CC BY
49
УДК 616.833-001-08
А.А. БОГОВ1, А.Р. ГАЛЛЯМОВ1"3, И.Г. ХАННАНОВА1, Г.А. МАСГУТОВА2, И.Ф. АХТЯМОВ13, А.П. КИЯСОВ2
1Республиканская клиническая больница МЗ РТ, 420064, г. Казань, Оренбургский тракт, д. 138 2Казанский (Приволжский) федеральный университет, 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, д. 18 3Казанский государственный медицинский университет, 420012, г. Казань, ул. Бутлерова, д. 49
Клинико-экспериментальное обоснование применения клеток стромально-васкулярной фракции при травме периферических нервов
Богов Андрей Алексеевич - доктор медицинских наук, профессор, заведующий отделением травматологии №2, тел. (843) 237-34-25, e-mail: bogov_a@mail.ru
Галлямов Алмаз Рафаэлевич - травматолог-ортопед отделения травматологии №2, аспирант кафедры травматологии, ортопедии и хирургии экстремальных ситуаций, тел. (843) 237-34-25, e-mail: almaz.gallyamov@gmail.com
Ханнанова Илюса Гаделевна - кандидат медицинских наук, травматолог-ортопед отделения травматологии №2, тел. (843) 237-34-25, e-mail: hannanovaig@gmail.com
Масгутова Галина Андреевна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, тел. (843) 237-34-25, e-mail: galina2526@gmail.com Ахтямов Ильдар Фуатович - доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой травматологии, ортопедии и хирургии экстремальных ситуаций, главный научный сотрудник, тел. (843) 221-36-68, e-mail: yalta60@mail.ru
Киясов Андрей Павлович - профессор, доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник, тел. (843) 236-78-92, e-mail: APKiyasov@kpfu.ru
В обзорной статье представлены основные принципы лечения патологии периферических нервов и эффекты аутокле-ток стромальной васкулярной фракции на нервные ткани. Даны результаты проведенных экспериментальных исследований по этой проблеме. Обобщены результаты лечения заболеваний периферических нервов с использованием аутоклеток стромальной васкулярной фракции.
Ключевые слова: повреждение периферических нервов, стволовые клетки стромальной васкулярной фракции.
A.A. BOGOV1, A.R. GALLYAMOV1-3, I.G. KHANNANOVA1, G.A. MASGUTOVA2, I.F. AKHTYAMOV13, A.P. KIYASOV2
1Republican Clinical Hospital of the MH of RT, 138 Orenburgskiy Trakt, Kazan, Russian Federation, 420064 2Kazan Volga region Federal University, 18 Kremlevskaya Str., Kazan, Russian Federation, 420008 3Kazan State Medical University, 49 Butlerov Str., Kazan, Russian Federation, 420012
Clinical and experimental study of the use of cells of the stromal vascular fraction in peripheral nerve injury treatment
52 практическая медицина
' № 4(96) август 2016 г. / том 1
Bogov A.A. - D. Med. Sc., Professor, Head of the Traumatology Department №2, tel. (843) 237-34-25, e-mail: bogov_a@mail.ru
Gallyamov A.R. - traumatologist-orthopeadist of the Traumatology Department №2, postgraduate student of the Department of Traumatology,
Orthopeadics and Emergency Surgery, tel. (843) 237-34-25, e-mail: almaz.gallyamov@gmail.com
Khannanova I.G. - Cand. Med. Sc., traumatologist-orthopeadist of the Traumatology Department №2, tel. (843) 237-34-25,
e-mail: hannanovaig@gmail.com
Masgutova GA - Cand. Biol. Sc., Senior Researcher, tel. (843) 237-34-25, e-mail: galina2526@gmail.com
Akhtyamov I.F. - D. Med. Sc., Professor, Head of the Head of the Department of Traumatology, Orthopeadics and Emergency Surgery,
Chief Researcher, tel. (843) 221-36-68, e-mail: yalta60@mail.ru
Kiyasov A.P. - D. Med. Sc., Professor, Leading Researcher, tel. (843) 236-78-92, e-mail: APKiyasov@kpfu.ru
The review presents the basic principles of surgical treatments of peripheral nerve injuries and the effects of auto-cells of the stromal vascular fraction on nerve tissue. The carried out experiments on the issue are described. The results of treatment with auto-cells of the stromal vascular fraction are summarized.
