CC BY
73
Оригинальная статья
П.В. Шумилов1, М.Г. Ипатова1, Л.И. Кафарская1, А.Н. Шкопоров1, А.С. Потапов2
1 Российский государственный медицинский университет, Москва
2 Научный центр здоровья детей РАМН, Москва
Клиническое значение пристеночной микрофлоры у детей с неспецифическим язвенным колитом
Контактная информация:
Шумилов Петр Валентинович, кандидат медицинских наук, доцент кафедры детских болезней № 2 Российского государственного медицинского
университета им. Н.И. Пирогова
Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, д. 1, тел.: (495) 254-77-46, e-mail: peter_shumilov@mail.ru Статья поступила: 03.04.2010 г., принята к печати: 14.09.2010 г.
Одним из ключевых факторов, определяющих течение неспецифического язвенного колита (НЯК), является микрофлора кишечника. Был исследован доминирующий состав пристеночной микрофлоры (Clostridium coccoides, Clostridium leptum, Bacteroides fragilis, Bifidobacterium, Lactobacillus, Prevotella, и Atopobium) у детей с неспецифическим язвенным колитом (НЯК) методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Показано, что для детей с НЯК характерно повышение бактериальной плотности C. coccoides и Lactobacillus при некотором снижении Bifidobacterium, B. fragilis и Prevotella. Популяционные уровни отдельных представителей пристеночной микрофлоры (B. fragilis, Lactobacillus, C. leptum, C. coccoides, Prevotella, Bifidobacterium) отличаются в зависимости от распространенности, тяжести и активности патологического процесса при НЯК.
Ключевые слова: воспалительные заболевания кишечника, неспецифический язвенный колит, пристеночная микрофлора кишечника, полимеразная цепная реакция, дети.
Последние три десятилетия характеризуются быстрым ростом числа больных с неспецифическим язвенным колитом (НЯК). НЯК встречается у детей всех возрастных групп. Пик заболеваемости приходится на подростковый и юношеский возраст: приблизительно 30% НЯК манифестирует в возрасте от 10 до 19 лет. Воспалительные заболевания кишечника у детей и взрослых пациентов схожи в своей клинической манифестации и имеют одинаковый базисный алгоритм
терапии, но течение НЯК у детей имеет ряд важных особенностей. В частности, для детского возраста характерно преобладание быстропрогрессирующих и распространенных форм НЯК. Тотальный колит наблюдаются у 60-80% детей и лишь у 20-30% взрослых, страдающих НЯК [1, 2].
НЯК до сих пор остается неизлечимым заболеванием и часто требует комплексной терапии с применением различных групп лекарственных препаратов,
P.V. Shumilov1, M.G. Ipatova1, L.I. Kafarskaya1, A.N. Shkoporov1, A.S. Potapov2
1 The Russian State Medical University of Russia's Healthcare Agency, Moscow
2 Scientific Center of Children's Health, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow
Clinical significance of parietal microflora in children with non-specific ulcerative colitis
One of the key factors driving the development of non-specific ulcerative colitis (NSUC) is the intestinal microflora. The dominant composition of the parietal microflora was studied (Clostridium coccoides, Clostridium leptum, Bacteroides fragilis, Bifidobacterium, Lactobacillus, Prevotella, и Atopobium) in children with non-specific ulcerative colitis (NSUC) using the polymerase chain reaction method in real time. It was shown that it was characteristic of children with NSUC to have increased bacterial density of C. coccoides and Lactobacillus, combined with somewhat reduced Bifidobacterium, B. fragilis and Prevotella. Population levels of individual parietal microflora components (Bacteroides fragilis, Lactobacillus, Clostridium leptum, Clostridium coccoides, Prevotella, Bifidobacterium) vary depending on prevalence, severity and intensity of pathological process in the case of NSUC.
Key words: inflammatory intestinal diseases, non-specific ulcerative colitis, parietal intestinal microflora, polymerase chain reaction, children.
