CC BY
90
УДК 616-006.444.04:575.22
КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ДЕЛЕЦИИ ГЕНА ССЯ5 У БОЛЬНЫХ НЕХОДЖКИНСКИМИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫМИ ЛИМФОМАМИ
Елена Николаевна ВОРОПАЕВА1, Наталия Валерьевна СКВОРЦОВА1,
Михаил Иванович ВОЕВОДА2, Радион Валерьевич ТАРНОВСКИЙ1
1ГОУ ВПО Новосибирский государственный медицинский университет Росздрава 630091, г. Новосибирск, Красный пр., 52
2НИИ терапии СО РАМН
630089, г. Новосибирск, ул. Б. Богаткова, 175/1
Обследовано 99 пациентов, которым впервые выставлен диагноз «неходжкинская злокачественная лимфома» (НХЗЛ). Показано, что дикий тип гена хемокинового рецептора ССК5 при НХЗЛ связан с большей диссеми-нацией опухолевых клеток по лимфоидным органам, таким как лимфоузлы и селезенка, и с большей частотой лейкемизации лимфомы. Показано, что уменьшение уровня активного рецептора ССК5 на поверхности опухолевых и стромальных клеток у больных НХЗЛ, несущих делецию гена ССЯ5, а следовательно, и меньший их ответ на провоспалительные хемокины, может являться благоприятным фактором, ограничивающим распространение опухоли при лимфомах.
Ключевые слова: неходжкинские лимфомы, генетический полиморфизм, CCR5.
Введение
Неходжкинские злокачественные лимфомы (НХЗЛ), на долю которых приходится до 18 случаев на 100 тысяч населения в год, — наиболее часто диагностируемые гематологические опухоли. Анализ работы Городского гематологического центра г. Новосибирска свидетельствует, что с 1997 по 2008 гг. заболеваемость лимфомами в г. Новосибирске выросла более чем втрое, причем темпы прироста опережают заболеваемость лейкозами. Так, в 2008 г. среди больных, получивших специализированную помощь в условиях гематологического стационара, почти половина (49,8 %) случаев приходилась на больных НХЗЛ, при этом 46,4 % — это лимфомы высокой степени злокачественности (агрессивные).
В последние годы во всем мире накапливаются данные, свидетельствующие о том, что немаловажную роль в этиологии НХЗЛ играет генетическая предрасположенность [1], идентифицирован ряд кандидатных генов. Случай-контролируемые исследования подтверждают полигенную модель такой предрасположенности, основанную на сочетании в одной клеточной линии нескольких неблагоприятных аллелей генов.
Для НХЗЛ особое значение имеют полиморфные варианты генов, вовлеченных в регуляцию работы иммунной системы. Ряд последних иссле-
дований указывает на то, что олигонуклеотидные полиморфизмы (ОНП) в таких генах как ТКБ и ЬТЛ, генах интерлейкинов, например 1Ь4, 1Ь5, 1Ь6 и 1Ь10, а также генах, ответственных за врожденный иммунитет (РСОЯ2Л, ТЬЯ4 и СЛЯБ1), могут быть факторами риска развития НХЗЛ в целом или отдельных их гистологических вариантов, а в ряде случаев они могут влиять на клиническое течение заболевания.
Менее изучена роль полиморфизма генов хемокинов и их рецепторов в патогенезе лим-фом. Вместе с тем хемокины — это небольшие пептиды, которые передают хемоаттрактантную активность лимфоидным клеткам и, таким образом, являются критически важными для формирования комплексной архитектуры вторичных лимфоидных органов [2]. В-клеточные и Т-клеточные опухоли имеют гетерогенную картину вовлечения лимфоидных и нелимфоидных органов, которая может быть результатом различной экспрессии хемокинов и хемокиновых рецепторов [3—5].
