CC BY
15КЛОНИРОВАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ МАЛОЙ ИНГИБИ-РУЮЩЕЙ РНК, СПЕЦИФИЧНОЙ К МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗЕ 1 ЧЕЛО-ВЕКА, В ЭКСПРЕССИОННЫЙ ВЕКТОР pGPV-17019250
Могулевцева Юлия
студентка
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования, «Российский государственный аграрный университет» (МСХА им. К.А. Тимирязева)
Мезенцев Александр Викторович кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова» (ИОГен РАН)
CLONING A SEQUENCE OF SMALL HARPIN RNA SPECIFIC TO HUMAN METALLOPROTEINASE 1 INTO THE EXPRESSION VECTOR pGPV-17019250
Mogulevtseva Ju., student, Russian State Agrarian University - Moscow Timiryazev Agricultural Academy
Mezentsev A.V., PhD, senior researcher, Russian Institute of General Genetics - IOGen RAS
АННОТАЦИЯ
ВВЕДЕНИЕ: Металлопротеиназы это группа ферментов, необходимых, прежде всего, для поддержания постоянства состава межклеточного про-странства. При псориазе металлопротеиназы участвуют в структурных пере-стройках эпидермиса, модифицируя контакты между отдельными клетками, а также состав межклеточного матрикса. Помимо этого, металлопротеиназы способствуют росту новых капилляров в дерме, что облегчает проникновение в эпидермис клеток иммунной системы.
ЦЕЛЬЮ данной работы было получение вектора для экспрессии малой интерферирующей РНК, специфичной к мРНК металлопротеиназы 1 человека, для последующих исследований роли металлопротеиназы 1 при псориазе.
МЕТОДЫ: Для проведения дизайна миРНК использовали электронный ре-сурс "RNAi-designer". Для клонирования выбранной последовательности в экс-прессионный вектор использовали коммерческие наборы реагентов и ферментов: рестрикционные эндонуклеазы (EcoRI и BamH1) и T4 ДНК-лигазу. Результаты клонирования подтверждали методами ПЦР и ДНК-секвенирования.
РЕЗУЛЬТАТЫ: В данном исследовании нами была отобрана последовательность малой ингибирующей РНК, направленной против мРНК металлопротеиназы 1 человека, и проведена проверка ее специфичности. После этого мы получили двухцепочечную ДНК, которая кодирует выбранную последовательность, и провели ее клонирование в экспрессионный вектор pGPV-17019250.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ: Полученный в данной работе вектор кодирует последовательность малой ингибирующей РНК, которая специфична к мРНК металлопротеиназы 1 человека. Этот вектор может быть использован для экспрессии упомянутой миРНК в клетках человека, в частности, при проведении экспериментальных исследованиях псориаза.
ABSTRACT
INTRODUCTION: Metalloproteinases is a group of enzymes that play a crucial role in the maintenance of the extracellular matrix. In psoriasis, metalloproteinases contribute to epidermal remodeling due to their ability to modify intracellular contacts and adjust the composition of the extracellular matrix. Metalloproteinases also promote angiogenesis in the dermis and facilitate penetration of the epidermis by immune cells.
AIM of this research was to obtain a vector that would encode small interfering RNA directed against human metalloproteinase 1 and could be used to study the role of human metalloproteinase 1 in psoriasis.
METHODS: shRNA specific to MMP1 was designed using "RNAi-designer" online tool. Commercially available restriction endonucleases EcoRI, BamH1 and T4 DNA-ligase were used for cloning the designed shRNA encoding sequence into the expression vector. Methods of PCR analysis and DNA-sequencing were used to confirm that the sequence encoding the mentioned shRNA was successfully cloned.
RESULTS: In this study, we selected a sequence of shRNA directed against human metalloproteinase 1 and verified its specificity. Then, we obtained a double-stranded DNA that encoded the mentioned shRNA and cloned it into the expression vector pGPV-17019250.
IN CONCLUSION, we report of a vector that encodes a sequence of small inter-fering RNA, which is specific to human metalloproteinase 1. This vector can be used in experimental studies of psoriasis to regulate the expression of human MMP1.
Ключевые слова: щитовидная железа, иммуноглобулины, аутоантитела к тиреоглобулину, аутоантитела к тирео-пероксидазе, тироксин, трийодтиронин.