Оригинальная статья
а при их неэффективности — даже хирургического вмешательства. Лечение противовоспалительными, антибактериальными препаратами, кортикостероидами и/или иммуносупрессивными средствами, как правило, эффективно, но не приводит к полному выздоровлению [3, 4]. Безусловно, необходим поиск новых подходов к терапии данной патологии, что, в свою очередь, требует более полного понимания факторов, приводящих к развитию НЯК.
Результаты современных отечественных и зарубежных исследований указывают на значительную роль индиген-ной микрофлоры в патогенезе НЯК. Но на сегодняшний день данные о кишечной микрофлоре у пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника неоднозначны. Это обусловлено тем, что традиционные методы выделения микроорганизмов в культуре дают неполную картину состава микрофлоры кишечника вследствие того, что одни виды бактерий, обитающих в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ), лучше поддаются культивированию, чем другие. В результате искажается состав кишечной микрофлоры, что приводит к недооценке роли отдельных микроорганизмов и целых бактериальных групп у здоровых детей и при патологических процессах. Также в большинстве исследований изучалась преимущественно фекальная микрофлора, которая по составу существенно отличается от микрофлоры слизистой оболочки ЖКТ [5]. Доминирующая часть пристеночной микрофлоры, в которой в значительной степени преобладают некультивируе-мые анаэробы, остается мало изученной.
В настоящее время для изучения микрофлоры в качестве наиболее чувствительного и быстрого метода широко применяется метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием специфических праймеров, которые позволяют определить род и вид представителей микробиоценоза. Уже разработаны специфические праймеры для многих известных видов бактерий, которые присутствуют в пищеварительном тракте [6-8]. ПЦР в режиме реального времени с видоспецифичными праймерами может предоставить точные количественные данные о пристеночной микрофлоре.
Учитывая актуальность данной проблемы, целью нашей работы стало изучение особенностей состава пристеночной микрофлоры методом количественной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени у пациентов с неспецифическим язвенным колитом.
Согласно молекулярным исследованиям нуклеотидных последовательностей 165 рибосомальных РНК, бактерии микрофлоры человека таксономически подразде-
ляются на четыре филогенетических отдела: Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria и Proteobacteria. При этом первые 3 отдела составляют до 95% общей популяции микроорганизмов. В нашей работе мы изучили количественный состав представителей каждого филогенетического отдела: род Lactobacillus, группу Clostridium leptum, группу Clostridium coccoides (отдел Firmicutes), группу Bacteroides fragilis, род Prevotella (отдел Bacteroidetes), род Bifidobacterium, группу Atopobium (отдел Actinobacteria).
ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ
Исследование проводилось в отделении гастроэнтерологии Научного центра здоровья детей РАМН. Было обследовано 16 детей с НЯК: 7 девочек и 9 мальчиков в возрасте от 3,5 до 17 лет (10,8 ± 3,9 лет). Детальное распределение детей с НЯК по возрасту и полу представлено в табл. 1. У всех больных диагноз НЯК был установлен на основании стандартных методов исследования, включающих в себя клинические, лабораторные, эндоскопические и морфологические критерии.
Группу контроля составили 8 детей, у которых фибро-колоноскопия проводилась с диагностической целью. В результате обследования у 5 детей был диагностирован синдром раздраженной кишки, у 2-х — трещина анального отверстия и у 1-го ребенка — полип в сигмовидной кишке. Обе группы были сопоставимы по возрасту и полу.
Изучение особенностей состава индигенной пристеночной микрофлоры (C. coccoides, C. leptum, B. fragilis, Bifidobacterium, Lactobacillus, Prevotella, и Atopobium) проводилось методом количественной ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) с группоспецифичными и родоспецифичными праймерами (табл. 2) [7, 8].
