CC BY
15
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
© Коллектив авторов, 2006
M.O. Логачев1, В.Д. Папонов2, Н.В. Упадышева1, И.П. Бражникова1, С.В. Дербитова1, Н.А. Суркова1, И.Э. Волков3, Е.Е. Петряйкина4, Т.Д. Михайлова4
КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ УРОВНЯ БЕЛКОВ P53 И P43 ПРИ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ 1-ГО ТИПА У ДЕТЕЙ И ПОДРОСТКОВ
1 Кафедра эндокринологии педиатрического факультета с курсом детской эндокринологии ФУВ ГОУ ВПО «Российский Государственный Медицинский Университет Росздрава РФ», 2 ГУ Медико-генетический Научный Центр РАМН, 3 Отделение эндокринологии и диабетологии ГУ Российская детская клиническая больница, 4 Отделение эндокринологии ГУ Морозовская детская городская клиническая больница, Москва
Проведено определение уровня белковых параметров лейкоцитов p53 и p43 у 67 детей и подростков с сахарным диабетом (СД) 1-го типа в возрасте от 3 до 17 лет и стажем заболевания от нескольких месяцев до 12 лет. Все пациенты были разделены на группы в зависимости от стажа заболевания, наличия или отсутствия осложнений, суточной потребности в инсулине и уровня HbAlc. Выявлено повышение уровня p53 с увеличением стажа заболевания при осложненном течении СД, у больных с большей потребностью в инсулине и у детей с низким уровнем HbAlc. Во всех группах уровень p43 оставался в пределах нормы.
Level of leukocytic protein parameters p53 and p43 was determined in 67 children and adolescents aged 3—17 years old with diabetes mellitus type 1 (duration of disease from few mounths to 12 years). All the patients were divided into different groups in dependence on duration of disease; on presence or absence of complications, on daily requirement for insulin; on HbAlc level. The study showed correlation of increased p53 level and duration of disease; its level was increased in patients with complicated diabetes, with high requirement for insulin and in patients with high HbAlc level. Level of p43 was normal in all groups of patients.
В практике современной клинической медицины господствующее положение удерживает нозологический анализ патологии, причем не только в диагностике болезней, что естественно, но и при выборе тактики ведения больных. В то же время развиваются общепатологические подходы к познанию различных болезней, которые в последние годы увенчались открытием высокочувствительных маркеров общей патологии [1, 2]. При этом, учитывая динамический характер патологических признаков (в частности, их исчезновение при адекватном лечении), при анализе патологии следует сконцентрироваться на динамике генетического аппарата человека, в котором первичная структура ДНК является наиболее консервативным элементом [3, 4].
В настоящее время в лейкоцитах крови человека удалось обнаружить две группы белков, которые становятся аномально высокими при болезнях различной этиологии [5, 6]. Эти белки получили название маркеров общей патологии, поскольку на их основе можно установить признаки, объединяющие различные современные нозологии. Белковые параметры лейкоцитов 53К/Н2А и 43 К/Н2А (где 53К и 43К - белки с различными изоточками
и массами 53 и 43 кД, Н2А - гистоновый белок лейкоцитов) обнаружили чувствительность в 100% случаев при различных болезнях [7]. К ним относятся болезни, связанные с мутацией конкретного гена (нейрофиброматоз 1-го типа, фенил-кетонурия); врожденные хромосомные болезни, связанные с анеуплоидией; мультифакториаль-ные болезни с наследственной предрасположенностью (псориаз, язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки, сахарный диабет 1-го типа); болезни с врожденными и приобретенными дефектами иммунитета (гипогаммаглобулинемия, бронхиальная астма); онкологические болезни; инфекционные болезни вирусного и бактериального происхождения (гепатиты, герпес, папиллома, туберкулез); болезни различных органов и систем [1].
