CC BY
57
Клинико-лабораторная апробаиия новых отечественных рекомбинантных тест-систем для серологической верификаиии моноиитарного эрлихиоза и гранулоиитарного анаплазмоза человека
М.В. Афанасьева*, Э.И. Коренберг**, В.И. Фризен*,
Н.Н. Воробьева***, Т.Е. Манокина*
*Городская клиническая инфекционная больница <1, г. Пермь
**ГУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии
им. Н.Ф. Гамалеи РАМН», Москва
***Кафедра инфекционных болезней
Пермской государственной медицинской академии
Эрлихии (триба Ehrlichia) - облигатные внутриклеточные грамотрицательные риккетсии, которые локализуются в цитоплазматических вакуолях моноцитов, макрофагов и нейтрофи-лов, вызывая острые гриппоподобные лихорадочные заболевания [2, 10]. Для человека патогенны представители рода Ehrlichia (E. chaffensis и E. muris) и Anaplasma (A. phagocytophi-la) [10]. По характеру спектра поражаемых этими микроорганизмами кровяных клеток различают моноцитарный эрлихиоз человека и гранулоцитарный анаплазмоз человека [11].
м оноцитарныи эрлихиоз человека (МЭЧ) впервые описан в 1987 году у пациента из Fort Chaffee (США) [5]. В 1999 году в Пермскои области у таежных клешеи (Ixodes persulcatus) впервые обнаружены моноцитарные эрлихии, а у 4 пациентов верифицирован МЭЧ. Позднее была представлена клинико-лабораторная характеристика МЭЧ в этом регионе [1]. Первый клинический случаи гранулоцитарно-го анаплазмоза человека (ГАЧ) [11], ранее именовавшегося гранулоцитарным эрлихиозом человека (ГЭЧ), диагностировали у лихорадяшего больного из средне-западнои части США в 1994 году. После этого было выявлено несколько случаев данного заболевания в северо-восточнои части США [6]. Первыи случаи ГАЧ в Европе диагностирован у пациента из Словении в 1996 году [5, 6, 10]. Возбудитель -A. phagocytophila, поражаюшая главным образом неитрофилы [6, 10]. В 2002 году впервые представлены доказательства зараженности возбудителями ГАЧ резервуарных хозяев (рыжие полевки) в природных очагах Предуралья [4].
Лиагностика МЭЧ и ГАЧ за рубежом основывается на клинико-лабораторных методах [5, 6, 9]. Лля заболевании характерны лихорадка, гриппоподобный синдром, изменения в гемограмме (леикопения, анемия, тромбоцитопения), повышение активности
трансаминаз в сыворотке крови. При микроскопии мазка крови, окрашенного по Райту, в моноцитах или гранулоцитах можно визуализировать «морулы» - скопления микроорганизмов. При лабораторной верификации заболеваний используют полимеразную цепную реакцию и бактериологический метод -культивирование возбудителя ГАЧ на средах из про-миелоцитарных клеток, взятых у больных лейкемией (Н1_ - 60) [12]. Для выявления иммуноглобулинов М, С к возбудителям МЭЧ и ГАЧ широко применяется нРИФ [5, 7]. Однако результаты нРИФ не всегда специфичны из-за возможных ложноположительных реакций у пациентов с иксодовыми клещевым борриоли-озом, бруцеллезом, лихорадкой Ку, бабезиозом [8, 17] и аутоиммунными заболеваниями [13]. В связи с этим возникла необходимость использовать для серологической диагностики эрлихиозов более специфичные методы.
В последние годы появились публикации о применении иммуноферментного анализа (ИФА) для диагностики ГАЧ [13 - 18], что позволяет исключить субъективную оценку полученных результатов и проводить в автоматическом режиме одновременное тестирование большого числа сывороток крови [16]. Показано, что ИФА с нативным антигеном ГАЧ, полученным путем культивирования анаплазм в Н1_-60-
[Эпидемиология и Вакцинопрофилактика <1(20)/2005
Эпидемиология и Вакцинопрофилактика <1(20)/2005
Таблица 1.
