, контаминации, а также может наблюдаться в том случае, если бактериологический посев мочи был произведен на фоне антимикробной терапии [3].
В последние годы находятся в разработке и применяются молекулярные методы диагностики ИМП, основанные на технологиях MALDI-TOF масс-спектрометрии, флюоресцентной гибридизации in situ и иммунофермент-ном анализе [10]. В области молекулярной диагностики ИМП активно разрабатываются тесты на основе полиме-разной цепной реакции (ПЦР). Установлено, что соответствие между ПЦР и культуральными исследованиями для ИМП составляет 90% (95% ДИ 85,7-93,6%) [11]. Тест-система «Unyvero Urinary Tract Infection (UTI) Cartridge» («Curetis», Германия) имеет маркировку CE-IVD и может быть использована для определения 88 уропатогенов. Данная тест-система обладает чувствительностью 95,6%
286.
ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
и специфичностью 99,3%, но её использование возможно только на оригинальных приборах «Unyvero A50» («Curetis», Германия) [12]. На количественной ПЦР основана также панель «Urinary Tract Infection Microbial DNA qPCR Array» («Qiagen», США), однако она не зарегистрирована для лабораторной диагностики.
В связи с этим целью нашей работы явилось определение диагностических характеристик набора реагентов «АмплиСенс® ИМП-скрин-титр-FL» (Россия) для анализа бактериурий и видового состава основных возбудителей ИМП у детей.
Материалы и методы
Проведён ретроспективный анализ 445 образцов мочи детей в возрасте от 4 нед до 17 лет. Пациенты отбирались случайным образом. Дизайн исследования одобрен локальным этическим комитетом. У всех пациентов или их родителей было получено информированное согласие. При установленном диагнозе общее количество клинически значимых бактериурий составило 72 случая, из них стриктура уретры — 30%, гидронефроз — 16%, врожденные аномалии развития мочевыводящих путей — 14%, мочекаменная болезнь — 12%. Лейкоцитурия при определенной референсным методом значимой бактериурии наблюдалась в 62% случаев.
Для всех образцов было проведено бактериологическое исследование путём посева биоматериала на среде «URISELECT™» («Bio-Rad Laboratories», США) с последующей инкубацией при 37°С в течение 24-48 ч. Посев осуществляли несекторным методом, петлёй 10 мкм, титр бактерий считали согласно клиническим рекомендациям [13]. Видовую идентификацию микроорганизмов подтверждали методом масс-спектрометрии по технологии
«MALDI-TOF MS» («Bruker Daltonics», Германия) и в бактериологическом анализаторе «Vitek 2» («BioMerieux», Франция).
В молекулярно-биологическую лабораторию образцы биоматериала передавались по мере накопления. В бактериологической лаборатории образцы хранились при -20°С. Передача материала происходила строго с соблюдением холодовой цепочки. Хранение образцов биоматериала до проведения экстракции ДНК осуществлялось при -70°С.
Экстракцию ДНК выполняли с помощью набора реагентов «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ эпидемиологии, Москва). Анализ проводили методом мультиплексной ПЦР в реальном времени с применением разработанного ранее набора реагентов «АмплиСенс® ИМП-скрин-титр-FL» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии, Москва) на амплификато-ре «Rotor-Gene 6000» в соответствии с инструкцией. Оценивали количественное содержание бактериальной ДНК в образце в геномных эквивалентах (ГЭ) на 1 мл мочи. Определяемые с помощью набора реагентов последовательности нуклеиновых кислот включали участки генов, строго специфичные для ДНК микроорганизмов (табл. 1).
Все полученные данные обработаны статистически. Доверительный интервал (95% ДИ) при расчёте доли лейкоцитурии при значимой бактериурии рассчитывали методом Уилсона. Стандартную ошибку среднего (cx) для стандартного отклонения выборочного среднего рассчитывали по выборке размера из генеральной совокупности. Чувствительность определяли как отношение истинно положительных образцов ко всем положительным образцам выборки, специфичность — как отношение истинно отрицательных образцов ко всем отрицательным образцам выборки, точность — как сумму всех верно определённых образцов в исследовании по отношению к общему количеству. Пороговые значения концентрации ДНК маркеров в исследуемых образцах определяли путём ROC-анализа по максимальной пропорции правильно классифицированных образцов. ROC-анализ проводили с использованием алгоритма ROC analysis [14]. Чувствительность и специфичность метода количественной ПЦР оценивали по отношению к результатам бактериологического анализа.