Ген р53 получил образное имя «страж генома», ибо он координирует все основные процессы поддержания стабильности генома многоклеточного организма. Реакции р53-зависимых механизмов избирательны и адекватны ситуации. Следует отметить несколько наиболее известных функций р53. Он способен оказывать комплексное воздействие на транскрипцию генов, активируя
экспрессию одних и репрессию других, а также непосредственно связываться с участками одноце-почечной ДНК, участками неспаренных оснований и однонитевых разрывов [8-10], что наводит на мысль о его непосредственном участии в репарационных процессах поврежденных участков ДНК. Таким образом, можно выделить три основные функции, которые р53 выполняет в организме: первая - роль «стража генома», устранение потенциально опасных клеток; вторая - контроль клеточной кооперации, что связано с процессами тканевого старения, реакцией на стресс и взаимодействием между нормальной и опухолевой тканями; третья - участие в дифференцировке и морфогенезе.
Белок с молекулярной массой 43 кД входит в состав сократительных структур любой клетки, в том числе в состав мембран лейкоцитов крови. При различных патологических состояниях изменяется состояние мембран клеток, что сопровождается снижением уровня р43. Одновременное определение количества р53 и р43 дает возможность дифференцировать истинное и «ложное» (за счет дефекта мембран) малое содержание р53 [2, 11].
Сахарный диабет (СД) является одной из наиболее частых групп хронических болезней не только у взрослых, но и у детей и подростков. В детском и подростковом периоде СД типа 1 (СД1) наиболее часто связан с генетически обусловленной предрасположенностью, присутствием аутоиммунной деструкции р-клеток, тяжелым дефицитом инсулина и жизненной необходимостью инсу-линотерапии. Исследования последних лет в области клинической и экспериментальной диабето-логии изменили представления о патогенезе СД и его поздних осложнений, что нашло отражение в классификации и диагностических критериях этой группы болезней, рекомендованных Комитетом экспертов ВОЗ. В последние годы отмечается рост заболеваемости СД1 у детей и подростков во всем мире.В связи с этим, представлялось интересным проанализировать возможность ассоциации СД1 у детей и подростков с лейкоцитарными белками массой 53 кД, а также 43кД, так как имеются данные о значительных структурно-функциональных изменениях в клеточных мембранах Р-клеток при аутоиммунном процессе в поджелудочной железе. Литературных данных о проведе-
нии подобных исследований в детском и подростковом возрасте нами обнаружено не было [12, 13].
Материалы и методы обследования
Обследовано 65 детей (36 мальчиков и 29 девочек) в возрасте от 3 до 17 лет с диагнозом СД1, с длительностью болезни от нескольких дней до 12 лет, находившихся на лечении в отделении ди-абетологии РДКБ и отделении эндокринологии МДКБ г. Москва.
Определение уровня белков р53 и р43 проводили в лаборатории физико-химических исследований хроматина человека ГУ МГНЦ РАМН с помощью одномерного электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия по методу Laemmli. Представленность семейств белков с массами 53 и 43 кД определяли по отношению к гистону Н2А, так как присутствие его в клетках строго детерминировано количеством ДНК в геноме (В.Д. Папонов, 1965), по амплитудам соответствующих участков денситограммы, полученной после окраски белков кумасси-250, на спектрофотометре «Gilford» при ^=570 нм.
При оценке взаимосвязи между полученными кли-нико-лабораторными данными и уровнями белковых продуктов генов лейкоцитов крови были использованы нормативные показатели содержания белков, представленные в предыдущих работах [14].
В соответствии с полученными результатами все обследованные были отнесены к одной из групп: группа нормы - 53К/Н2А<0,25 ед и 43К/Н2А>1,61 ед; группа риска -0,25<53К/Н2А<0,35 ед и 1,01<43К/Н2А<1,61 ед; группа особого риска - 53К/Н2А>0,35 ед и 43К/Н2А<1,01 ед.
Результаты и их обсуждение
По уровню белка р53 (рис. 1) в группу риска вошли 23 пациента (35,4%), в группу высокого риска - 42 (64,6%), по уровню белка р43 (рис. 2) в группу нормы отнесены 59 (90,8%), в группу риска - 6 пациентов (9,2%). Отмечено незначительное превышение уровня р53 в группе девочек (0,44 ±0,1 ед) по сравнению с группой мальчиков (0,37 ±0,09 ед) (см. таблицу).