Забор материала для исследования проводился во время плановой диагностической фиброколоноскопии с лестничной биопсией, назначенной лечащим врачом согласно индивидуальному плану обследования. В качестве материала для исследования пристеночной микрофлоры были использованы биоптаты слизистой оболочки кишки, взятые из стандартного участка на границе сигмовидной и прямой кишки (ректосигмоидный переход), который условно определяли на расстоянии 10 см от анального сфинктера. Исследование образца данного участка желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) было обусловлено самой высокой бактериальной плотностью, а также наиболее частой локализацией патологического процесса у детей с воспалительными заболеваниями кишечни-
Таблица 1. Распределение детей с воспалительными заболеваниями кишечника (п = 16) по гендерному признаку и возрасту
Пациенты Возраст
до 3-х лет 4 года — 12 лет 13-17 лет
Мальчики 1 2 6
Девочки 0 1 6
Всего 1 3 12
Бактериальная группа Праймеры Нуклеотидная последовательность Размер ампликона, п.н. Температура отжига, °С Источник
Bacteroides fragilis (группа) g-Bfra-F ATAGCCTTTCGAAAGRAAGAT 495 50 Matsuki и соавт., 2002 [7]
g-Bfra-R CCAGTATCAACTGCAATTTTA
Prevotella (род) g-Prevo-F CACRGTAAACGATGGATGCC 513 55 Matsuki и соавт., 2002 [7]
g-Prevo-R GGTCGGGTTGCAGACC
Clostridium coccoides (группа) g-Ccoc-F AAATGACGGTACCTGACTAA 440 50 Matsuki и соавт., 2002 [7]
g-Ccoc-R CTTTGAGTTTCATTCTTGCGAA
Clostridium leptum (группа) sg-Clept-F GCACAAGCAGTGGAGT 239 50 Matsuki и соавт., 2004 [8]
sg-Clept-R3 CTTCCTCCGTTTTGTCAA
Atopobium (группа) c-Atopo-F GG GTT GAGAGACCGACC 190 55 Matsuki и соавт., 2004 [8]
c-Atopo-R CGGRGCTTCTTCTGCAGG
Lactobacillus (род) Lacto-F GTCGTTCTATGAACTTACCA 251 55 Настоящее исследование
Lacto-R CCCCGTCATCGACCCCGACA
Bifidobacterium (род) Bifi-F ATCGTGGCTAGGGAGAACGC 318 50 Настоящее исследование
Bifi-R ACCGACAGATCGGGCACGGG
73
ка. Биоптат слизистой оболочки прямой кишки хранился в сухой пластиковой микропробирке при температуре -80°C до проведения исследования.
Выделение ДНК из образцов проводилось с использованием набора ZR Genomic DNA Tissue MiniPrep (Zymo Research) в соответствии с рекомендациями изготовителя. Постановку реакции ПЦР в режиме реального времени осуществляли с использованием готовых 2,5Х ПЦР-смесей (Синтол) в приборе АНК-32 (Синтол). Флуоресценция в пробирках детектировалась в режиме реального времени на канале FAM. Значения пороговых циклов определялись автоматически прибором. Построение калибровочных кривых и расчет значений концентрации бактериального геномного ДНК в исследуемых образцах проводили с использованием программы Microsoft Excel.
Статистическая обработка проводилась с помощью стандартного пакета программ BIOSTAT и STATISTICA 6.0 с использованием критериев параметрической (T-тест) и непараметрической (критерий Манна-Уитни и парный критерий Уилкоксона) статистики. В целях выявления характера взаимодействия между показателями, характеризующими изменение в организме ребенка, анализировалась линейная корреляция Пирсона (r) или ранговая корреляция Спирмена (rS).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
При поступлении в клинику у большинства (64%) детей наблюдалось обострение болезни. Самыми частыми клиническими проявлениями у детей, страдающих НЯК, были: частый разжиженный стул до 4-6 раз в сут (69%), кровь в стуле (50%) и болевой синдром (54%), локализующийся по ходу толстой кишки и имеющий связь с актом
дефекации. У 69% детей с НЯК отмечались внекишечные проявления. Умеренная клиническая активность диагностировалась у большинства (31%) пациентов, дети с высокой и низкой активностью патологического процесса составили по 25%, соответственно. Ремиссия отмечалась у 19% пациентов.