Ген хемокинового рецептора ССЯ5 локализован на коротком плече 3 хромосомы. Лиганды ССЯ5, такие как хемокины ССЬ3, ССЬ4, ССЬ5 и ССЬ8, играют главную роль в хемотаксисе и активации лимфоцитов во вторичных лимфоидных органах [6].
Воропаева Е.Н. — к.м.н., ассистент кафедры терапии, гематологии и трансфузиологии, e-mail: [email protected]
Скворцова Н.В. — к.м.н., ассистент кафедры терапии, гематологии и трансфузиологии, e-mail: [email protected]
Воевода М.И. — д.м.н., проф., директор, e-mail:[email protected]
Тарновский Р.В. — старший лаборант кафедры терапии, гематологии и трансфузиологии, e-mail: [email protected]
Известно, что около 1 % европеоидов гомозиготны по полиморфизму ССЯ532ёе1, который приводит к отсутствию экспрессии функционирующего рецептора на поверхности клеток, тогда как плотность активного рецептора на поверхности клеток гетерозиготных по ССЯ532ёе1 лиц уменьшена вдвое по сравнению с нормальным [7]. Активное изучение данного полиморфизма гена хемокинового рецептора ССЯ5 в последние два десятилетия было связано с тем, что он определяет прогрессию, резистентность или отсутствие прогрессирования ВИЧ-инфекции [7].
В настоящее время проведен ряд исследований, целью которых было изучить связь между ССЯ532ёе1 и клиническим поведением опухолей у людей. Получены неоднозначные данные. С одной стороны, результаты этих исследований свидетельствуют о негативной корреляции между экспрессией ССЯ5 и ростом рака молочной железы [8]. С другой стороны, было показано, что дикий тип гена ССЯ5 и высокая экспрессия соответствующего рецептора связаны с более высоким метастатическим потенциалом опухолевых клеток [7—9].
Цель настоящего исследования - изучить частоту ССЯ532ёе1 у больных НХЗЛ и определить его ассоциацию с особенностями клинического течения лимфом.
Материал и методы
Группу обследованных составили 99 пациентов Новосибирского городского гематологического центра, которым за период с 2004 по 2007 гг. был впервые выставлен диагноз НХЗЛ (44 мужчины и 55 женщин в возрасте 15—85 лет, средний возраст 47,0 ± 2,3 года). Пациенты имели различные гистологические варианты лимфом (58 человек с ин-долентными лимфомами и 41 — с агрессивными). Забор материала для генотипирования проводился до начала активной полихимиотерапии для исключения ее влияния на результаты исследования.
Контролем служили данные о частоте ССЯ532ёе1 среди практически здоровых лиц — жителей Западной Сибири (г. Новосибирск и г. Томск) [10].
Геномная ДНК выделялась из 10—15 мл цельной венозной крови по стандартной методике с использованием протеиназы К и с последующей фенольно-хлороформной экстракцией, осаждением этанолом.
211 М 1 12122121 1
Рис. Результаты аллель-специфичной ПЦР
на полиморфизм CCR532del: 1 — 250 п. н. (w/w);
2 — 250 + 218 п. н. (w/del); М — ДНК молекулярный маркер по 100 п. н.
Для выявления del32bp CCR5 использовали аллель-специфичную полимеразную цепную реакцию (ПЦР) (рис.). Участок гена, потенциально несущий делецию, амплифицировали с использованием 25 пмоль каждого из праймеров: F, 5’- GAA GGT CTT CAT TAC ACC TG -3’; R, 5’- AGA GTT CCT GGA AGG TGT TC -3’. Условия ПЦР были следующие: 94 °C — 3 минуты, затем 30 циклов: 94 °C — 0,5 минуты, 53 °C — 1 минута и 72 °C — 1 минута, заключительный цикл 72 °C — 3 минуты. ПЦР-фрагменты разделялись электрофорезом на 6%-ном полиакриламидном геле. Можно различить три генотипа по трем различным картинам полос на электрофореграмме: w/w (дикий тип), 250 пар нуклеотидов (п. н.); w/del (гетерозиготный), 250 + 218 п. н.; del/del (гомозиготный мутантный), 218 п. н. (рис.).