По длительности болезни все пациенты были разделены на 4 группы: 1-я группа - длительность менее 1 года (17 человек - 25,5%); 2-я группа - от 1 года до 2 лет (11 человек - 17%); 3-я группа - от
2-9,2%
____1-90,8%
Рис. 1. Распределение наблюдаемых больных в зависимости от уровня белков р53 (а) и р43 (б). На рис. 1а: 1- группа риска, 2 - группа высокого риска; на рис. 1б: 1 - норма, 2 - группа риска.
М.Ф. Логачев, В.Д. Папонов, Н.В. Упадышева, И.П. Бражникова и др.
17
Таблица
Средние значения р53 и р43 в исследуемых группах больных
Группы больных р53, ед р43, ед
Стаж заболевания
До 1 года 0,34±0,1 2,45±0,9
1-2 года 0,38±0,09 2,58±1,03
2-5 лет 0,43±0,09 2,78±0,76
Более 6 лет 0,43±0,08 2,57±0,7
Пол пациентов
Девочки 0,44±0,1 2,9±0,9
Мальчики 0,37±0,09 2,5±0,7
Течение заболевания
С осложнениями 0,39±0,1 2,6±0,9
Без осложнений 0,43±0,08 2,7±0,6
Суточная потребность в инсулине
Менее 0,5 Ед/кг/сут 0,37±0,04 2,06±0,6
0,5-1 Ед/кг/сут 0,42±0,1 2,69±0,6
Более 1 Ед/кг/сут 0,4±0,1 2,52±0,1
Уровень НЬА1с
Менее 6,5% 0,42±0,1 2,75±1,2
6,5-7,5% 0,37±0,07 2,6±0,5
Более 7,5% 0,43±0,1 2,52±0,63
<1 1 1-2 1 2-5 1 >6 Стаж заболевания, годы
0,5 ч0,45 ф 0,4 05 0,35 о. 0,3
и О.25 Я 0-2
о 0,15 I ^ £ 0,1
0,05
Рис. 2. Уровень белка р53 у больных с различным
стажем заболевания.
Здесь и на рис. 3 и 4: — норма.
2 до 5 лет (21 человек - 32%); 4-я группа - 6 лет и более (17 человек - 25,5%). Как видно из таблицы, средний уровень р53К в 1-й группе составлял 0,34±0,1 ед, во 2-й группе - 0,38±0,09 ед, в 3-й группе - 0,43±0,09 ед, в 4-й группе - 0,43±0,08 ед, что указывает на повышение уровня р53 с увеличением длительности болезни (рис. 2), при этом уровень р43 оставался без изменений (см. таблицу).
В зависимости от течения заболевания все пациенты были поделены на 2 группы: группа А - без ос-
Рис. 3. Уровень белка р53 у больных СД1 с наличием и отсутствием осложнений.
1 - без осложнений, 2 - с осложнениями.
ложнений (45 человек - 69,2%), группа Б - с осложнениями (20 человек - 30,8%). Средний уровень р53 в группе А составил 0,39±0,1 ед, в группе Б -0,43±0,08 ед. Средний уровень р43 соответствовал норме в обеих группах (см. таблицу). Таким образом, выявлен более высокий уровень р53 в группе детей с осложненным течением заболевания (рис. 3).
В зависимости от суточной потребности в инсулине все пациенты разделены на 3 группы: группа А - менее 0,5 Ед/кг/сут (6 человек -
8,5%); группа Б - 0,5-1 Ед/кг/сут (46 человек -70,2%); группа В - более 1 Ед/кг/сут (14 человек - 21,3%). Средний уровень р53К в группе а составил 0,37±0,04 ед, в группе б - 0,42±0,1 ед, в группе в - 0,4±0,1 ед (рис. 4). Средний уровень р43 соответствовал норме во всех группах (см. таблицу). В группе детей с большей потребностью в инсулине отмечены более высокие показатели р53.
