CC BY
36Ученые записки Таврического национального университета им. В. И. Вернадского Серия «Биология, химия». Том 26 (65). 2013. № 1. С. 10-15.
УДК 633.822:581.143.6
КЛОНАЛЬНОЕ МИКРОРАЗМНОЖЕНИЕ И ОЗДОРОВЛЕНИЕ MENTHA PIPERITA L. IN VITRO
Бугара И.А.
Таврический национальный университет им В.И.Вернадского, Симферополь, Украина
E-mail: igorbugara@gmail com
Показана возможность клонального микроразмножения и оздоровления мяты перечной (Mentha piperita L.) на основе культуры изолированных меристем in vitro. Использование модифицированной питательной среды Мурасиге и Скуга, содержащей ИУК 0,5 мг/л, кинетин 0,1 мг/л, 6-БАП 1,0 мг/л и рибавирин 5 мг/л позволяет получать и массово размножать свободные от вирусной инфекции растения-регенеранты.
Ключевые слова: Mentha piperita L., клональное микроразмножение, оздоровление.
ВВЕДЕНИЕ
На современном этапе развития биологической науки большое внимание уделяется поиску нетрадиционных подходов, позволяющих существенно обогатить отдельные её отрасли новыми методами, успешно зарекомендовавшими себя не только в области теоретических исследований, но и на практике. Одним из таких подходов является получение безвирусного посадочного материала методом культуры изолированных клеток, тканей и органов растений in vitro. В последние годы методы культуры тканей находят всё большее применение для получения и оздоровления перспективных видов и сортов, используемых в производстве [1, 2]. Вместе с тем, недостаточно внимания уделяется исследованиям по оздоровлению и размножению дикорастущей флоры, которая является исходным материалом для создания промышленных сортов. Несомненно, необходима разработка эффективных технологий размножения и производства высококачественного безвирусного посадочного материала на принципиально новой методической основе. Перспектива создания таких технологий связана с разработкой приёмов клонального микроразмножения на основе комплекса методов культуры изолированных тканей и органов in vitro. Техника in vitro позволяет наиболее полно реализовать потенциал растений к вегетативному размножению и является на сегодняшний день главной составляющей современных биотехнологий клонирования и производства посадочного материала в экономически развитых странах мира.
Исследования по получению посадочного материала мяты на основе биотехнологических подходов, выполненные в Украине в основном проводились на перспективных промышленных сортах [3]. Дикорастущие виды Mentha piperita L., Mentha spicata L., Mentha arvensis L., Mentha viridis L. и некоторых другие, в подобных исследованиях использовались недостаточно.
Наряду с этим, возрастающий спрос на эфирное масло мяты диктует необходимость разработки эффективных биотехнологических способов оздоровления и клонального микроразмножения дикорастущих видов, для их последующего использования при создании промышленных сортов.
В связи с этим, целью настоящей работы являлась разработка приемов массового размножения и оздоровления M. piperita на основе использования комплекса методов культуры изолированных клеток, тканей и органов in vitro.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Для экспериментальных исследований in vitro использовали растения M. piperita выращенные в условиях закрытого грунта. Апикальные, латеральные меристемы и вегетативные почки выделяли под бинокулярным микроскопом МБИ-10 при помощи скальпеля и специально изготовленной для этой цели препаровальной иглы ланцетовидной формы с острыми, режущими краями. При проведении экспериментальных работ использовали методы, общепринятые в исследованиях по культуре изолированных клеток, тканей и органов растений [4]. Экспланты помещали на поверхность модифицированной агаризованной питательной среды Мурасиге и Скуга [5], содержащей 0,5 мг/л ИУК (индолилуксусная кислота), 0,1 мг/л кинетин, 1,0 мг/л 6-БАП (6-бензиламинопурин). В качестве культуральных сосудов использовали химические пробирки 1,5 х 16 см с 10 мл питательной среды. Для гарантированного получения оздоровленных от вирусной инфекции растений M. piperita в состав питательной среды добавляли вироцид рибавирин (1^-0-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3-карбоксамид, «Sigma-Aldrich», США) в концентрации 5 мг/л [6].