Сравнение частот полиморфизмов гена р53 между группами проводили с использованием критерия х2 Пирсона или точного критерия Фишера. Значение p менее чем или равное 0,05 считали статистически значимым.
Результаты и обсуждение
Хемокиновый рецептор CCR5 экспрессируется большим количеством клеток, включая лимфоциты, и функционирует для передачи хемо-аттрактантного сигнала и хоминга клеток. Роль изменений в экспрессии хемокинового рецептора, связанных с CCR532del, в процессе развития нормальных лимфоцитов и при НХЗЛ полностью не ясна, но ее изучение может предоставить важную информацию о поведении опухолевых лимфоидных клеток.
Было показано, что распределение частот аллелей и генотипов del32bp гена CCR5 было идентичным в группах пациентов с НХЗЛ (как агрессивными, так и индолентными вариантами заболевания)
Таблица 1
Распределение ССЯ532йв1 в группе больных НХЗЛ и в группе популяционного контроля (%)
CCR532del Контроль (n = 136) Больные НХЗЛ (n = 99) Пациенты с индолентными НХЗЛ (n = 42) Пациенты с агрессивными НХЗЛ (n = 57)
аллель w 90 89 89 89
del 10 11 11 11
генотип w/w 80 УВ У9 77
w/del 1У 22 21 23
del/del З - - -
и популяционного контроля и соответствовало равновесию Харди — Вайнберга (табл. 1). Частота ёе1-аллеля достигала значения 11 % в каждой из этих групп. Однако это не свидетельствует об отсутствии значения данного полиморфизма при НХЗЛ.
Полученные результаты свидетельствуют, что дикий тип гена хемокинового рецептора ССЯ5 при НХЗЛ был связан с большей диссеминацией опухолевых клеток по лимфоидным органам, таким как лимфоузлы и селезенка (табл. 2).
В частности, лица, несущие ёе132Ър, имели начальные стадии (I и II) заболевания в момент диагностики в 37 % случаев, тогда как в группе пациентов с диким гомозиготным генотипом ССЯ5 начальные стадии лимфом определялись в 2 раза реже (17 %) (р < 0,05). Продвинутые стадии (III и IV) заболевания имели только 63 % лиц с ёе132Ър ССЯ5, тогда как 83 % больных с диким гомозиготным генотипом ССЯ5 имели продвинутые стадии лимфом (р < 0,05).
В то же время были выявлены различия по выраженности спленомегалии в группах с различными генотипами ССЯ5. Только у 27 % пациентов, имеющих делецию, отмечалась спленомегалия. У больных с диким типом ССЯ5 она регистрировалась в 1,7 раз чаще (46 %). У 83 % больных с ёе132Ър ССЯ5 спленомегалия носила невыраженный характер, в то время как среди лиц с диким типом гена таких пациентов был 31 % (р < 0,05), а умеренно или значительно выраженная спленомегалия у последних встречала в 48 и 21 % случаев соответственно.
НХЗЛ — это опухоли, которые характеризуются накоплением злокачественных клеток в костном мозге на поздних стадиях заболевания. Важно отметить, что, помимо большей распространенности неоплазированных лимфоцитов по лимфоидной системе, в обследованной группе была отмечена большая частота лейкемизации лимфомы (табл. 2) среди больных с диким типом гена ССЯ5 в сравнении с пациентами с делецией данного гена (74 и 45 % соответственно, р < 0,05).
Полученные данные можно объяснить несколькими механизмами. В частности, более высоким уровнем экспрессии рецептора CCR5 у носителей дикого типа гена, который приводит к миграции опухолевых лимфоидных клеток по градиенту концентрации хемокинов. В случае del32bp CCR5 количество активных рецепторов на поверхности клеток уменьшается вдвое, а следовательно, уменьшается и чувствительность клеток к хемо-аттрактантным лигандам (MIP-1a, MIP-ip (macrophage-inflammatory protein), RANTES (regulated on activation normal T-cell expressed and selected)), в ответ на которые лимфомные клетки способны рециркулировать по крови во вторичные лимфоидные органы [11].