Показатели специфичности (в %) ИФА с реомбинантными тест-системами, полученные при тестировании сывороток разных контрольных групп
Тест-система При выявлении иммуноглобулинов M При выявлении иммуноглобулинов G
группа В группа С группа D общая группа В группа С группа D общая
«ГЭЧ - ИФА»* 100,0 98,0 ± 1,9 99,3 ± 0,7 99,3 ± 0,6 100,0 100,0 100,0 100,0
«МЭЧ - ИФА» 100,0 98,0 ± 2,0 98,6 ± 1,2 99,0 ± 0,6 100,0 90,0 ± 6,4 100,0 96,7 ± 1,0
* Злесь и лалее привелены названия тест-систем, ланные произволителем.
клетках, более чувствителен, чем нРИФ. Недавно для ИФА начали применять рекомбинантный антиген, приготовленный с использованием поверхностного белка 44-kDa (HGE-44) возбудителя ГАЧ [18], что повысило специфичность (до 98 - 100%) и чувствительность данного метода [14].
До последнего времени лечебные учреждения нашей страны не имели возможности диагностировать МЭЧ и ГАЧ из-за отсутствия соответствующих отечественных тест-систем. Недавно в ООО «Ом-никс» (Санкт-Петербург) были созданы диагностические тест-системы, предназначенные для обнаружения иммуноглобулинов классов М и G к возбудителям МЭЧ (E. chaffensis и E. muris) и ГАЧ (A. phagocy-tophila) в ИФА («МЭЧ - ИФА - IgM» и «МЭЧ - ИФА -IgG»; «ГЭЧ - ИФА - IgM» и «ГЭЧ - ИФА - IgG»). В них использована композиция рекомбинантных белков эрлихий, сорбированных на поверхности лунок стрипов. В настоящее время проводится сертификация этих тест-систем.
Цель настоящего исследования состояла в том, чтобы в условиях инфекционной клиники на репрезентативном материале впервые оценить специфичность и чувствительность названных рекомбинантных тест-систем, а также эффективность их применения для практической серологической верификации МЭЧ и ГАЧ в России.
Материалы и методы
Сыворотки крови для лабораторных исследований были получены в эпидемический сезон (с апреля по сентябрь) 2003 года от 302 пациентов с лихорадочными заболеваниями, возникшими после присасывания клещей (группа А). Все больные находились на стационарном лечении в городской клинической инфекционной больнице е1 г. Перми. Их контакты с таежными клещами (Ixodes persulcatus) происходили главным образом в окрестностях города, где в природных очагах циркулируют E. muris и A. phagocy-tophila [4]. Кровь для серологических исследований брали дважды: при поступлении пациентов в стационар и в динамике заболевания, через 10 - 12 дней после первого анализа. В целом на наличие иммуноглобулинов класса М было исследовано 512 сывороток этой группы и 460 - для выявления иммуноглобулинов G; у 2/3 больных сыворотки были исследованы двукратно.
Известно, что клинические проявления МЭЧ и ГАЧ в большей степени сходны. Они включают общеинфекционный синдром, поражение печени с повышением активности трансаминаз в сыворотке крови, изменение в гемограмме с развитием лейкопении и тромбоцитопении [1, 5, 6]. Поэтому для выявления чувствительности тест-систем от 81 пациента с по-
добным симптомокомплексом были исследованы 162 сыворотки крови.
В качестве контроля использовали 3 группы сывороток крови. Одну из них составили 105 сывороток от больных ангиной, рожей, ОРЗ и другими инфекциями, не связанными с присасыванием клеща (группа В). Второй контрольной группой были 50 сывороток от больных сифилисом (группа С). Третья группа (й) включала сыворотки, полученные от 147 клинически здоровых доноров Пермской областной станции переливания крови.
Все сыворотки были исследованы методом ИФА на наличие иммуноглобулинов М и С к Е. тиг1з (Е. еНа1?епз1з) и к А. рНадоеуОрНПа с четырьмя соответствующими отечественными рекомбинантными тест-системами, изготовленными в ООО «Омникс», с соблюдением инструкции производителя. При обработке результатов использовали значения оптической плотности (ОП) с последующим расчетом значений ОПкрит. и коэффициента серопозитивности сыворотки по формулам, приведенным в инструкциях. За положительные принимали ОП более 0,250 (как для ^М, так и для !§С). Показатели специфичности серологических реакций рассчитывали общепринятыми методами (СПстап, 1978).