В зависимости от уровня гликозилированного гемоглобина (НЬА1с) выделено 3 группы пациентов: группа А - менее 6,5% (12 человек - 17,8%); группа В - 6,5-7,5% (12 человек - 17,8%); группа С - более 7,5% (42 человека - 64,4%). Средний уровень р53К в группе А составил 0,42±0,1 ед, в группе В -0,37±0,07 ед, в группе С - 0,43±0,1 ед. Средний уровень р43 соответствовал норме во всех группах (см. таблицу). Обратная зависимость р53 от НЬА1с, возможно, связана со скрытыми, чаще ночными гипогликемиями, не выявляющимися обычным определением гликемии по стандартной схеме.
Выводы
1. Выявлен повышенный уровень 53К почти у всех пациентов с СД1 (98,5%) и, таким образом, белок р53 может использоваться в качестве общепатологического маркера заболевания.
0,45 0,4
цд
V 0,35
05 0,3
ю
а 0,25 Й 0,2 8 0,15 а 0.1 >■ 0,05
<0,5 | 0,5-1 | >1 Потребность в инсулине, Ед/кг/сут
Рис. 4. Уровень белка р53 у больных СД1 с различной потребностью в инсулине.
2. С увеличением длительности заболевания отмечается достоверное повышение р53 (1=2,7; р<0,05), при этом уровень 43К находится в пределах нормы (98,5%) и его показатели существенно не изменяются.
3. При осложненном течении заболевания отмечается более высокий уровень р53, что может использоваться для определения вероятности развития осложнений и их ранней диагностики.
4. Высокий уровень р53 при низком уровне НЬА1с может быть маркером скрытой гипогликемии.
ЛИТЕРАТУРА
1. Борисова А.М., Папонов В.Д. // Физиология и патология иммунной системы. - 2004. - Т. 6, №1. -С. 5-8.
2. Папонов В.Д., Папонов В.В., Байдакова Г.В. // Бюлл. эксп. биол. и мед. - 2002. - Т. 133, №3. -С. 262-264.
3. Папонов В.Д. // Успехи современной биологии. - 1987. - Т. 103, №3. - С. 354-370.
4. Папонов В.Д., Симонова А.В., Байдакова Г.В. и др. // Иммунология. - 1996. - №2. - С. 48-50.
5. Папонов В.Д., Папонов В.В., Байдакова Г.В. и др. // Тер. архив. - 2002. - №12. - С. 91-95.
6. Папонов ВД., Громов П.С., Ковалев Л.И., и др. // Бюлл. эксп. биол. и мед. - 1985. - №1. - С. 50-52.
7. Папонов ВД., Симонова А.В., Малашенко-ва Е.В. // Иммунология. - 1997. - №2. - С. 60-63.
8. Цветкова Е.В. Клиническое значение белковых продуктов генов лейкоцитов крови (53К и 43К) у новорожденных и детей с аллергической патологией: Автореф. дисс. канд. мед. наук. - М., 2004.
9. Папонов В.Д., Громов П.С., Краснов H.A., Спитковский Д.М. // Вопр. мед. химии. - 1981. -№5. - С. 666-668.
10. Папонов В.Д., Щеглова Е.Г., Яруллин P.H., Купсик Е.Г. // Бюлл. эксп. биол. и мед. - 1985. - №8.
- С. 188-190.
11. Папонов ВД., Сунцова И.Г., Папонов В.В. и др. // Бюлл. эксп. биол. и мед. - 2001. - Т. 132, №9. -С. 247-250.
12. Папонов В Д., Радько С.П., Штейн Е.В., Щеглова Е.Г. // Бюлл. эксп. биол. и мед. - 1992. -№5. - С. 527-529.
13. Чумаков П.М. // Биохимия. - 2000. - Т. 65.
- Вып. 1. - С. 34-47.
14. Папонов В.Д.,Мордовцев В.Н. Оценка реакций генетического аппарата человека на уровне белковых продуктов генов лейкоцитов крови с массами 53 и 43 килодальтон при некоторых дерматозах. Пособие для врачей. - М., 2003. - С. 1-17.