Keywords: psoriasis, metalloproteinase 1, cloning, vector, small interfering RNA, transfection.
ВВЕДЕНИЕ да Псориаза США, примерно 125 миллионов людей в мире,
Псориаз это хроническое, иммуноопосредованное за- то есть 2-3 % от общего населения планеты болеют псориа-болевание кожи. Со-гласно данным Национального Фон- зом [1]. К сожалению, вылечить псориаз пока нельзя, а су-
ществующие медицинские препараты позволяют контролировать болезнь только в течение определенного периода времени. По этой причине, поиск наиболее эффективных методов лечения псориаза является актуальной социально значимой задачей, которая требует безотлагательного решения. Прежде всего, для лечения болезни необходимо знать, каким образом происходит образование псориати-ческих бляшек и как можно воздействовать на этот процесс. Для этого необходимо установить основных участников патогенеза псориаза, а также определить их роль в развитии болезни. Непосредственно, нашей главной задачей является исследование роли металлопротеиназы 1 (ММП1) в патогенезе псориаза.
Металлопротеиназы это группа ферментов, которые играют ключевую роль в поддержании постоянства состава межклеточного матрикса [2]. Для патогенеза псориаза металлопротеиназы, прежде всего, важны тем, что они участвуют в структурных перестройках эпидермиса и ан-гиогенезе. Кроме этого, активная секреция металлопроте-иназ приводит к увеличению проницаемости капилляров дермы, облегчая проникновение в кожу заболевшего человека клеток иммунной системы. Немаловажно, что нарушения в экспрессии некоторых металлопротеиназ (например, ММП1, ММП9 и ММП12) совпадают по времени с обострением псориаза, а их уровень коррелирует со степенью тяжести болезни. По этой причине важно уметь контролировать экспрессию металлопротеиназ в пораженных псориазом участках кожи. В скором будущем одним из способов контроля экспрессии металлопротеиназ может стать РНК-интерференция, то есть непосредственное воздействие на мРНК, которые кодируют металлопротеина-зы, направленными против них малыми ингибирующи-ми РНК (миРНК). Целью данной работы было получение вектора, который кодировал бы последовательность миР-НК, специфичной к мРНК металлопротеиназы 1 человека (ММП1 миРНК) с перспективой его дальнейшего использования в экспериментальной работе, прежде всего, - для избирательного снижения уровня ММП1 в клетках человека, которые поражены болезнью.
МАТЕРИЛЫ И МЕТОДЫ
Для решения поставленной задачи были исследованы последовательности кДНК, которые кодируют ММП1 человека (NM_001145938.1 и NM_002421.3) [3]. При помощи электронного ресурса «RNAi designer» (Clontech, США) [4], для каждой из упомянутых последовательностей были отобраны короткие фрагменты ДНК длинной 19 нукле-отидов. Полученные короткие фрагменты проверяли на специфичность к ММП1 человека, используя базу данных «Primer-Blast» (NIH, США) [5], а также на способность к образованию элементов вторичной структуры (димеров и т.н. «шпилек») при помощи электронного ресурса "Oligo Calc" (США) [6]. Затем, используя электронный ресурс «RNAi designer» (Clontech), для выбранного фрагмента проводили дизайн последовательности, кодирующей ми-РНК.
Последовательность, кодирующую миРНК, клонировали в экспрессионный вектор pGPV-17019250 (Евроген, Россия). Клонирование проводили по сайтам рестрикции BamH1 и EcoRI. Обработанный рестрикционными эндо-
нуклеазами вектор (время инкубации 2 ч при температуре 37°C) наносили на агарозный гель (1%) для проведения электрофореза. По окончании электрофореза область геля, которая содержала нужный для клонирования фрагмент электрофоретически чистой плазмидной ДНК, переводили в раствор KJ. Для этого образец прогревали в течение 5 мин при температуре 55°C в присутствии 6M KJ. После растворения агарозы ДНК концентрировали, используя метод анионно-обменной адсорбции на стеклянном порошке (т.н. «glass milk») [7].
Двухцепочечную ДНК, которая кодирует ММП1 миРНК, получали из комплементарных одноцепочечных нуклеотидов посредством «отжига», т.е. постепенного охлаждения на воздухе эквимолярной смеси этих олиго-нуклеотидов от температуры 95°C до комнатной температуры. Затем проводили лигирование упомянутых выше двухцепочечного олигонуклеотида и очищенного из геля фрагмента ДНК в количественном соотношении 10:1. Для проведения лигирования использовали от 2.5 до 12.5 единиц активности фермента T4 ДНК лигазы (Thermo Fisher, США) из расчета на 1 мкг ДНК.