Результаты
Данные ROC-анализа
Пороговые значения для ДНК бактерий (рис. 1), ДНК Enterobacterales (рис. 2) и ДНК E. coli (рис. 3) составляли 1,4 х 106, 2,5 х 105 и 1,1 х 104 ГЭ/мл соответственно. Для остальных ДНК маркеров пороговые значения были установлены как 104 КОЕ/мл, согласно клиническим рекомендациям [13].
Оценка видового состава бактериурии в различных группах пациентов
При идентификации с помощью бактериологического посева уропатогенов при монопатогенных и сочетанных бактериуриях среди детей раннего возраста (от 4 нед до 12 мес) большую долю составили K. pneumoniaе (28%) и E. faecalis (22%). В группе пациентов в возрасте от 1 года до 3 лет большее число инфекций было вызвано E. coli (23%), E. faecalis (19%) и P. aeruginosa (19%). У пациентов дошкольного возраста (от 3 до 6 лет) распространён-
Таблица 1/Table 1 ДНК маркеры «АмплиСенс® ИМП-скрин-титр-FL» DNA markers «AmpliSens® UTI-screen-titre-FL»
ДНК маркер DNA marker
Систематическая принадлежность видов, входящих в диапазон определения набора реагентов Systematic affiliation of species included in the range for the detection by kit assay
ДНК энтеробактерий
Enterobacteriaceae
DNA
ДНК P. mirabilis P. mirabilis DNA ДНК энтерококков Enterococcus DNA ДНК K. pneumoniaе K. pneumoniaе DNA ДНК стафилококков Staphylococcus DNA ДНК E. coli E. Coli DNA ДНК P. aeruginosa P. aeruginosa DNA ДНК стрептококков Streptococcus DNA ДНК бактерий Bacterial DNA ДНК S. saprophyticus S. saprophyticus DNA
Бактерии порядка Enterobacterales, в том числе семейство Enterobacteriaceae Bacteria of the order Enterobacterales, including the family Enterobacteriaceae Бактерии вида P. mirabilis
P. mirabilis bacteria Бактерии рода Enterococcus
Enterococcus bacteria Бактерии вида K. pneumoniaе
K. pneumoniae bacteria Бактерии рода Staphylococcus Staphylococcus bacteria Бактерии вида E. coli E. coli bacteria Бактерии вида P. aeruginosa
P. aeruginosa bacteria Бактерии рода Streptococcus Streptococcus bacteria Микроорганизмы домена Бактерии Microorganisms domen Bacteria Бактерии вида S. saprophyticus S. saprophyticus bacteria
287
ORIGINAL ARTICLE
0,8 0,6 0,4 0,2 0
1
Рис. 1. ROC-анализ определения пороговой концентрации ДНК бактерий.
Fig. 1. ROC-analysis of the concentration threshold of bacterial DNA.
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0,5
Рис. 2. ROC-кривая определения пороговой концентрации ДНК Enterobacterales.
Fig. 2. ROC-analysis of the concentration threshold of Enterobacterales DNA.
1
0,8 0,6 0,4 0,2 0
0,5
Рис. 3. ROC-анализ определения пороговой концентрации ДНК E. coli.
Fig. 3. ROC-analysis of the concentration threshold of E. coli DNA.
ными инфекционными агентами были E. faecalis (23%) и P. aeruginosa (23%). У пациентов младшего школьного возраста (7-11 лет) часто встречающимися уропатогена-
ми были K. pneumoniae (27%) и E. faecalis (27%). У пациентов старшего школьного возраста (12 -17 лет) установлено, что среди бактериурий с идентифицированными возбудителями 23% составляют бактериурии, вызванные E. faecium (табл. 2).