При эндоскопическом обследовании у детей с НЯК преобладали распространенные формы поражения толстой кишки (панколит) — в 63% случаев и низкая степень активности (38%), в то время как умеренная и высокая активность болезни отмечалась у 25% пациентов. У 12% детей эндоскопическая картина соответствовала стадии ремиссии.
Результаты лабораторных исследований у детей с НЯК указывали на наличие анемии (25% пациентов) и латентного дефицита железа (41,1% случаев). Среди неспецифических изменений крови, свойственных хроническому воспалению, у больных с НЯК наиболее часто встречались лейкоцитоз, моноцитоз, тромбоцитоз, ускорение СОЭ, диспротеинемия, гипергаммаглобулинемия, увеличение уровней иммуноглобулинов (Ig) класса А, G и M, циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК).
При анализе количественного состава пристеночной микрофлоры было выявлено, что суммарная бактериальная плотность (количество бактериальной геномной ДНК, которая была детектирована методом ПЦР-РВ в каждом исследуемом биоптате) у детей с НЯК и в группе контроля не имеет статистически значимых отличий. У детей с НЯК была выявлена более низкая бактериальная плотность B. fragilis и Prevotella и повышенное количество Lactobacillus по сравнению с детьми контрольной группы. При оценке бактериальной обсемененности пристеночной микрофлоры у детей исследуемых групп было выяв-
ПЕДИАТРИЧЕСКАЯ ФАРМАКОЛОГИЯ /2010/ ТОМ 7/ № 5
Оригинальная статья
лено, что для детей с НЯК характерны более высокие значения C. coccoides (табл. 3).
Были изучены особенности состава пристеночной микрофлоры кишечника и его влияния на клиническую и эндоскопическую картины, а также площадь поражения у детей с НЯК.
У детей с высокой клинической активностью НЯК (25% пациентов) было снижено содержание представителей всех исследуемых групп микрофлоры, за исключением рода Lactobacillus, уровень которого был максимальным (рис. 1). Количество копий нуклеотидных последовательностей Bifidobacterium у этих детей с высокой клинической активностью было ниже порогового уровня чувствительности метода. Максимальные значения Bifidobacterium были отмечены у детей с низкой активностью болезни (23%). Данные закономерности изменений Lactobacillus и Bifidobacterium подтверждаются выявленными прямыми сильными корреляционными связями Lactobacillus с высокой клинической активностью НЯК (rS = 0,86, p < 0,01), а Bifidobacterium с низкой клинической активностью патологического процесса (rS = 0,79, p < 0,05).
При анализе лабораторных показателей с исследуемыми бактериальными группами было выявлено, что для Bifidobacterium характерна прямая сильная корреляция (rS = 0,78, p < 0,05) с уровнем ^М в сыворотке крови. Для Lactobacillus была выявлена прямая сильная связь с повышением С-реактивного белка (СРБ) (rS = 0,83, p < 0,001).
При индивидуальном анализе бактериальных групп в зависимости от эндоскопического индекса активности по Rachmilewitz нами было отмечено, что для детей с высокой эндоскопической активностью характерно снижение бактериальной плотности Prevotella по сравнению с детьми, у которых эндоскопическая картина соответствовала умеренной и низкой активности (рис. 2). Однако, это количество было схоже с количеством копий нуклеотидных последовательности Prevotella у детей, находящихся в эндоскопической ремиссии. У детей с умеренной эндоскопической активностью (31%) не было выявлено статистически значимых отличий бактериальной плотности исследуемых бактерий по сравнению с эндоскопической картиной у других детей. При низкой клинической активности (25% случаев) были выявлены самые высокие значения копий нуклеотидных последовательностей Prevotella по сравнению с другими группами эндоскопической активности; отличия были статистически значимы (p < 0,05). Эндоскопическая ремиссия у детей с НЯК (19%) характеризовалась самой низкой бактериальной плотностью C. leptum и C. coccoides.