Полученным в результате лигирования вектором трансфецировали E. coli. Трансфекцию проводили методом теплового шока. Непосредственно для проведения трансфекции образцы, содержавшие продукты лигазной реакции и компетентные клетки E. coli (штамм "XL Blue", Thermo Fisher), последовательно охлаждали на льду (4°C, 30 мин) и прогревали в термоблоке (42°C, 2 мин), после чего, быстро охлаждали на льду в течение 5 мин [8]. Транс-фецированные клетки отбирали на среде LB, содержавшей 1% бакто-агар, в присутствии антибиотика-ампициллина (12 мкг/мл). Общее количество бактериальных клонов, устойчивых к ампициллину, определяли при помощи компьютерной программы ImageJ (NIH, США).
После подсчета общего количества клонов в образцах из нескольких слу-чайным образом выбранных клонов получали плазмидную ДНК, которую затем проверяли на возможное присутствие в ней сиквенса, кодирующего ММП1 миРНК. Проверку проводили при помощи метода ПЦР. Для
проведения ПЦР использовали специфические прай-меры EXT-F: ACGTGAAATGTCTTTGGATTTGGG и EXT-R CAGAGAGACCCAGTAGAAGCA. Продукты ПЦР-реакции разделяли при помощи электрофореза в агарозном геле (2%). Правильность клонирования ММП1 миРНК проверяли методом ДНК-секвенирования. Для секвенирования использовали упомянутые выше прайме-ры. Результаты секвенирования анализировали при помощи компьютерной программы SnapGene Viewer (SnapGene, США).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Анализ последовательностей кДНК, кодирующих ММП1 (NM_001145938.1 и NM_002421.3), проведенный при помощи электронного ресурса "RNAi-designer" (Clontech), человека выявил 12 коротких фрагментов ДНК, которые можно использовать для дизайна миРНК (Таблица 1). Для дальнейших исследова-ний мы выбрали восемь фрагментов ДНК, которые встречаются как в NM_001145938.1, так и в NM_002421.3. Проверка этих
фрагментов ДНК на специфичность к ММП1 при помощи электронного ресурса «Primer-Blast» (NCBI) позволила отобрать 5 сиквенсов (Таблица 2), у которых, согласно результатам проведенного анализа, нет существенной гомологии (70% и более) с кДНК других генов. После этого нами была проведена проверка оставшихся коротких фрагментов кДНК на способность к образованию элементов вторичной структуры, таких как димеры и т.н.
«шпильки». Результаты проведенной проверки показали, что только один из проверенных сиквенсов (Таблица 2, последовательность №5) может образовывать элементы вторичной структуры. При этом другие проверенные оли-гонуклеотиды (Таблица 2, последовательности №2, 6-8) элементов вторичной структуры не образуют и могут быть использованы в дальнейшей работе.
Таблица 1.
Перечень коротких фрагментов из последовательностей, кодирующих ММП1 человека, которые были отобраны электронного ресурса "К.МА1^е81§пег" для дизайна специфичной миРНК
№ Н омера доступа исследуемых последовательностей кГ НК в базе данных "NCBI Nucleotide"
N M 001145938.1 ' NM 002421.3
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 102-CCATCACTTACCTTGCACT-120* 106-CACTTACCTTGCACTGAGA-124 206-GCTGAAAGTGACTGGGAAA-224 380-GGACCATGCCATTGAGAAA-398 393-GAGAAAGCCTTCCAACTCT-411 429-CTGACATTCACCAAGGTCT-447 522-GGAGGAAATCTTGCTCATG-540 603-CAACAATTTCAGAGAGTAC-621 679-CTGATATCGGGGCTTTGAT-697 712-CCTTCAGTGGTGATGTTCA-730 102-CCATCACTTACCTTGCACT-120 106-CACTTACCTTGCACTGAGA-124 200-TTCCCAGCGACTCTAGAAA-218 224-GAGCAAGATGTGGACTTAG-242 258-GCTGAAAGTGACTGGGAAA-276 532-GGACCATGCCATTGAGAAA-550 545-GAGAAAGCCTTCCAACTCT-563 581-CTGACATTCACCAAGGTCT-599 674- GGAGGAAATCTTGCTCATG-692 745- CAACAATTTCAGAGAGTAC-763
* - соответствующие цифры в начале и в конце строки указывают на месторасположение первого и последнего нуклеотидов в исследуемой последовательности кДНК
Таблица 2.