Key words: peripheral nerve injury, stem cells of the stromal vascular fraction.
Повреждения периферических нервов является актуальной проблемой, поскольку приводят к ин-валидизации пациентов в 60-63% и остаются одной из сложно излечимых травм [1-5]. Использование оптики и микрохирургической техники позволило значительно улучшить результаты лечения повреждений периферических нервов. Стандартом хирургического лечения периферических нервов является прямой шов. При невозможности сшить проксимальный и дистальный концы поврежденного нерва показана свободная аутонервная пластика. Однако минусом неваскуляризированной аутонервной пластики при наличии дефекта более 6 см является возможный некроз аутонервной вставки, в связи с его недостаточным кровоснабжением. Поиск методов, улучшающих регенерацию периферических нервов, актуален и на сегодняшний день.
В экспериментально-исследовательских работах отечественных и зарубежных авторов показана эффективность использования клеток Стромально Васкуляр-ной Фракции (СВФ): улучшение регенерации тканей головного мозга, положительная динамика при лечении рассеянного склероза, ишемии конечностей, регенерации мышц и периферических нервов. Wang D и соавт. отмечают: применение клеток сВф увеличивает скорость проведения импульса и количество двигательных единиц, ускоряет рост и миелинизацию аксонов в сравнении с группой без их применения [6-11].
Отмечено положительное действие клеток СВФ на выживаемость мотонейронов в спинном мозге при спинно-мозговой травме L4, L5, L6 позвонков. Возможный эффект применения клеток СВФ на молекулярном уровне может быть связан с увеличением ферментативной активности антиапоптотических и уменьшением активности проапоптических ферментов, а также увеличение продукции нейропро-текторных и нейрорегенераторных факторов (ин-сулиноподобный ростовый фактор-1, BDNF, BFGF, GDNF) [12-14]. Также клетки СВФ используются при коррекции нарушений консолидации костей, для восстановления хрящевой ткани при артрозах суставов, восполнения дефектов мягких тканей организма [15-17].
Для обоснования применения клеток СВФ для лечения травм периферических нервов нами проведены экспериментальные исследования с целью изучения влияния клеток СВФ на регенерацию нерва.
Экспериментальное исследование проводилось на 29 беспородных крысах (самцы, вес 200-250 гр). Животным в левом седалищном нерве формировался дефект, на месте которого сразу же производилась аутонервная пластика. В первой группе в проксимальный и дистальный концы, в ауто-нервную вставку шприцом Гамильтона вводили 1 млн СКЖТ растворенных в физиологическом растворе. Во второй группе вводился физиологический раствор того же объема. Третья группа была интактная (рис. 1). Во всех группах седалищный нерв после аутонервной пластики покрывали слоем фибринового клея Тиссукол Кит для предотвращения растекания введенного раствора в нервы (Baxter, Австрия). Рану ушивали послойно.
Рисунок 1.
Этапы эксперимента на крысе
1) I 3) I-F-Г
Седалищный нерв крысы
2) I II HI I 4)
(легальный аутонервная проксимальный юнец нерва вставка 5мм конец нерва
В ходе эксперимента, на сроках 7, 14, 28, 42, 63 сутки после операции у всех подопытных животных производили регистрацию электрических М-ответов мышц. Отмечено, что на ранних сроках
дистальный аутонервная проксимальный конец нерва вставка 5мм конец нерва
Ii I
дистальный аутонервная проксимальный конец нерва вставка Бмм конец нерва
порог возникновения М-ответа резко увеличивается в обеих экспериментальных группах по сравнению с интактными животными. Что касается регенерации поврежденного нерва по истечении 63 суток порог возникновения М-ответа у группы крыс с введением клеток, приближается к значениям нормы. У контрольной группы на этом же сроке порог М-ответа превышает значение нормы практически в 2 раза (рис. 2).
Рисунок 2.
Порог М-ответа
Примечание: По оси ординат — значения порога возникновения М-ответа в вольтах (В). По оси абсцисс — сутки после оперативного вмешательства. Белые столбики — контрольная группа (аутонерв-ная вставка), серые столбики — опытная группа (аутонервная вставка + СКЖТ), черные столбики — интактные животные. * — достоверное различие (Р<0,05) между группами (аутонервная вставка) и (аутонервная вставка + СКЖТ) [17]
На 65 сутки после операции в обеих группах выделяли спинальный ганглий L5 на стороне операции для подсчета количества нейронов с видимыми ядрышками (рис. 3).