Результаты и обсуждение
Результаты испытания тест-систем продемонстрировали их высокую специфичность со всеми группами контрольных сывороток (табл. 1). Максимальный из всех полученных показателей специфичности тест-систем «МЭЧ - ИФА - !§С» получен с сыворотками группы В (пациенты с различными заболеваниями инфекционной природы, не связанными с присасыванием клещей), а минимальный (около 90%) при исследовании сывороток крови больных сифилисом (группа С). В этой группе сывороток выявлено 5 неспецифических положительных результатов, причем одна из этих сывороток также дала положительный результат с тест-системой «МЭЧ - ИФА - !§М» и еще одна - с тест-системой «ГЭЧ - ИФА - ^М». Сыворотки 2-х доноров (группа й) дали положительные результаты с тест-системами для обнаружения иммуноглобулинов М к возбудителям МЭЧ (1 сыворотка) и ГАЧ (1 сыворотка). Строго говоря, эти результаты не могут рассматриваться как неспецифические, поскольку нельзя исключить возможность предшествующего контакта этих доноров с клещами, инфицированными эрлихиями. В целом для практических лабораторно-диагностических целей специфичность всех тест-систем оказалась вполне приемлемой.
При исследовании сывороток крови пациентов (группа А) с лихорадочными заболеваниями, возникшими после присасывания клещей, тест-системами
Таблица 2.
Общие результаты тестирования сывороток крови пациентов, заболевших после укуса клеша, в ИФА с тест-системами лля выявления иммуноглобулинов к возбулителям МЭЧ и ГАЧ
Тест-система Исследовано сывороток Из них Достоверность положительных результатов %
положительных сомнительных
абс. % абс. %
«МЭЧ - ИФА - ^М» 512 5 1,0 ± 0,2 5 1,0 ± 0,2 83,3 ± 3,0
«МЭЧ - ИФА - ^С» 460 12 2,6 ± 0,7 12 2,6 ± 0,7 70,6 ± 3,7
«ГЭЧ - ИФА - ^М» 512 84 16,4 ± 1,6 30 5,8 ± 1,0 94,3 ± 1,0
«ГЭЧ - ИФА - ^С» 460 109 23,7 ± 2,0 14 3,0 ± 0,6 100,0
для верификации МЭЧ получено всего 1 7 положительных из 302 результатов (табл. 2), причем в одной сыворотке были обнаружены иммуноглобулины М, а в другой - иммуноглобулины С, одновременно и к возбудителю ГАЧ. Показатель общей достоверности положительных результатов составил при выявлении иммуноглобулинов С примерно 75% максимального значения, а при выявлении иммуноглобулинов М -несколько выше (около 80 - 85%). В том и другом случае процент положительных и сомнительных (когда по инструкции исследование рекомендуется повторить через 2 - 4 недели) результатов был одинаковым. При использовании тест-систем «ГЭЧ - ИФА - !§М» и «ГЭЧ - ИФА - !§С» положительные результаты составили в общей сложности около 1/5 части от числа исследованных сывороток группы А. Их количество было примерно одинаковым с обоими диагностикумами, а достоверность положительных результатов - максимальной при выявлении иммуноглобулинов С и около 95,0% - при определении иммуноглобулинов М.
Из общего числа сывороток группы А 162 получены от пациентов, у которых по клиническим проявлениям можно было подозревать МЭЧ или ГАЧ. При исследовании этих сывороток с тест-системами «МЭЧ -ИФА - ^М» и «МЭЧ - ИФА - !§С» процент достоверно положительных результатов составил 3,1 ± 1,4% и 7,4 ± 2,0% соответственно, а с тест-систем «ГЭЧ - ИФА - ^М» и «ГЭЧ - ИФА - !§С» -более 1/3 числа исследованных сывороток (рис. 1). Однако эти данные в большей степени характеризуют частоту распространения эрлихиоза и анаплазмоза среди лиц, пострадавших от клещей, чем истинную чувствительность тест-систем. Дальнейший анализ результатов испытания нового лабораторного ди-агностикума проведен на репрезентативных данных,
Рисунок 1.
Общие результаты ИФА при выявлении антител к возбулителю ГАЧ в сыворотках крови пациентов, у которых было заполозрено это заболевание
35 —
30 —
25 —
20 —
15 —
10 —
5 0
которые были получены в отношении тест-систем «ГЭЧ - ИФА - ^М» и «ГЭЧ - ИФА - ^С».