Результаты проверки отобранных коротких фрагментов ДНК на гомологию с кДНК других генов и на способность к образованию элементов вторичной структуры
Возможность образования #
№
Проверяемая последовательность
Гомология с кДНК других генов*_
димеров
шпилек
1. 2.
3.
4.
5.
6. 7.
_8.
CCATCACT TACCT TGCACT CACT TACCT TGCACTGAGA GCTGAAAGTGACTGGGAAA GGACCATGCCAT TGAGAAA GAGAAAGCCT TCCAACTCT CTGACATTCACCAAGGTCT GGAGGAAATCTTGCTCATG CAACAATTTCAGAGAGTAC
да нет да да нет нет нет нет
нет
да нет нет нет
нет
нет нет нет нет
проверку на гомологию с кДНК других генов проводили при помощи электронного ресурса "Prime-blast"; проверку на способность к образованию элементов вторичной структуры проводили при помощи электронного ресурса "Oligo Calc".
Для последующего дизайна миРНК, специфичной к ММП1 кДНК, исполь-зовали один из четырех фрагментов ДНК, прошедших предварительную проверку (Таблица 2, последовательность №8), который выбрали из числа отобранных при проверке фрагментов случайным образом. Олигонуклеотид, использованный нами для клонирования в вектор (Рисунок 1), представлял собою двухцепочечную ДНК. Верхняя половина полученного сиквенса состояла из нескольких участков: фрагментов сайтов рестрикции БсоШ и БашИ1, необходимых для клонирования в вектор pGPV-17019250, последовательности, кодирующей миРНК
(т.н. «sense sequence» - Таблица 2, последовательность №8), и комплементарной ей последовательности (т.н. "antisense sequence"). Помимо этого, сиквенс двухцепочечной ДНК включал серединный некомплиментарный участок ДНК, необходимый для образования "шпильки" между кодирующей последовательностью и комплементарной ей последовательностью по окончании транскрипции миРНК. В свою очередь, нижняя (антипараллельная) последовательность кДНК была комплементарна верхней за исключением выступающих участков, относящихся к сайтам рестрикции EcoRI и BamHl.
5 1 -QatCCGCAACAATTTCAC^GAGTACAATTCAAGACATTGTACTCTCTGAAATTGXTGTTTT■ГГACGCGTQ-----3'
31 -™ ■-- -дССТТСТТАААОТСТСТСАТСТГААбТТСТСТААСАТСАСАСАСТТТААСААСААААААТССССАСС С ¿1 а-Ь *
Рисунок 1. Последовательность двухцепочечного олигонуклеотида, кодирующего ММП1 миРНК, выбранного для клонирования в экспрессионный вектор р0РУ-17019250. Последовательность, кодирующая миРНК, и комплементарная ей последователь-ность обозначены серым цветом и располагаются на рисунке с левой и правой сторон, соответственно, серединный фрагмент (т.н. "шпилька") выделен полужирным шрифтом, фраг-менты сайтов рестрикции БашИ1 и ЕсоШ обозначены строчными буквами и расположены с левого и с правого краев сиквенса, соответственно.
и очистку из геля высокомолекулярного фрагмента ДНК (7,852 н.п.), который был необходим для клонирования. После этого электрофоретически чистый фрагмент плаз-мидной ДНК лигировали с описанным выше двухцепочеч-ным олигонуклеотидом, кодирующим ММП1 миРНК. По окончании лигазной реакции аликвоту реакционной смеси (10 мкл) использовали для трансфекции E. coli.
М V
10,000 3,000 ->
6,000^
5,000 ->
4,000
3,000 2,500
2,000 1,500
Рисунок 2. Разделение фрагментов вектора pGPV-17019250 после его обработки ре-стрикционными эндонуклеазами BamH1 и EcoRI. M- 1 kB маркеры ДНК; V- фрагмент вектора (7,852 н.п.)