Анализируя связь бактериальной плотности с распространенностью патологического процесса при НЯК, было выявлено, что при проктосигмоидитах (25%) повышена бактериальная плотность B. fragilis, C. coccoides по сравнению с проктитами и панколитами (см. рис. 2). А у детей с проктитами (12%) количество копий нуклеотидных последовательностей Bifidobacterium было ниже порогового уровня чувствительности метода.
Таблица 3. ^став пристеночной микрофлоры ректосигмоидного отдела кишечника по результатам полимеразной цепной реакции (M ± ст)
Бактериальная группа Праймер Больные НЯК (n = 16) Группа контроля (n = 8)
log10, копий геномной ДНК/г
Bacteroides fragilis (группа) g-Bfra-F 6,45 ± 0,72 6,89 ± 0,89
g-Bfra-R
Prevotella (род) g-Prevo-F 6,31 ± 0,82 6,53 ± 0,75
g-Prevo-R
Clostridium coccoides (группа) g-Ccoc-F 8,15 ± 1,05 7,83 ± 1,07
g-Ccoc-R
Clostridium leptum (группа) sg-Clept-F 7,51 ± 0,41 7,42 ± 0,43
sg-Clept-R3
Atopobium (кластер) c-Atopo-F 8,39 ± 0,32 8,32 ± 0,21
c-Atopo-R
Lactobacillus (род) g-Lacto-F 2,59 ± 0,63 2,29 ± 0,58
g-Lacto-R
Bifidobacterium (род) g-Bifi-F 7,39 ± 0,15 7,63 ± 0,58
g-Bifi-R
Примечание. * — р < 0,05 по сравнению с группой сравнения.
Рис. 1. Средние значения представителей индигенной микрофлоры в зависимости от клинической активности по индексу Рахмилевича у детей с неспецифическим язвенным колитом (^10, клеток/г)
Высокая активность Умеренная активность Низкая активность Клиническая ремиссия
□ Суммарная бактериальная плотность
□ Prevotella (род)
□ Clostridium leptum (группа)
□ Lactobacillus (род)
□ Bacteroides fragilis (группа)
□ Clostridium coccoides (группа)
□ Atopobium (кластер)
□ Bifidobacterium (род)
75
Рис. 2. Средние значения представителей индигенной микрофлоры в зависимости от распространенности патологического процесса у детей с неспецифическим язвенным колитом
10
8,4
8,43
7,33
6,16 6,18
Панколит
Проктосигмоидит
Проктит
□ Суммарная бактериальная плотность
□ Prevotella (род)
□ Clostridium leptum (группа)
□ Lactobacillus (род)
□ Bacteroides fragilis (группа)
□ Clostridium coccoides (группа)
□ Atopobium (кластер)
□ Bifidobacterium (род)
ПЕДИАТРИЧЕСКАЯ ФАРМАКОЛОГИЯ /2010/ ТОМ 7/ № 5
Оригинальная статья
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, качественный и количественный анализ состава пристеночной микрофлоры кишечника у детей с НЯК не показал статистически значимых различий суммарной бактериальной плотности между детьми, страдающими НЯК и группы контроля. Однако, в ходе исследования были выявлены качественные и количественные различия в составе пристеночной микрофлоры при различных формах течения НЯК у детей. Для пациентов с НЯК характерен относительно высокий уровень C. coccoides и Lactobacillus при некотором снижении бактериальной плотности Bifidobacterium, B. fragilis и Prevotella. Период обострения болезни характеризуется относительным повышением бактериальной плотности по сравнению с ремиссией. Максимальная бактериальная плотность отмечается у детей с низкой клинической активностью (log10 8,65 ± 0,28). По мере повышения клинической активности показатели бактериальной плотности снижаются до log10 8,46 ± 0,63, что связано с усилением агрессивности проводимого лечения, в том числе с назначением антибактериальной терапии.