Как известно, развитие инфекционного процесса сопровождается появлением сначала иммуноглобулинов М, а затем - иммуноглобулинов С [3]. Рисунок 2 отражает конкретные показатели ОП, полученные при исследовании всех (226) сывороток от 113 пациентов с испытывавшимися тест-системами, а также их значения после квадратичной апроксимиза-ции. Значения, превышающие критический уровень ОП для иммуноглобулинов М к возбудителю ГАЧ, начинают появляться не ранее 11-го дня и достигают максимума на 12 - 17-й день (рис. 2-А) от начала за-
Рисунок 2.
Конкретные показатели ОП (точки), полученные в ИФА при исслеловании сывороток крови пациентов, взятой в разные сроки от начала заболевания, с тест-системами «ГЭЧ - ИФА - ЮМ» (А) и «ГЭЧ - ИФА - ЮС» (В), и их апроксимизированное выражение (графики).
Толстые горизонтальные линии - пороговый уровень, выше которого результат в соответствии с инструкциями произволителя тест-систем слелует считать положительным. По оси орлинат - значения ОП;
По оси абсцисс - лни от начала заболевания
[Эпидемиология и Вакцинопрофилактика 21(20)/2005
Эпидемиология и Вакцинопрофилактика <1(20)/2005
болевания. Далее примерно до 35-го дня от начала заболевания значения показателей ОП, отражающие, как мы полагаем, титры иммуноглобулинов М в крови пациентов, постепенно уменьшаются. Позднее достоверно положительные результаты исследования сывороток с соответствующей тест-системой выявить не удалось.
Значения ОП для антител класса С, превышающие критический уровень (положительные результаты ИФА), появляются уже с первых дней заболевания, но все сыворотки, полученные от пациентов на 10-й и 11-й день от начала заболевания, оказались негативными. Соответствующий «провал» кривой линии, по всей видимости, объясняется очень небольшим числом сывороток, полученных от пациентов в эти дни (рис. 2-В). В более поздние сроки вновь появились положительные результаты, причем апрок-симизированные значения ОП, полученные в ИФА, неуклонно нарастали и достигли максимума в сыворотках крови, которая была взята у пациентов на 37 - 39-й день от начала заболевания. Приведенные данные отражают изменения уровня гуморального иммунитета в остром периоде инфекционного процесса при ГАЧ и позволяют сделать заключение об оптимальных сроках серологического исследования пациентов для лабораторной верификации этого заболевания испытанными тест-системами. Первую сыворотку желательно получить как можно раньше после начала заболевания, а вторую - через 2-3 недели для выявления четкой положительной серокон-версии по иммуноглобулинам М и через 4-5 недель -по иммуноглобулинам С. Если тестирование первой сыворотки с тест-системой «ГЭЧ - ИФА - !§С» дает отрицательный результат, повторное исследование пациента для серологического подтверждения грану-лоцитарного анаплазмоза может быть проведено одновременно с повторным тестированием на наличие антител к МЭЧ, т.е. через 2-3 недели от начала заболевания.
Итак, представленные нами данные показывают, что специфичность ИФА с новыми рекомбинантными тест-системами ООО «Омникс» для обнаружения иммуноглобулинов М и С к возбудителям МЭЧ и ГАЧ высока и приближается к максимальным значениям.
Однако при исследовании парных сывороток у 48 пациентов из 81 (около 60%) с анаплазмозно-эр-лихиозным симптомокомплексом была выявлена положительная сероконверсия. Принимая во внимание, что повторные сыворотки в большинстве случаев получены через 10 - 12 дней от начала заболевания, т.е. не в оптимальные для тестирования сроки (см. выше), которые в момент проведения работы еще не были установлены, можно предположить, что испытанные тест-системы имеют и высокие показатели чувствительности.
Впервые проведенный нами на репрезентативном клиническом материале анализ эффективности новых отечественных рекомбинантных тест-систем «ГЭЧ - ИФА - ^М» и «ГЭЧ - ИФА - ^С», а также «МЭЧ - ИФА - ^М» и «МЭЧ - ИФА - !§С» (производства ООО «Омникс», Санкт-Петербург) свидетельствует о том, что эти наборы могут быть рекомендованы для практического использования клиническими и диагностическими лабораториями с целью серологической верификации гранулоцитарного анаплазмоза и моноцитарного эрлихиоза человека.
Литература
1. Григорян Е.В. Первые данные о клиническом течении моноцитарного эрлихиоза человека/ Е.В. Григорян, Э.И. Ко-ренберг, Н.Н. Воробьева и др.//Эпидемиология и инфекционные болезни. 2000. <6. С. 20 - 25.