Стратегия по клонированию полученной последовательности в вектор р0РУ-17019250 (7,911 н.п.) предусматривала проведение следующих экспериментальных процедур: обработки вектора р0РУ-17019250 рестрикци-онными эндонуклеазами ЕсоШ и ВашИ1, разделение образовавшихся в ходе реакции фрагментов ДНК (7,852 и 59 н.п.) методом электрофореза в агарозном геле (Рисунок 2)
Анализ полученных результатов показал, что эффективность проведенной трансфекции существенным образом зависела от соотношения фермента и общего количества используемой ДНК (Рисунок 3а-в). Так, максимальное количество трансфецированных бактериальных клонов было получено нами при использовании 7.5 единиц активности Т4-ДНК лигазы на 1 мкг ДНК (Рисунок 3г). При этом, в других образцах (Рисунок 3а и в), т.е. там, где было использовано 2.5 и 15 единиц активности лигазы на 1 мкг ДНК, соответственно, количество клонов, устойчивых к
ампициллину, оказалось в несколько раз меньше. В свою очередь, проверка плазмидной ДНК, полученной из трех случайным образом отобранных клонов, проведенная методом ПЦР, показала присутствие ПЦР-продукта необходимого нам размера (154 н.п.) в каждом из исследованных образцов (Рисунок 4). Наконец, анализ одного из упомянутых выше трех образцов подтвердил, что выделенная нами из E. coli плазмида действительно содержит последовательность, кодирующую ММП1 миРНК (Рисунок 5).
Рисунок 3. Трансформация E. coli, продуктами лигазной реакции. А, Б и В - образцы, полученные с использованием 2.5, 7.5 и 12.5 ед. активности коммерческого препарата T4 ДНК лигазы, соответственно. Г - результаты подсчета общего количества ампициллин - устойчивых клонов в образцах.
ОБСУЖДЕНИЕ
Феномен РНК-интерференции имеет важное физиологическое значение. Природные ингибирующие РНК (РНКи) играют, прежде всего, регуляторную роль. Взаимодействуя с мРНК определенного гена, РНКи способствуют их деградации. В свою очередь, полная или частичная деградация мРНК приводит к снижению уровня целевого белка, то есть того белка, который кодируют специфичные мРНК. По этой причине РНКи удобно использовать для избирательного воздействия на экспрессию генов, если она повышена при определенном заболевании. Например, таким геном может быть ген, кодиру-ющий ММП1. Возможность регулировать экспрессию ММП1 для нас важна
по нескольким причинам. Во-первых, уровень экспрессии ММП1 повышен в пораженной псориазом коже. Во-вторых, экспрессия ММП1 коррелирует с тяжестью заболевания. В-третьих, ММП1 непосредственно принимает участие в структурной перестройке эпидермиса, которая сопровождает образование псориатических бляшек. Фактически, активная секреция ММП1 способствует изменению состава межклеточного матрикса кожи и облегчает миграцию клеток. По этим причинам нам необходимо иметь вектор, который будет способен экспрессировать миРНК, специфичную к ММП1 мРНК, что в перспективе позволит нам контролировать экспрессию ММП1 в клетках кожи человека.
Рисунок 4. ПЦР образцов плазмидной ДНК, полу-ченных из трансформированных клонов E.coli. M - 100 bp маркеры ДНК; 1-3 - амплификация фрагмента ДНК (154 н.п.) в образцах плазмидной ДНК, полученных из трансформированных клонов E. coli; N - отри-цательный контроль - проба, не содержавшая плаз-мидной ДНК. Последовательности праймеров, ис-пользованных для ПЦР, указаны в разделе "Материалы и методы".
Для решения этой задачи мы установили последовательность, которая кодирует специфичную к ММП1 миР-НК (Рисунок 1), клонировали эту последовательность в экспрессионный вектор pGPV-17019250 (Рисунок 6) и от-секвенировали участок ДНК, содержавший клонированную последовательность (Рисунок 5). В ходе работ нами было показано, что выбранный короткий фрагмент кДНК представляет лишь один из нескольких возможных вариантов, прототипы которых представлены в Таблице 1, и которые также соответствуют всем необходимым критериям, предъявляемым к дизайну миРНК [9]. Выбирая целевую последовательность для дизайна миРНК, мы про-
верили представленные в Таблице 1 короткие фрагменты кДНК на специфичность к ММП1 кДНК (Таблица 2), а также на способность к образованию элементов вторичной структуры, таких как димеры и т.н. «шпильки» (Таблица 2). Первое было необходимо, чтобы, по возможности, избежать взаимодействия ММП1 миРНК с мРНК других генов (т.н. «off-target effects» [10]). Второе,- чтобы обеспечить правильное взаимодействие комплементарных олигонуклеотидов при их «отжиге», т.е. непосредственно перед их клонированием в экспрессионный вектор. В результате мы установили 4 коротких фрагмента кДНК, которые можно было использовать для дальнейшей работы.