Диагностику растений M. piperita и растений полученных в культуре изолированных меристем проводили на растениях-индикаторах. В качестве растений-индикаторов были использованы Nicotiana glutinosa L., Nicotiana rustica L., Nicotiana tabacum L. var. Havana, Nicotiana tabacum L. var. Samsun, Petunia hybrida Hort. Заражение проводилось механически на стадии 4-8 листьев. С каждого образца отбирали 1 г растительного материала, измельчали в фарфоровой ступке с 2 мл экстрагирующего буфера. Листья травянистых растений-индикаторов натирали полученным гомогенатом с помощью беличьей кисточки и оставляли на 10 - 15 минут, излишки гомогената смывали дистиллированной водой. Зараженные растения помещали в теплицу при положительной температуре 23 - 26 оС. Результаты диагностики отмечали через 7 - 12 суток после возможного инфицирования растений с учетом местной реакции [2].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Начальным этапом исследований по получению оздоровленного посадочного материла M. piperita, являлась первичная диагностика донорных растений на наличие вирусной инфекции. Для разработки методики получения оздоровленного посадочного материала мяты, нами были обследованы на наличие или отсутствие вирусов растения без внешних симптомов поражения. Исследования показали, что при использовании растений-индикаторов, проявление внешних симптомов значительно варьировало. Так,
местная реакция Nicotiana glutinosa L. в ответ на втирание гомогената, полученного из листьев M. piperita проявилась в появлении некротических пятен в местах поражения. При втирании гомогената в листья Nicotiana tabacum L. var. Havana, Nicotiana tabacum L. var. Samsun, Petunia hybrida Hort. было отмечено появление характерных хлорозных пятен. Вместе с тем, на растениях Nicotiana rustica L. визуальных симптомов вирусного поражения обнаружено не было. В дальнейшем растения, гомогенат, из листьев которых выявил положительную реакцию на вирусную инфекцию, не использовали. По результатам биотестирования количество безвирусных растений составило 40% от общего числа исследуемых.
При разработке методики клонального микроразмножения и оздоровления M. piperita существенное значение имеет размер исходного экспланта. Известно, что экспланты большего размера обладают лучшей способностью к приживаемости и дальнейшему развитию, по сравнению с эксплантами меньшего размера. Вместе с тем, при использовании минимального по размеру экспланта повышается вероятность получить оздоровленные от вирусной инфекции растения-регенеранты.
В ходе выполнения настоящего исследования была изучена зависимость между размерами эксплантов изолированных меристем M. piperita и их способностью к морфогенезу и регенерации in vitro (табл. 1).
Таблица 1
Количество эксплантов, способных к морфогенезу и регенерации растений, в зависимости от их размера, %
Конус нарастания 0,25-0,31мм Меристемы с 1 парой примордиев 0,48-0,53 мм Меристемы с 2 парами примордиев 1,22-1,31 мм Меристемы с 3 парами примордиев 1,47-1,61 мм Вегетативны е почки 2,11-2,25 мм
0,0 57,7 ± 3,9 83,9 ± 1,3 96,6 ± 1,9 97,8 ± 1,1
Способность эксплантов к морфогенезу в условиях in vitro оценивали визуально по появлению первой пары листьев и началу регенерации микропобегов. Исследования показали, что с увеличением размера экспланта способность к морфогенезу повышалась. Лучшей способностью к морфогенезу и регенерации обладали меристемы размером 1,22 - 1,61 мм, а также вегетативные почки. В обоих случаях количество эксплантов, способных регенерировать микропобеги, составляло 83,9 - 96,6 %.