Значимая бактериурия выявлена у 122 пациентов из 445, при этом у 70 пациентов уропатогены были определены референсным методом до видовой принадлежности, в то время как для 52 образцов флора была определена как смешанная бактериологическим методом.
Среди бактериурий, вызванных единственным определенным до вида референсным методом уропатогеном, большее распространение получили инфекции, вызванные E. coli (28%), K. pneumoniae (18%) и Enterococcus faecalis (14%) (табл. 3). При этом лейкоцитурия наблюдалась в 60% случаев. Высокими уровнями лейкоцитурии сопровождались инфекции, вызванные K. pneumoniae (x = 1426 кл/мкл), P. mirabilis (x = 932,6 кл/мкл) и M. morganii (x = 715,6 кл/мкл). При клинически значимых бактери-уриях, в которых патогены также были определены до вида референсным методом, 29% инфекций являлись со-четанными. В группе сочетанных инфекций превалирующими уропатогенами являлись K. pneumoniae (75%) и E. faecalis (50%) (табл. 2). Лейкоцитурия у этих пациентов наблюдалась в 71% случаев. Среднее количество лейкоцитов у детей с сочетанными инфекциями составило 410,4 кл/мкл, при этом большими показателями обладали инфекции, вызванные P. aeruginosa (x = 629 кл/мкл) и K. pneumoniae (x= 201,2 кл/мкл).
Для 52 случаев значимой бактериурии видовой состав с помощью бактериологического посева был определен как «смешанная флора», т.к. из одного образца было выделено несколько возбудителей, однако они не были идентифицированы до видовой принадлежности референсными методами. Анализ данных образцов методом количественной ПЦР выявил наличие более чем одного ДНК-маркера уропатогена. Распространёнными возбудителями при сочетанных бактериуриях являлись стафилококки (60%) и энтеробактерии (56%) (табл. 4). Для определения истинно положительных и ложноот-рицательных результатов при анализе в качестве рефе-ренсного значения использовали значение концентрации общей бактериальной ДНК.
Среди образцов пациентов со степенью обсеменённо-сти ниже порога 104 КОЕ/мл бактериурия установлена у 217 пациентов. Все случаи были определены с помощью референсного метода как вызванные смешанной флорой с неидентифицированными возбудителями. С помощью метода ПЦР показано, что большинство бактериурий было вызвано уропатогенами, не входящими в группу микроорганизмов, видовую принадлежность которых можно определить с помощью «АмплиСенс® ИМП-скрин-титр-FL».
Оценка диагностических характеристик метода количественной ПЦР в реальном времени
Чувствительность и специфичность метода количественной ПЦР в реальном времени по отношению к отдельным группам уропатогенов сравнивали с результатами, полученными с использованием бактериологического посева с последующей их идентификацией с помощью спектрометрического анализа MALDI-TOF MS (табл. 5). В сравнительный анализ включили 70 случаев, в которых уропатогены были определены до видовой принадлежности с помощью
1
0
1
1
288.
ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
Таблица 2/Table 2
Видовой состав инфекций с идентифицированным уропатогеном у детей разного возраста (доля пациентов, %) Species composition of infections with identified uropathogen in children of different ages (percentage of patients, %)
Уропатоген/Uropathogen Возраст пациентов Age of patients
4 нед-12 мес from 4 weeks to 12 months 1-3 года 1-3 years 3-6 лет 3-6 years 7-11 лет 7-11 years 12-18 лет 12-18 years
E. coli 17 23 8 18 15
P. aeruginosa 17 19 23 9 15
E. faecalis 22 19 23 27 15
E. faecium - - - 9 23
P. mirabilis 11 4 - - 8
K. pneumonia 28 12 15 27 -
Другие бактерии Other bacteria 6 23 31 27 23
Таблица 3/Table 3