Рисунок 5. Секвенирование образца плазмидной ДНК из клона E. coli, полученного по-сле трансформации бактерий продуктами лигазной реакции. А - секвенирование плаз-мидной ДНК с праймером EXT-F; Б - секвенирование плазмидной ДНК с праймером EXT-R. На рисунке обозначены клонированная последовательность и сайты взаимодействия ре-стрикционных эндонуклеаз с ДНК. Последовательности праймеров, использованных для проведения секвенирова-ния приведены в разделе "Материалы и методы".
Рисунок 6. Схематическое изображение вектора pGPV-17019250. На рисунке обозначе-ны ген фактора устойчивости к ампициллину (AmpR) и его промотор (AmpR promoter), ген зеленого флуоресцентного белка (CopGFP) и его промотор (CMV promoter), ген фактора устойчивости к пуромицину (PuroR), промотор для экспрессии ММП1 миРНК (H1) и энхансер (5' LTR). Область ДНК, в которую была клонирована последовательность располагается между "сайтами рестрикции" EcoRI и BamH1. Кроме этого, указано месторасположение праймеров EXT-F и EXT-R, которые мы использовали для секвенирования. Последовательности EXT-F и EXT-R приведены в разделе "Материалы и методы".
Экспрессионный вектор pGPV-17019250 (Рисунок 6) является генетически модифицированным лентивирусом, из генома которого удалены несколько генов, непосредственно связанных с инфекционным процессом. В настоящее время, вектора лентивирусного происхождения являются эффективным средством для доставки практически любых генов в клетки млекопитающих и их последующей экспрессии, в т. ч. в неделящихся трудно трансдуцируе-мых первичных клетках человека. Примечательно, что в геном pGPV-17019250 было добавлено несколько генов, которых не было в геноме исходного вируса. Например, для воспроизводства вектора в E. coli добавлен фактор устойчивости к антибиотику-ампициллину AmpR, а для экспрессии представляющего интерес гена, такого как последовательность, кодирующая ММП1 миРНК в клетках человека - фактор устойчивости к пуромицину (PuroR) и флуоресцентный белок CopGFP (Рисунок 6). Фактор устойчивости к пуромицину необходим для того, чтобы отобрать трансдуцированные лентивирусом клетки человека на селективной среде, содержащей антибиотик-пуро-мицин, а флуоресцентный белок COPgfp - для того, чтобы иметь воз-можность контролировать трансдукцию визуально, т.е. по изменению флуорес-ценции в клетках.
Непосредственно для клонирования выбранной последовательности (Рисунок 1) мы использовали «сайты рестрикции» EcoRI и BamH1. В виду особенностей строения вектора pGPV-17019250 данная комбинация рестрик-ционных эндонуклеаз представляется нам оптимальной, поскольку в этом случае обработка вектора эндонуклеаза-ми не затрагивает близлежащих регуляторных элементов: промотора H1, с которого, собственно, и должна происходить экспрессия ММП1 миРНК, и 5'-LTR - сиквенса, который необходим для интеграции последовательности, кодирующей ММП1 миРНК в геном клетки человека.
Полученные нами результаты, прежде всего, свидетельствуют о том, что при трансфекции E. coli продуктами лигазной реакции (Рисунок 3) необходим подбор оптимального соотношения используемых в реакции компонентов. Прежде всего, это относится к фрагменту вектора, который необходим для клонирования (Рисунок 2), и синтетического олигонуклеотида (Рисунок 1). Это также относится к используемому для проведения реакции коммерческому препарату T4 ДНК лигазы. Последнее подтверждается снижением общего количества устойчивых к ампициллину клонов в образце, полученном при использовании 12.5 единиц активности T4 ДНК лигазы, по сравнению с образцом, полученном при использовании 7.5 единиц активности T4 ДНК лигазы (Рисунки 3б и в, соответственно). Одной из наиболее вероятных причин такого снижения может быть присутствие в препарате фермента неспецифических экзо- и эндонуклеаз [11]. В свою очередь, действие неспецифических экзо- и эндонуклеаз может вызвать появление мутаций в сиквенсе лигирован-ного вектора и, во многих случаях, привести к вектором функциональности. Представляется очевидным, что нежелательные последствия от присутствия сторонних экзо-и эндонуклеаз в виде снижения эффективности трансфек-ции будут тем заметнее, чем выше будет их концентрация в реакционной среде, что, собственно, и подтверждают
полученные нами результаты (Рисунок 3г).