Рисунок 3.
Продольный срез спинального ганглия L5. Окраска Метиленовый синий
Подсчет общего количества нейронов спинального ганглия L5 через 65 суток после аутонерв-ной вставки показал, что в опытной группе (аутонервная вставка + СКЖТ) количество выживших нейронов уменьшается на 63,65% по сравнению с группой интактных животных. Данный показатель в контрольной группе уменьшается на 89% (рис. 4).
Рисунок 4.
Итоговое количество выживших нейронов спинального ганглия L5 через 65 суток после операции
1200 т
Примечание: По оси ординат — количество нейронов. Светлый столбик — контрольная группа (аутонервная вставка), темный столбик — опытная группа (аутонервная вставка + СКЖТ), черный столбик — количество нейронов у интактных животных [17]
Микроскопический анализ (иммунофлуорисцент-ный метод) поперечных и продольных срезов седалищного нерва показывает наличие большого количества мелких и средних внутриствольных невром в зоне аутонервной вставки, на границе швов. В случайно выбранных областях продольных срезов седалищного нерва была произведена оценка тканей на наличие невром. Было отмечено, что в группе с клеточной стимуляцией, продольные волокна расположены более прямолинейно, в области шва рубцовый процесс был выражен в меньшей степени. Также отмечено, что количество невром в экспериментальной группе значительно ниже, чем в контрольной группе.
Таким образом, в эксперименте показано, что применение клеток СВФ: приближает порог М-ответа к показателям интактных животных, повышает выживаемость клеток в спинальных ганглиях, уменьшает количество внутриствольных невром, что в сумме способствует регенерации.
Данные эксперимента показали: увеличение выживаемости чувствительных нейронов — на 44,8%, стимуляцию пролиферации шванновских клеток, уменьшение эффекта воллеровской дегенерации — на 48%, активацию имунной системы, уменьшая область рубцовой ткани — на 51%, стимуляцию роста аксонов и их миелинизацию.
В отделении Микрохирургии кисти РКБ МЗ РТ клетки стромально-васкулярной фракции были применены при лечении повреждений периферических нервов верхней и нижней конечностей у 58 больных. Выполнялись 3 вида операций — невролиз, шов, аутонервная пластика. Во всех случаях клетки СВФ вводили в область поврежденного нерва в количестве 6-8 млн. Предварительные результаты лечения показали значительное ускорение сроков регенерации и улучшении функциональных результатов.
У большинства пациентов была получена болевая чувствительность на ранних сроках после операции, а именно на сроке от 4 до 15 дней, которая в дальнейшем не исчезала и продолжала нарастать. Что касается двигательной сферы, то средние сроки восстановления превышали на 30% по сравнению с
5а практическая медицина
' № 4(96) август 2016 г. / том 1
классическими вариантами регенерации периферического нерва.
На наш взгляд, наибольший эффект от использования клеток СВФ наблюдается при ауто-нервной пластике. Общеизвестно, что при длине вставки более 5-7 см процент выживаемости ау-тонервного трансплантанта минимален. Данная методика позволяет создать условия для рева-скуляризации аутонервного трансплантанта, по-
ЛИТЕРАТУРА
1. Берснев В.П. и др. Оценка результатов хирургического лечения повреждений седалищного нерва // Травматология и ортопедия России. - 2009. - №1. - С. 96-98.
2. Munro C.A., Prasad V.S., Midha R. Analysis of upper and lower extremity peripheral nerve injuries in a population of patients with multiple injuries // Am. J. Phys. Med. Rehabil. J. Trauma. — 1998 Jul. — 45 (1) — P. 116-22.
3. McAllister R., Gilbert S., Calder J., Smith P. The epidemiology and management of upper limbperipheral nerve injuries in modern practice // J. Hand Surg. [Br]. — 1996. — 21 (1). — P. 4-13.
4. Taylor C.A., Braza D., Rice J.B., Dillingham T. The incidence of peripheral nerve injury in extremity trauma // Am. J. Phys. Med. Rehabil. — 2008 May. — 87 (5). — P. 381-5.