Частота выявления различных видов бактерий, определенных референсным методом до видовой принадлежности Frequency of detection of different types of bacteria determined by the reference method to species
Доля пациентов, % Percentage of patients, % Вид патогена (рефе-ренсный метод) Pathogen species (reference method) Концентрация(референс-ный метод), КОЕ/мл Concentration (reference method), CFU/ml ДНК маркер («АмплиСенс® ИМП-скрин-титр-FL») DNA marker («AmpliSens® UTI-screen-titre-FL») Концентрация («АмплиСенс® ИМП-скрин-титр-FL»), ГЭ/мл Concentration («AmpliSens® UTI-screen-titre-FL»), genome equivalent/ml ИПР1/ЛОР2 TPRVFNR2
24 E. coli >105 E. coli >105 17/0
23 0.5 E. faecalis >104 <104 Enterococcus spp. >104 <104 16/0 1/0
21 0.5 K. pneumoniae >105 <104 K. pneumoniae >105 <104 13/1 1/0
21 P. aeruginosa >104 P. aeruginosa >104 14/1
7 E. faecium 104 Enterococcus spp. >104 4/0
6 0.5 Acinetobacter spp. >105 <104 ДНК бактерий / Bacterial DNA >105 <104 4/0 1/0
6 Enterobacter spp. >105 ДНК Enterobacterales / Enterobacterales DNA >105 4/0
5 P. mirabilis >105 Proteus spp. >105 4/0
4 M. morganii >105 ДНК Enterobacterales / Enterobacterales DNA >105 3/0
4 0.5 Candida spp. 104 <104 - - -
3 Klebsiella spp. >105 ДНК Enterobacterales Enterobacterales DNA >105 2/0
1 S. haemolyticus >104 Staphylococcus spp. >104 1/0
— ложноотрицательные результаты.
Примечание. 'ИПР — истинно положительные результаты; 2ЛОР Note. 'TPR — true positive results; 2FNR — false negative results.
референсного метода, вне зависимости от того, были ли они представлены значениями, характеризующими значительную бактериурию, или ниже порога (табл. 3).
Высокую чувствительность и специфичность при использовании ПЦР в реальном времени показали маркеры ДНК энтеробактерий (100 и 99% соответственно), ДНК P. mirabilis (100 и 98% соответственно), ДНК стафилококков (100 и 94% соответственно) и ДНК E. coli (100 и 99% соответственно) (табл. 4). Для маркеров ДНК стрептококков и ДНК Staphylococcus saprophyticus, ввиду отсутствия подтвержденных референсным методом образцов, в которых были бы обнаружены данные бактерии, не удалось рассчитать чувствительность. Несмотря на это, для них была показана достаточно высокая специфичность (табл. 5).
Обсуждение
Пороги определения бактериурии при различных клинических проявлениях ИМП у детей могут различаться. В нашем исследовании использовались образцы, для которых не были уточнены симптоматические проявления, в соответствии с этим в качестве порогового значения было принято значение 104 КОЕ/мл.
Частыми выявляемыми возбудителями бактериурий являлись E. coli (28%), K. pneumoniae (18%) и E. faecalis (14%). Распределение основных возбудителей бактериурий при иМп, определенных с помощью ранее разработанной методики ПЦР в реальном времени, соответствовало данным литературы [6-8].
289
ORIGINAL ARTICLE
Таблица 4/Table 4
Частота выявления различных видов бактерий при значимой бактериурии вызванной смешанной флорой у детей Frequency of detection of different types of bacteria in significant bacteriuria caused by mixed flora in children
Доля пациентов, % Percentage of patients, % Вид патогена (рефе-ренсный метод) Pathogen species (reference method) Концентрация (рефе-ренсный метод), КОЕ/мл Concentration (reference method), CFU/ml ДНК маркер («АмплиСенс® ИМП-скрин-титр-FL») DNA marker («AmpliSens® UTI-screen-titre-FL») Концентрация («АмплиСенс® ИМП-скрин-титр-FL»), ГЭ/мл Concentration («AmpliSens® UTI-screen-titre-FL»), genome equivalent/ml
60 >104 Staphylococcus spp. >104
56 >104 ДНК Enterobacterales Enterobacterales DNA >104
42 >104 E. coli >104