Однако данным патогенетическим механизмом можно объяснить диссеминацию опухолевых клеток не при всех вариантах НХЛ. Так, Trentin L. et al. изучали роль различных хемокинов и их рецепторов на опухолевых В-лимфоцитах больных с широким кругом лимфопролиферативных заболеваний: хроническим лимфолейкозом (ХЛЛ), волосатоклеточным лейкозом (ВКЛ), мантийно-клеточной лимфомой (МКЛ), лимфомой из В-лимфоцитов маргинальной зоны, лимфомой из малых лимфоцитов и фолликулярной лимфомой. Проточная цитометрия показала, что CCR5 экспрессировался на опухолевых клетках всех больных МКЛ и большинства больных ВКЛ (78 %), но редко обнаруживался на В-лимфоцитах лиц контрольной группы и на злокачественных В-клетках больных ХЛЛ (7,7 %) [2].
Картина экспрессии хемокиновых рецепторов Т-клеточными НХЛ исследовалась Jones D. et al. [12]. Используя панель мышиных моноклональных антител, они иммуногистохимическим способом исследовали экспрессию хемокиновых рецепторов у 141 больного Т-клеточными лим-фомами. Было показано отсутствие постоянной ассоциации экспрессии CCR5 с каким бы то ни было вариантом опухоли Т-клеточной природы.
Таблица 2
Ассоциация CCR532del с особенностями клинического течения НХЗЛ
Особенности клинического течения CCR532del Уровень значимости достигнутых различий (р)
w/del (n = 22) w/w (n = 77)
% %
Увеличение селезенки: 27 46 > 0,05
селезеночный индекс 21—40 см2 83 31 < 0,05
селезеночный индекс 41—60 см2 0 48 < 0,05
селезеночный индекс более 60 см2 17 21 > 0,05
Стадия I—II 37 17 < 0,05
Стадия Ш—^ 63 83 < 0,05
Лейкемизация 45 74 < 0,05
В-симптомы 50 88 < 0,001
Анализ экспрессии хемокиновых рецепторов при грибовидном микозе показал, что рецептор ССИ5 выявлялся редко и непостоянно на опухолевых клетках в очагах кожных поражений [13].
Таким образом, при некоторых вариантах НХЗЛ уровень экспрессии рецептора ССИ5 на поверхности опухолевых клеток уменьшен. Однако полученные результаты свидетельствуют, что как индолентные, так и агрессивные лимфомы с диким гомозиготным генотипом имели генерализацию опухолевого процесса. Это может быть связано с вовлечением хемокинов в диссемина-цию опухоли путем не только регуляции миграции клеток, но также и стимуляции ангионеоге-неза [14-15].
Имеющиеся в настоящее время данные дают возможность предположить, что зачастую хемоки-ны и их рецепторы в опухолевом микроокружении скорее способствуют росту и распространению не-оплазированных клеток, чем служат проявлением противоопухолевого иммунитета организма и способствуют регрессу опухоли. Так, в проведенных ранее исследованиях было показано, что при некоторых опухолях, например при раке почек, дикий тип гена ССЯ5 и высокая экспрессия рецептора ССИ5 приводят к большему метастатическому потенциалу злокачественных клеток [8, 16]. Возможным патогенетическим механизмом данного феномена является то, что высокий уровень экспрессии ССИ5 стромальными клетками у носителей дикого типа гена приводит к более выраженному сигналу их на ангионеогенез, который запускает инвазию и дис-семинацию опухолевых элементов по организму.