Таким образом, для разработки приемов клонального микроразможения и оздоровления M. piperita целесообразно использовать меристемы с 2 парами листовых примордиев, размером 1,22 - 1,31 мм, приживаемость которых в условиях in vitro достигает 83,9 %. При этом повышается вероятность получения микрорастений, свободных от вирусной инфекции.
Первые видимые признаки морфогенеза в культуре изолированных меристем M. piperita связанные с развертыванием первой пары листьев обнаруживались на 18 - 20 сутки культивирования. Через 7 - 10 суток наблюдалось формирование основного микропобега и признаки развития дополнительных микропобегов. На 75-е сутки количество микропобегов достигало от 2 до 5 штук, при этом они имели нормальную морфологию, 4 - 7 пар листьев и хорошо развитую корневую систему (рис.1).
Рис. 1. Развитие растений-регенерантов в культуре изолированных меристем Mentha piperita L.: а) 40 сутки, б) 70 сутки культивирования.
Для повышения коэффициента размножения нами была изучена возможность сочетания культуры изолированных меристем с черенкованием микропобегов в условиях in vitro (рис. 2).
Рис.2. Черенкование растений-регенерантов Mentha piperita L. in vitro: а) 5 сутки, б) 70 сутки культивирования.
С этой целью изолированные меристемы выращивали на питательной среде до достижения максимального коэффициента размножения. Полученные микропобеги разделяли на 3 - 5 узлов (стеблевых сегментов с одной парой листьев) и каждый узел переносили на питательную среду того же состава. Полный цикл выращивания при использовании модифицированной питательной среды Мурасиге и Скуга составлял до 70 суток. Первым видимым проявлением морфогенеза являлась
быстрая регенерация микропобегов из пазушных меристем. Через 15 - 17 суток обнаруживалось множественное побегообразование и развитие корневой системы.
Через 70 суток культивирования количество микропобегов достигало 5 - 15 штук, при этом они имели нормальную морфологию, 4 - 7 пар листьев и хорошо развитую корневую систему.
Препарат рибавирин в концентрации 5 мг/л добавляли в состав питательной среды на этапе культивирования изолированных меристем. Повторное биотестирование растений-регенерантов проводили после 45 суток адаптации in vivo. Применение этапа повторного тестирования позволяет показать реальный эффект использования культуры in vitro и возможность дальнейшего внедрения разработанной нами серии приемов в производство для массового размножения и оздоровления M. piperita. Совместное использование препарата рибавирин с культурой изолированных меристем и вегетативных почек позволяет получить до 100% оздоровленных микрорастений мяты перечной.
В процессе адаптации растений-регенерантов к условиям in vivo определяли их приживаемость в различных субстратах (табл. 2). Лучшая приживаемость (97,5 %) наблюдалась при использовании в качестве субстрата смеси, состоящей из равных частей торфа и керамзита. Через 45 суток выращивания растений in vivo длина побегов увеличивалась в среднем в 3 раза, а количество листьев на побегах у всех изучаемых сортов в среднем 1,7 раза. Наряду с этим, в 1,7 раза увеличивалась длина и в 2,7 раза - количество корней.
Таблица 2
Биометрические показатели растений M. piperita в процессе выращивания в
Длина основного побега, мм Количество пар листьев на основном побеге, шт Количество корней, шт Длина корней, мм
1-е сутки 45-е сутки 1-е сутки 45-е сутки 1-е сутки 45-е сутки 1-е сутки 45-е сутки
50,5±1,3 152,0±3,9 4,2±0,3 7,2±0,3 4,3 ± 0,1 7,2 ± 0,4 38,0 ± 0,3 106,0±2,5
После 45 суток адаптации растений-регенерантов в субстрате из смеси торфа и керамзита их пересаживали в пластиковые стаканы объёмом 200 мл с почвой и доращивали в условиях закрытого грунта.
В дальнейшем растения, выращенные из меристемной культуры, высаживали в условия открытого грунта. Подготовку почвы и высадку растений проводили по традиционной схеме, как при посадке мяты рассадой [7]. Высаженные растения нормально проходили все фазы вегетационного развития.