40 30 19 Смешанная флора Mixed flora >104 >104 >104 Enterococcus spp. Streptococcus spp. S. saprophyticus >104 >104 >104
13 >104 Proteus spp. >104
12 >104 ДНК бактерий Bacterial DNA >104
10 >104 P. aeruginosa >104
Таблица 5/Table 5 Критерии выявления клинически значимой бактериурии методом ПЦР в реальном времени Criteria for detecting clinically significant bacteriuria by real-time polymerase chain reaction
Исследуемый ДНК маркер DNA marker ИПР1, n TPR1, n ЛПР2, n FPR2, n ЛОР3, n FNR3, n ИОР4, n TNR4, n Чувствительность, % Sensitivity, % Специфичность, % Specificity, % Точность5, % Accuracy, %
ДНК энтеробактерий Enterobacterales DNA 43 5 0 397 100 99 99
ДНК P. mirabilis P. mirabilis DNA 4 11 0 430 100 98 98
ДНК энтерококков Enterococcus DNA 21 24 2 398 91 94 94
ДНК K. pneumoniaе K. pneumoniaе DNA 1 11 1 419 93 97 97
ДНК стафилококков Staphylococcus DNA 1 28 0 416 100 94 94
ДНК E. coli E. coli DNA 17 5 0 423 100 99 99
ДНК P. aeruginosa P. aeruginosa DNA 14 5 1 425 93 99 99
ДНК стрептококков Streptococcus DNA 0 16 0 429 - 96 96
ДНК бактерий Bacterial DNA 271 12 68 88 80 89 82
ДНК S. saprophyticus S. saprophyticus DNA 0 14 0 431 - 97 97
Примечание. 'ИПР — истинно положительные результаты; 2ЛПР - ложноположительные результаты; 3ЛОР — ложноотрицательные результаты; 4ИОР — истинно отрицательные результаты; 'процентное соотношение истинных предсказанных значений к общим.
Note. 'TPR — true positive results; 2FPR — false positive results; 3FNR — false negative results; 4TNR — true negative results; 'proportion of correct among the total number of cases.
Бактериологический метод может быть необходимым этапом для определения наличия резистентности к антимикробным препаратам выделенного уропатогена [15, 16], однако в настоящее время ведётся разработка других методов детекции антибиотикорезистентности [17-19]. Другие методы, имеющие широкое применение в клинической практике, такие как микроскопическое исследование или нитратный тест, обладают достаточно низкими чувствительностью и специфичностью [10]. MALDI-TOF-спектрометрия проявляет высокую чувствительность при идентификации чистой культуры и занимает короткое время, однако требует дорогостоящего оборудования [20].
Чувствительность для основных уропатогенов ранее разработанного набора реагентов «АмплиСенс® ИМП-
скрин-титр-FL» по сравнению с бактериологическим методом составила 93-100%, специфичность — 94-99%, точность — 94-99% при определении как вида патогенов, так и их количества. Наименьшие чувствительность и специфичность были показаны при определении общей бактериальной ДНК и составили 80 и 89% соответственно, однако данный критерий при анализе используется опционально в качестве вспомогательного.
Нами показано, что с помощью метода ПЦР в реальном времени было определено 96,5% значимых бактери-урий, в том числе сочетанных, в сравнении с референсным методом посева биоматериала на среде «uRlSELECT™» («Bio-Rad Laboratories», США) с последующей видовой идентификацией микроорганизмов, подтвержденной методом масс-спектрометрии по технологии MALDI-TOF
ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
MS («Bruker Daltonics», Германия) и в бактериологическом анализаторе «Vitek 2» («BioMerieux», Франция).
Авторы предполагают, что разработанный ранее метод количественного определения бактерий в моче, основанный на ПЦР в реальном времени, в клинической практике является одним из перспективных альтернативных методов диагностики бактериурий при ИМП. Использование данного метода позволит не только ускорить проведение анализа, но и точно определить видовой состав, в том числе сочетанных бактериурий, что позволит врачам ускорить подбор антимикробной терапии.