Поскольку микроокружение лимфомных клеток в костном мозге или во вторичных лимфоидных органах также является важным в биологии НХЗЛ, возможным механизмом ограничения диссеминации опухолевых клеток у пациентов с лимфомами, имеющих делецию гена ССЯ5, может быть уменьшенная в два раза экспрессия рецептора ССИ5 на поверхности стромальных элементов.
Было показано, что только половина пациентов (50 %) с делецией гена ССЯ5 имели симптомы опухолевой интоксикации (такие как фебрильная лихорадка, потеря массы тела и профузная потливость), выраженность которых, как известно, зависит от объема опухоли. В то же время эти симптомы были отмечены у 88 % больных (р < 0,001) с диким типом гена ССЯ5 (табл. 2).
Имеются данные, что хемокиновый рецептор ССИ5 играет центральную роль не только в миграции, хоминге лимфоцитов и ангионеогенезе. Беап М. е1 а1. изучали частоту СПИД-ассоциированных лимфом и отметили, что гомозиготные по ССЯ532ёе1 ВИЧ-инфицированные пациенты имели не только высокую скорость прогрессирования заболевания до стадии СПИД [16], но и больший риск развития НХЗЛ по той причине, что ИАКТЕЗ (один из лигандов ССЯ5) является митогеном для
B-лимфоцитов. Таким образом, полученные данные, свидетельствующие о меньшем объеме опухоли у пациентов, имеющих делеционный аллель гена CCR5, возможно объяснить меньшим ответом опухолевых лимфомных клеток на митогенный эффект RANTES.
Заключение
Миграция - один из фундаментальных процессов в онкогенезе. Однако остается много неясного в механизмах регуляции данного феномена. Установление принципов регуляции миграции опухолевых клеток важно не только для понимания основ биологии неоплазий, но также и для развития новых терапевтических стратегий и способов влияния на прогрессию опухоли. Изучение экспрессии хемокиновых рецепторов может помочь понять различия в клинических проявлениях различных вариантов НХЗЛ.
Полученные данные показывают, что уменьшение количества активных рецепторов CCR5 на поверхности опухолевых и стромальных клеток у больных НХЗЛ, несущих делецию гена CCR5, а следовательно, и меньший их ответ на провоспа-лительные хемокины, может являться благоприятным фактором, ограничивающим распространение опухоли при лимфомах.
Список литературы
1. Jemal A., Siegel R., Ward E. et al. Cancer statistics. 2007 // CA Cancer J. Clin. 2007. 57. 43-66.
2. Trentin L., Cabrelle A., Facco M. et al. Homeostatic chemokines drive migration of malignant B-cells in patients with non-Hodgkin lymphomas // Blood.-2004.- Vol. 104.- 502-508.
3. Lopez-Giral S., Quintana N.E., Cabrerizo M. et al. Chemokine receptors that mediate B-cell homing to secondary lymphoid tissues are highly expressed in B-cell chronic lymphocytic leukemia and non-Hodgkin lymphomas with widespread nodular dissemination // J. Leukoc. Biol. 2004. 76. (2). 462-471.
4. Jones D., O’Hara C., Kraus M.D. et al. Expression pattern of T-cell-associated chemokine receptors and their chemokines correlates with specific subtypes of T-cell non-Hodgkin lymphoma // Blood. 2000. 96. (2). 685-690.
5. Wong S., Fulcher D. Chemokine receptor expression in B-cell lymphoproliferative disorders// Leuk. Lymphoma. 2004. 45. (12). 2491-2496.
6. Dean M., Carrington M., Winkler C. et al. Genetic restriction of HIV-1 infection and progression to AIDS by a deletion allele of the CKR5 structural gene // Science. 1996. 273. 1856-1862.
7. Попович А.М. Иммунотерапия при ВИЧ-инфекции рекомбинантными интерлейкинами-2. С-Пб.: Знаменитые универсанты, 2004. 64 с.
Popovich A.M. Immunoterapy at HIV-infection with recombinant interleukins-2. S-Pb.: Znamenitye universanty, 2004. 64 p.