Соответственно, чтобы снизить риск из-за возможных ошибок при проведении клонирования, мы отобрали произвольным образом 3 клона E. coli из числа тех, для получения которых были использованы 7.5 единиц активности Т4-ДНК лигазы. ДНК выбранных клонов необходимо было проверить на присутствие клонированной последовательности. Затем, нам также было необходимо удостовериться в том, что сиквенс ДНК, который располагается в полученном нами векторе между сайтами рестрикции BamHl и EcoRI (Рисунок 5), совпадает с той последовательностью, которую мы клонировали (Рисунок 1).
Для решения первой задачи мы провели ПЦР со специфическими праймерами, которые фланкируют нужный нам фрагмент ДНК. Ожидаемо, полученные нами результаты ПЦР (Рисунок 4) показали, что при использовании в качестве матрицы для ПЦР плазмидной ДНК, полученной из вышеупомянутых клонов, размер ПЦР-продукта составляет ~150 н.п., что близко расчетному значению (154 н.п.).
Для решения второй задачи мы выбрали метод ДНК-секвенирования. При этом, чтобы упростить интерпретацию результатов, мы использовали для секвени-рования уже упомянутую выше пару праймеров. Таким образом, во-первых, мы секвенировали ДНК в обоих направлениях. Во-вторых, обе секвенированные последовательности содержали нужный нам фрагмент. Наконец, в-третьих, секвенированные нами последовательности перекрывались друг с другом, что позволило нам исследовать т.н. «junction regions», т.е. определить, как именно клонированный олигонуклеотид соединен с pGPV-17019250. При этом, несмотря на то, что для проведения ДНК-секвенирования, мы использовали только один из имевшихся у нас трех образцов плазмидной ДНК, нам удалось подтвердить, что секвенированный участок, действительно, содержит последовательность гена ММП1 миРНК (Рисунок 5), т.е. именно ту последовательность, которую мы изначально собирались клонировать (Рисунок 1).
В заключении, мы хотели бы отметить, что нами получен вектор pGPV-17019250-ММШ, в котором между «сайтами рестрикции» BamH1 и EcoRI находится последовательность, которая кодирует ММП1 миРНК. Нами были также получены клоны E. coli, для наработки этого вектора в бактериях. В дальнейшем мы предполагаем использовать вектор pGPV-17019250-ММШ для изучения роли ММП1 в патогенезе псориаза.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Sabat, R., et al., Immunopathogenesis of psoriasis. Exp Dermatol, 2007. 16(10): p. 779-98.
2. Mezentsev, A., A. Nikolaev, and S. Bruskin, Matrix metalloproteinases and their role in psoriasis. Gene, 2014. 540(1): p. 1-10.
3. Database «NCBI Nucleotide», http://www.ncbi.nlm. nih.gov/nuccore/ (accessed at May 6, 2016).
4. Online Application «RNAi designer», http://bioinfo. clontech.com/rnaidesigner/frontpage.jsp (accessed at May 6, 2016).
5. Online Application «Primer-Blast», http://www.ncbi. nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ (accessed at May 6, 2016).
6. Online Application «Oligo Calc», http://biotools. nubic.northwestern.edu/OligoCalc.html (accessed at May 6, 2016).
7. Vogelstein, B. and D. Gillespie, Preparative and analytical purification of DNA from agarose. Proc Natl Acad Sci U S A, 1979. 76(2): p. 615-9.
8. Huff, J.P., et al., Optimization of routine transformation of Escherichia coli with plasmid DNA. Biotechniques, 1990.
9(5): p. 570-7.
9. Гринев, В.В., Разработка и контроль качества коротких интерферирующих РНК. Мол. Биология, 2012. 46(6): с. 827-845.