ЛИТЕРАТУРА (п.п. 1-3; 5-7; 9-12; 14-17; 20 см. References)
4. Есаян А.М., Нимгирова А.Н. Инфекции мочевых путей у детей: этиопатогенез, клиническая картина, диагностика, современные подходы к терапии. Непрерывное профессиональное образование. 2012; 11(5): 79-84. 8. Захарова И.Н., Мачнева Е.Б., Мумладзе Э.Б., Ивахненко Ю.И. Диагностика и лечение инфекций мочевых путей у детей: что нового? Медицинский совет. 2017; (1): 180-5. https://doi. org/10.21518/2079-701X-2017-1-180-185 13. Козлов Р.С., Меньшиков В.В., Михайлова В.С., Шуляк Б.Ф., Долгих Т.И., Круглов А.Н. и др. Стандартизованная технология «Бактериологический анализ мочи». М., 2014; 31.
18. Фисенко А.П. Охрана здоровья детей в России: история и задачи Десятилетия детства (к 255-летию государственной системы охраны здоровья детей). Российский педиатрический журнал. 2018; 21(5): 260-7. https://doi.org/10.18821/1560-9561-2018-21-5-260-267
19. Алябьева Н.М., Бржозовская Е.А., Пономаренко О.А., Лазарева А.В., Фисенко А.П. Резистентность к антибиотикам Streptococcus pneumoniae, выделенных от детей в Москве до и после внедрения 13-валентной пневмококковой конъюгирован-ной вакцины. Российский педиатрический журнал. 2020; 23(4): 216-21. https://doi.org/10.18821/1560-9561-2020-23-4-216-222
REFERENCES
1. Millner R., Becknell B. Urinary tract infections. Pediatr. Clin. North Am. 2019; 66(1): 1-13. https://doi.org/10.1016/j.pcl.2018.08.002
2. Conway P.H., Cnaan A., Zaoutis T., Henry B.V., Grundmeier R.W., Keren R. Recurrent urinary tract infections in children: risk factors and association with prophylactic antimicrobials. JAMA. 2007; 298(2): 179-86. https://doi.org/10.1001/jama.298.2.179
3. Kaufman J., Temple-Smith M., Sanci L. Urinary tract infections in children: an overview of diagnosis and management. BMJPaediatr. Open. 2019; 3(1): e000487. https://doi.org/10.1136/bmjpo-2019-000487
4. Esayan A.M., Nimgirova A.N. Urinary tract infections in children: etiology and pathogenesis, clinical manifestation, diagnostics, modern approaches to therapy. Nepreryvnoe professional'noe obrazo-vanie. 2012; 11(5): 79-84. (in Russian)
5. Shaikh N., Morone N.E., Bost J.E., Farrell M.H. Prevalence of urinary tract infection in childhood. Pediatr. Infect. Dis. J. 2008; 27(4): 302-8. https://doi.org/10.1097/INF.0b013e31815e4122
6. Becknell B., Schober M., Korbel L., Spencer J.D. The diagnosis, evaluation and treatment of acute and recurrent pediatric urinary tract infections. Expert. Rev. Anti Infect Ther. 2015; 13(1): 81-90. https://doi.org/10.1586/14787210.2015.986097
7. Palagin I.S., Sukhorukova M.V., Dekhnich A.V., Edelstein M.V., Perepanova T.S., Kozlov R.S., et al. Antimicrobial resistance of pathogens causing community-acquired urinary tract infections in Russia: results of the multicenter study «DARMIS-2018». Clin. Microbiol. Antimicrob. Chemother. 2019; 21(2): 134-46. https://doi. org/10.36488/cmac.2019.2.134-146
8. Zakharova I.N., Machneva E.B., Mumladze E.B., Ivakhnenko Yu.I. Diagnosis and treatment of urinary tract infections in children: what's new? Meditsinskiy sovet. 2017; (1): 180-5. https://doi. org/10.21518/2079-701X-2017-1-180-185 (in Russian)
9. Fritzenwanker M., Imirzalioglu C., Chakraborty T., Wagenlehner F.M. Modern diagnostic methods for urinary tract infections. Expert. Rev. Anti Infect Ther. 2016; 14(11): 1047-63. https://doi.org/10.1080/14 787210.2016.1236685
10. Davenport M., Mach K.E., Shortliffe L.M.D., Banaei N., Wang T.H., Liao J.C. New and developing diagnostic technologies for urinary tract infections. Nat. Rev. Urol. 2017; 14(5): 296-310. https://doi. org/10.1038/nrurol.2017.20
11. Wojno K.J., Baunoch D., Luke N., Opel M., Korman H., Kelly C., et al. Multiplex PCR based Urinary Tract Infection (UTI) analysis compared to traditional urine culture in identifying significant pathogens in symptomatic patients. Urology. 2020; 136: 119-26. https://doi.org/10.1016/j.urology.2019.10.018
12. Curetis N.V. Curetis launches CE-IVD marked Unyvero Urinary Tract Infection (UTI) Cartridge at ECCMID 2018. Available at: http://hugin.info/171382/R/2185364/844513.pdf
13. Kbzlov R.S., Ме^ЬЫ^ V.V.,Mikhaylova V.S., Shulyak B.F., Dolgikh T.I., Kruglov A.N et al. Standardized technology "Bacteriological analysis of urine". Moscow, 2014; 31.