Интересно, что у детей с высокой клинической активностью НЯК выявлена и более высокая бактериальная плотность Lactobacillus (p < 0,01), а также прямая сильная корреляция с повышением уровня СРБ (rS = 0,83, p < 0,001), что указывает на участие Lactobacillus в патологическом процессе. Для объяснения выявленной зависимости необходимы дальнейшие исследования с учетом особенностей различных штаммов рода Lactobacillus, так как в настоящее время доказано, что разные штаммы лактобацилл оказывают различный по степени выраженности иммуномодулирующий эффект. В ходе многочисленных исследований было выявлено, что лактобациллы могут участвовать в процессе распознавания макрофагами и даже способны активировать фактор транскрип-
ции NF-kB, однако, в норме развитие иммунного ответа подавляется [8].
Частота встречаемости Bifidobacterium у детей с НЯК составила 43% случаев, и 25% — в группе контроля. Однако при высокой клинической активности у детей с НЯК было отмечено практически полное отсутствие Bifidobacterium, то есть значения Bifidobacterium были ниже порогового уровня чувствительности метода. Вместе с тем была выявлена прямая сильная корреляция бифидобактерий с низкой активностью заболевания (rS = 0,79, p < 0,05). Анализ лабораторных показателей показал, что для пациентов с НЯК характерна прямая сильная корреляция Bifidobacterium (rS = 0,78, p < 0,05) с уровнем ^М в сыворотке крови, что свидетельствует об активации гуморального звена иммунитета.
На сегодняшний день известно, что лакто- и бифидобактерии обладают иммуногенными свойствами и способны стимулировать врожденный и приобретенный иммунитет. В норме иммунный ответ слизистой оболочки кишечника ограничен, характеризуется иммунологической толерантностью к представителям индигенной микрофлоры (в первую очередь лакто- и бифидобактериям), одновременно сохраняя способность адекватно реагировать на патогенные микроорганизмы. Иммунологическая толерантность является одним из компонентов иммунного «покоя». Отклонения от этого состояния и, в частности, генетически детерминированные патологические иммунные ответы на антигены, находящиеся в просвете кишечника, могут приводить к развитию воспалительных заболеваний кишечника.
Результаты проведенного исследования свидетельствуют о нарушении иммунологической толерантности к представителям нормальной микрофлоры ЖКТ, что является предпосылкой для более осторожного применения пробиотических препаратов у пациентов с данной патологией, особенно при высокой активности болезни.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Румянцев В. Г., Щиголева Н. Е. Болезнь Крона в детском возрасте // Consilium Medicum. Прил. — 2002; 4 (6): 17-20.
2. Румянцев В. Г., Щиголева Н. Е. Неспецифический язвенный колит у детей // Consilium Medicum. Прил. — 2002; 4 (6): 16-19.
3. Prantera C., Berto E., Scribano M. et al. Use of antibiotics in the treatment of active Crohn's disease: experience with metronidazole and ciprofloxacin // Ital. J. Gastroenterol. Hepatol. — 1998; 30: 602-606.
4. Prantera C., Kohn A. Proposed measures of disease activity: how useful are they? — New York, NY: Marcel Dekker Inc, 1996. — Р. 187-97.
5. Eckburg P. B., Bik E. M., Bernstein C. N. et al. Diversity of the human intestinal microbiol flora // Science. — 2005; 308: 1635-1638.
6. Matsuki T., Watanabe K., Fujimoto J. et al. Development of 16S rRNA-gene-targeted group-specific primers for the detection and identification of predominant bacteria in human feces // Appl. Environ. Microbiol. — 2002; 68: 5445-5451.
7. Matsuki T., Watanabe K., Fujimoto J. et al. Use of 16S rRNA gene-targeted group-specific primers for real-time PCR analysis of predominant bacteria in human feces // Appl. Environ. Microbiol. — 2004; 70: 7220-7228.
8. Miettinen M., Lehtonen A., Julkunen L. et al. Lactobacilli and treptococci activate NF-kB and STAT signaling pathways in human macrophages // J. Imminol. — 2000; 64: 3733-3740.