10. Boese, Q., et al., Mechanistic insights aid computational short interfering RNA design. Methods Enzymol, 2005. 392: p. 73-96.
11. Kuhn, H. and M.D. Frank-Kamenetskii, Template-independent ligation of single-stranded DNA by T4 DNA ligase. FEBS J, 2005. 272(23): p. 5991-6000.
ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ТРОМБОЦИТОВ У БОЛЬНЫХ С МНОГО-ФОРМНОЙ ЭКССУДАТИВНОЙ ЭРИТЕМОЙ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ
ПОЛОСТИРТА
Почтарь Виктория Николаевна,
кандидат медицинских наук Государственное учреждение «Институт стоматологии Национальной акаде-мии медицинских наук Украины»,
Одесса
THE DIAGNOSTIC VALUE OF PLATELETS COUNT IN PATIENTS WITH EXUDATIVE ERYTHEMA MULTIFORM OF ORAL MUCOSA
Pochtar Viktoriya Nikolaevna, Candidate of medical sciences, State Establishment «The Institute of Stomatology of the National academy of medical science of Ukraine», Odessa
АННОТАЦИЯ
Представлены данные о тенденции показателя среднего объема тромбоцитов (MPV) у больных с многоформной экс-судативной эритемой слизистой оболочки полости рта легкой и средней степеней тяжести.
ABSTRACT
The data of tendency of mean platelet volume (MPV) in patients with exudative erythema multiform of oral mucosa of light and medium degree of heaviness have been presented.
Ключевые слова: тромбоциты, средний объем тромбоцитов (MPV), многоформная экссудативная эритема.
Keywords: platelets, mean platelet volume (MPV), exudative erythema multiform.
Тромбоциты являются переносчиками антител. Они осуществляют фагоцитоз микробных и паразитарных клеток. Тромбоциты являются депо различных биологических веществ и, высвобождая их в процессе активации, принимают участие в различных общеорганизменных защитных реакциях типа тромбообразования, воспаления, иммунного ответа [8, 13]. Изменение функционального состояния тромбоцитов косвенно указывает на функциональные возможности эндотелия и может быть показателем тяжести поражения сосудистой стенки [9, 13, 15]. Функциональная активность тромбоцитов в норме и патологии выступает фактором, определяющим реологические свойства крови и в значительной степени адекватность ок-сигенации и трофики тканей [1, 11, 14]. При эндогенной интоксикации в плазме крови накапливаются токсические субстанции, нарушая мембрану тромбоцита и межклеточное взаимодействие. Авторы В.П. Власова, Г.А. Дроздова, А.Г. Захаркин и др. в процессе эксперимента установили, что у животных (половозрелые собаки) уже в раннем послеоперационном периоде происходит синдром эндогенной интоксикации с вовлечением в патологический процесс тромбоцитов, изменение их морфо-функциональных характеристик [3].
По данным трансмиссионной электронной микроскопии тромбоциты имеют трехслойную плазматическую
мембрану, подобную мембранам других клеток. В их цитоплазме различают гиаломер (гиалоплазму) и грануло-мер. Под грануломером понимают совокупность гранул, расположенных в цитоплазме гранулоцитов. Среди них плотные гранулы, альфа-гранулы, системы открытых и закрытых канальцев, митохондрии, и др. В плотных гранулах накапливается АДФ, серотонин, ионы кальция. Альфа-гранулы содержат фактор 4 тромбоцитов, бета-тром-боглуболин, тромбоспондин, фибронектин, фиброноген, фактор Виллебранда, факторы роста. Есть также лизосо-мы, с гидролитическими ферментами.
Трофическая и защитная функции тромбоцитов изучены недостаточно. Установлено, что нормально функционирующие тромбоциты ускоряют заживление ран и восстановление поврежденных внутренних органов, повышают фагоцитарную функцию лейкоцитов, в том числе, натуральных киллеров. Благодаря наличию на их поверхности специальных рецепторов - TLRs (Toll-like receptors) тромбоциты немедленно реагируют на любой бактериальный антиген. Состояние врожденного иммунитета зависит от качественного и количественного состава тромбоцитов. Данная зависимость доказана на практике, однако не получила должной научной оценки.
Ведущая роль тромбоцитов - процесс свертывания крови и их участие в репаративных процессах, а также