14. Eng J. ROC analysis: web-based calculator for ROC curves. Baltimore: Johns Hopkins University. Baltimore: Johns Hopkins University; 2014.
15. Radmayr C., Bogaert G., Dogan H.S., Kocvara R., Nijman J.M., Stein R., et al. Paediatric UrologyEAUGuidelines. Barcelona: European Association of Urology; 2019.
16. Ahmed S.S., Shariq A., Alsalloom A.A., Babikir I.H., Alhomoud B.N. Uropathogens and their antimicrobial resistance patterns: Relationship with urinary tract infections. Int. J. Health Sci. (Qassim). 2019; 13(2): 48-55.
17. Fluit A.C., Visser M.R., Schmitz F.J. Molecular detection of antimicrobial resistance. Clin. Microbiol. Rev. 2001; 14(4): 836-71. https://doi.org/10.1128/CMR.14.4.836-871.2001
18. Fisenko A.P. Children's health protection in Russia: the history and objectives of the Decade of childhood (to the 255th anniversary of the state system of child health protection). Rossiyskiy pediatri-cheskiyzhurnal. 2018; 21(5): 260-7. https://doi.org/10.18821/1560-9561-2018-21-5-260-267 (in Russian)
19. Alyab'eva N.M., Brzhozovskaya E.A., Ponomarenko O.A., Laza-reva A.V., Fisenko A.P. Antibiotic resistance of Streptococcus pneumoniae isolated from children in Moscow before and after the introduction of 13-valent pneumococcal conjugate vaccination. Rossiyskiy pediatricheskiy zhurnal. 2020; 23(4): 216-21. https:// doi.org/10.18821/1560-9561-2020-23-4-216-222 (in Russian)
20. Zboromyrska Y., Rubio E., Alejo I., Vergara A., Mons A., Campo I., et al. Development of a new protocol for rapid bacterial identification and susceptibility testing directly from urine samples. Clin. Microbiol. Infect. 2016; 22(6): 561.1-1.6. https://doi.org/10.1016/j. cmi.2016.01.025
Поступила 17.09.2020 Принята к печати 23.10.2020 Опубликована 06.11.2020
Сведения об авторах:
Лазарева Анна Валерьевна, зав. лаб. микробиологии ФГАУ «НМИЦ здоровья детей», e-mail: lazarevaav@nczd.ru; Зоркин Сергей Николаевич,зав. урологическим отд-нием с группами репродукто-логии и трансплантации ФГАУ «НМИЦ здоровья детей»; Новикова Ирина Евгеньевна, мл. науч. сотр. лаб. молекулярной микробиологии, ФГАУ «НМИЦ здоровья детей»; Вершинина Марина Германовна, руководитель лабораторного отдела ФГАУ «НМИЦ здоровья детей»; Тимошина Ольга Юрьевна, ФБУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора, науч. сотр. ЛМДиЭ ИОР e-mail: timoshina@ cmd.su; Головешкина Елена Николаевна, ФБУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора, зав. лаб. ЛМДиЭ ИОР, e-mail: goloveshki-na@cmd.su; Фисенко Андрей Петрович, доктор мед. наук, проф., директор ФГАУ «НМИЦ здоровья детей»; Акимкин Василий Геннадьевич, директор ФБУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнад-зора, e-mail: akimkin@pcr.ms