8. Azenshtein E., Luboshits G., Shina S. et al. The CC chemokine RANTES in breast carcinoma progression: regulation of expression and potential mechanisms of promalignant activity// Bioorg. Med. Chem. 2003. 11. 2663-26У6.
9. Suzuki S., Miyagi T., Chuang L.F. et. al. Chemokine receptor CCR5: polymorphism at protein level // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. 296. (2). 4УУ-483.
10. Орлова Ю.Ю., Алифирова В.М., Чердынце-ва Н.В., Гервас П.А. Полиморфизм гена хемоки-нового рецептора CCR5 у больных рассеянным склерозом в Сибирском регионе // Бюл. Сиб. мед. 2006. (3). 98-104.
Orlova Yu.Yu., Alifirova V.M., Cherdyntse-va N.V., Gervas P.A. Chemokine receptor CCR5: polymorphism at patients with multiple sclerosis in Siberian region // Byul. Sib. Med. 2006. (3). 98-104.
11. Wong S., Fulcher D. Chemokine receptor expression in B-cell lymphoproliferative disorders // Leuk. Lymphoma. 2004. 45. (12). 2491-6.
12. Jones D., O’Hara C., Kraus M.D. et. al. Expression pattern of T-cell-associated chemokine receptors and their chemokines correlates with specific subtypes of T-cell non-Hodgkin lymphoma // Blood. 2000. 96. (2). 685-690.
13. Bingle L., Brown N.J., Lewis C.E. The role of tumour-associated macrophages in tumour progression: implications for new anticancer therapies // J. Pathol. 2002. 196. 254-265.
14. Sakurai E., Anand A., Ambati B.K. Macrophage depletion inhibits experimental choroidal neovascularization // Cancer Res. 2002. 62. 1093— 1102.
15. Hamada I., Kato M., Yamasaki T. et al. Clinical effects of tumor-associated macrophages and dendritic cells on renal cell carcinoma // Anticancer Res. 2002. 22. 4281—4284.
16. Dean M., Jacobson L.P., McFarlane G. et. al. Reduced risk of AIDS lymphoma in individuals heterozygous for the CCR5-delta32 mutation // Cancer Res. 1999. 59. (15). 3561—3564.
CLINICAL SIGNIFICANCE OF CCR5 GENE DELETION AT PATIENTS WITH NON-HODGKIN’S LYMPHOMAS
Elena Nikolaevna VOROPAEVA1, Nataliya Valerievna SKVORTSOVA1, Mikhail Ivanovich VOEVODA2, Radion Valerievich TARNOVSKI1
Novosibirsk State Medical University 630091, Novosibirsk, Krasnyi av., 52
2Institute for Internal Medicine SB RAMS 630089, Novosibirsk, B. Bogatkov st., 175/1
99 patients, which were diagnosed with non-Hodgkin’s lymphomas for the first time, have been examined. It has been shown that a wild type of the chemokine receptor gene CCRЗ is associated with higher dissemination of tumor cells to lymphatic tissues, as lymphatic nodes and spleen, and with more frequent involvement of bone marrow. It has been shown that reduction of level of the active receptor CCR5 on surfaces of tumor and stromal cells in patients with non-Hodgkin’s lymphomas with deletion of gene CCRЗ, and, therefore, with their smaller response to proinflammatory chemokines, can be the favorable factor limiting distribution of lymphomas.
Key words: non-Hodgkins’s lymphomas, genetic polymorphism, CCR5.
Voropaeva E.N. — candidate of medical sciences, assistant of the chair for therapy, hematology and transfusiology, e-mail: [email protected]
Skvortsova N.V. — candidate of medical sciences, assistant professor of the chair for therapy, hematology and transfusiology, e-mail: [email protected]
Voevoda M.I. — doctor of medical sciences, professor, director, e-mail: [email protected] Tarnovski R.V. — senior laboratory assistant of the chair for therapy, hematology and transfusiology, e-mail: [email protected]