ВЫВОДЫ
1. Показана возможность клонального микроразмножения и оздоровления мяты перечной (Mentha piperita L.) на основе культуры изолированных меристем in vitro.
2. Использование модифицированной питательной среды Мурасиге и Скуга, содержащей ИУК 0,5 мг/л, кинетин 0,1 мг/л, 6-БАП 1,0 мг/л и рибавирин 5 мг/л позволяет получать и массово размножать свободные от вирусной инфекции растения-регенеранты.
Список литературы
1. Диагностика вирусных болезней и биотехнологические приёмы получения безвирусного посадочного материала косточковых плодовых культур / [Митрофанова О.В., Славгородская-Куприева Л.Е., Митрофанова И.В., Лукичева Л.А.] - Ялта: Издательство Крымпресс, 2000. - 45 с.
2. Сенчугова Н.А. Вiруснi хвороби основних ефiроолiйних культур Кримського регюну: автореф. дис. на здобуття наук. ступеня канд. бюл. наук: спец. 03.00.06 / Н.А. Сенчугова - КНУ iм. Тараса Шевченка. - К., 2003. - 21 с.
3. Бугара И. А. Индуцированный морфогенез и клональное микроразмножение перспективных сортов мяты : автореф. дисс. на соискание науч. степ. канд. биол. наук: 03.00.20 / И.А. Бугара - НБС-ННЦ. - Ялта, 2006. - 21 с.
4. Калинин Ф.Л. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений / Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. - Киев: Наукова думка, 1980. - 488 с.
5. Murashige Т. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture / Т. Murashige, F. Skoog // Physiol. Plant. - 1962. - Vol. 15, No 13. - P. 473-497.
6. Латушюна Т.М. Клональне мжророзмноження i оздоровлення лаванди in vitro : автореф. дис. на здобуття наук. ступеня канд. с-х. наук: спец. 06.01.14 / Т.М. Латушюна - ЮФ КАТУ НАУ. -Омферополь 2006 - 16 с.
7. Мустяце Г.И. Культура мяты перечной / Мустяце Г.И. - Кишинев: Штиинца. - 1985. - 165 с.
Бугара 1.О. Клональне мжророзмноження та оздоровлення Mentha piperita L. in vitro / I.О. Бугара
// Вчеш записки Тавршського нацюнального ушверситету iм. В.1. Вернадського. Серiя „Бюлопя, ^я". - 2013. - Т. 26 (65), № 1. - С. 10-15.
Показана можливють клонального мжророзмноження та оздоровлення м'яти перцево! (Mentha piperita L.) на основi культури iзольованих меристем in vitro. Використання модифкованого живильного середовища МураЫге i Скуга, що мютить 1ОК 0,5 мг/л, кинетин 0,1 мг/л, 6-БАП 1,0 мг/л i рiбавiрiн 5 мг/л дозволяе отримувати та масово розмножувати вшьш вщ вiрусноi' шфекцп рослини-регенеранти. Ключовi слова: Mentha piperita L., клональне мжророзмноження, оздоровлення.
Bugara I.A. Clonal micropropagation and healthy Mentha piperita L. in vitro / I.A. Bugara // Scientific Notes of Taurida V.I. Vernadsky National University. - Series: Biology, chemistry. - 2013. - Vol. 26 (65), No. 1. - P. 10-15.
The possibility of clonal micropropagation and healthy of peppermint (Mentha piperita L.) based on the culture of isolated meristems in vitro was shown. Use of a modified medium Murashige and Skoog supplemented with IAA 0,5 mg/L, kinetin 0,1 mg/L, 6-BAP 1,0 mg/L and ribavirin 5 mg/L can receive the bulk copy free of virus infection regenerated plants. Keywords: Mentha piperita L., clonal micropropagation, healthy.
Поступила в редакцию 21.02.2013 г.