2. Коренберг Э.И. Эрлихиозы - новая для России проблема инфекционной патологии//Мед. паразитология и паразит. болезни. 1999. <4. С. 10 - 16.
3. Петров Р.В. Иммунология и иммуногенетика. - М.: Медицина. 1976. С. 48 - 53.
4. Telford III S.R. Выявление в России природных очагов бабе-зиоза и гранулоцитарного эрлихиоза/ S.R. Telford III, Коренберг Э.И., Goethert и др.// Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2002. <6. С. 21 - 25.
5. Aguero-Rosenfeld M.E. Laboratory aspects of tick-borne diseases: Lyme, Human granulosytic ehrlichiosis and
Babesiosis//The Mount Sinai Journal of Medicine. 2003. <3. P. 197 - 206.
6. Bakken J.S. Human Granulosytic Ehrlichiosis/ J.S. Bakken, J.S. Dumler// Clinical Infectious Diseases. 2000. 31. P. 554 - 560.
7. Chen S. Identification of the antigenic constituents of Ehrlichia chaffensis/ S. Chen, J.S. Dumler, Walker D. H.// Am. J. Med. Hyg. 1994. V. 50. P. 52 - 58.
8. Dawson J. E. Serologic diagnosis of human ehrlichiosis using two Ehrlichia canis isolates/ J.E.Dawson, Y. Rikihisa, S.A. Ewing and D.B. Fishbein// J. Infect. Dis. 1991. V. 163. P. 564 - 567.
9. Dawson J. E. The Interface between research and the diagnosis of an emerging tick-borne disease, human ehrlichiosis due to Ehrlichia chaffensis/ J.E. Dawson, C.K. Warner, J.G. Olson// Arch. Intern. Med. 1996. Jan. V. 156. P. 137 - 142.
10. Dumler J.S. Tick-borne ehrlichioses/ J.S. Dumler, D.H. Walker// Lancet Infectious Diseases. 2001. April. P. 21 - 28.
11. Dumler, J.S. Molecular diagnosis of human granulosytic anaplasmosis/J.S. Dumler, P. Brouqui// Emerging molecular diagnosis. 2004. <4 (1). P. 559 - 569.
12. Fishbein, D.B. Human ehrlichiosis: prospective active surveillance in febrile hospitalized patients/ D. B. Fishbein J.E. Dawson, Fields D. H.// Infect. Dis. 1989. V. 160. P. 803 - 809.
13. Magnarelli L.A. Coexistence of antibodies to tick-borne pathogens of babesiosis, ehrlichiosis and Lyme borreliosis in human sera/ L.A. Magnarelli, J.S. Dumler J.F. Anderson et al.// J. Clin. Microbiol. 1995. V. 33. P. 3054 - 3057.
14. Magnarelli L Ijdo J, Wu C, Fikrig E. Recombinant protein-44-based class-specific enzyme-linked immunosorbent assays for serologic diagnosis of human granulocytic ehrlichiosis/ L. Magnarelli, Ijdo J., Wu C., Fikrig E.// Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2001. <7. P. 482 - 485.
15. Ravyn M.D. Immunodiagnosis of human granulosytic ehrlichiosis by using culture-derived human isolates/ M.D. Ravyn, J.L. Goodman, C.B.Kodner//J. Clin. Microbiol. 1998. V. 36. P. 1480 - 1488.
16. Tajima T. Comparison of Two Recombinant Major Outer Membrane Proteins of the Human Granulocytic Ehrlichiosis Agent for Use in an Enzyme-Linked Immunosorbent Assay/ T. Tajima, N. Zhi, Q. Lin, Y. Rikihisa, H. W. Horowitz et al. // Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 2000. V. 7. No. 4. P. 652 - 657.
17. Wormser G.P. False-positive Lyme disease serology in human granulocytic ehrlichiosis/ G.P. Wormser, H.W. Horowitz, J.S. Dumler et al.// Lancet. 1996. V. 347. P. 981 - 982.
18. Zhi N. Cloning and expression of the 44-kilodalton major outer membrane protein gene of the human granulocytic ehrlichiosis agent and application of the recombinant protein to serodiagnosis / N. Zhi, N. Ohashi, Y. Rikihisa et al.//J. Clin. Microbiol. 1998. V. 36. P. 1666 - 1673.