5. Scott W. Wolfe, William C. Pederson, Robert N. Hotchkiss, Scott H. Kozin Green's Operative Hand Surgery: 2-Volume Set, 6e (Operative Hand Surgery (Green's)). — 6th Edition. — 2011
6. Гринь В.К. и др. Применение аутологичных мезенхимальных стволовых клеток в кардиологии и травматологии // Журн. HAMH Украши. — 2011. — Т. 17, №1. - С. 67-75.
7. Sandra A. Acosta, Naoki Tajiri, Kazutaka Shinozuka et al. Combination Therapy of Human Umbilical Cord Blood Cells and Granulocyte Colony Stimulating Factor Reduces Histopathological and Motor Impairments in an Experimental Model of Chronic Traumatic Brain Injury. — doi: 10.1371/journal.pone.0090953. Published: March 12, 2014
8. Lu Chen, Ronald Coleman, Ronika Leang et al. Human Neural Precursor Cells Promote Neurologic Recovery in a Viral Model of Multiple Sclerosis // Stem Cell Research & Therapy. — 2014. Published online 2014 May 15. doi: 10.1016/j.stemcr.2014.04.005
9. Katare R., Stroemer P., Hicks C., et al. Clinical-grade human neural stem cells promote reparative neovascularization in mouse models of hindlimb ischemia // Arterioscler Thromb. Vasc. Biol. — 2014 Feb. — 34 (2). — P. 408-18. doi: 10.1161/ATVBAHA.113.302592. Epub 2013 Nov 7.
высить его выживаемость и улучшить результаты лечения на 30 и более % по сравнению с классическими хирургическими методами восстановления периферических нервов. Применение клеток СВФ имеет значительные перспективы при лечении повреждений периферических нервов, так как способствует увеличению скорости регенерации и выживаемости наибольшего количества нейронов.
10. Yang D.Y., Sheu M.L., Su H.L. et al. // J. Neurosurg. — 2012 Jun. — 116 (6). — P. 1357-67. doi: 10.3171/2012.2.JNS111360. Epub 2012 Apr 13.
11. Wang D., Liu X.L., Zhu J.K. et al. Bridging small-gap peripheral nerve defects using acellular nerve allograft implanted with autologous bone marrow stromal cells in primates // Brain Res. — 2008 Jan 10. — 1188. — P. 44-53. Epub 2007 Oct 18
12. Spejo A.B., Carvalho J.L., Goes A.M., Oliveira A.L. Neuroprotective effects of mesenchymal stem cells on spinal motoneurons following ventral root axotomy: synapse stability and axonal regeneration // Neuroscience. — 2013 Oct 10. — 250. — P. 715-32. doi: 10.1016/j. neuroscience.2013.07.043. Epub 2013 Jul 27.
13. Reid A.J., Sun M., Wiberg M. et al. Nerve repair with adipose-derived stem cells protects dorsal root ganglia neurons from apoptosis // Neuroscience. — 2011 Dec 29. — 199. — P. 515-22. doi: 10.1016/ j.neuroscience.2011.09.064. Epub 2011 Oct 6
14. Marconi S., Castiglione G., Turano E. et al. Human adipose-derived mesenchymal stem cells systemically injected promote peripheral nerve regeneration in the mouse model of sciatic crush. Tissue Eng Part A. — 2012 Jun. — 18 (11-12). — P. 1264-72. doi: 10.1089/ ten.TEA.2011.0491. Epub 2012 Apr 3.
15. Wakitani S., Imoto K., Yamamoto T. et al. Human autologous culture expanded bone marrow mesenchymal cell transplantation for repair of cartilage defects in osteoarthritic knees // Osteoarthritis Cartilage. — 2002 Mar. — 10 (3). — P. 199-206.
16. Масгутов Р.Ф., Богов А.А. (мл.), Ризванов А.А. и др. Стволовые клетки из жировой ткани. Биологические свойства и перспективы клинического применения // Практическая медицина. — 2011. — №55.
17. Масгутов Р.Ф., Масгутова Г.А., Салафутдинов И.И. и др. Стимуляция посттравматической регенерации седалищного нерва крысы при ксенотрансплантации мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани // Р.Ф. Гены&Клетки. — 2015. — Т. X, №1.
