CC BY
24
Науменко Е.А.1, Закирова Е.Ю.2, Гурьянов И.Д.3, Глаголева И.С.4, Фахруллин Р.Ф.5 ©
1Кандидат биологических наук, Казанский (Приволжский) федеральный Университет, ВНИЛ Бионанотехнологии; кандидат биологических наук, Казанский (Приволжский) федеральный Университет, НИЛ Генные и клеточные технологии; 3кандидат биологических наук, Казанский (Приволжский) федеральный Университет, НИЛ Репрограммирование
соматических клеток; 4кандидат биологических наук, Казанский (Приволжский) федеральный Университет, НИЛ Комбинаторная химия и нейробиология;
5доктор биологических наук, доцент, Казанский (Приволжский) федеральный Университет,
ВНИЛ Бионанотехнологии.
КЛИНИЧЕСКИЙ ОПЫТ ПРИМЕНЕНИЯ АЛЛОГЕННЫХ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК НА КОМПОЗИТНОМ БИОПОЛИМЕРНОМ НОСИТЕЛЕ ДЛЯ ЗАКРЫТИЯ КОЖНОГО ДЕФЕКТА У СОБАКИ
Аннотация
В работе представлен клинический опыт применения аллогенных мезенхимальных стволовых клеток для закрытия кожного дефекта в ветеринарной практике. Целью данной работы явилась оценка эффективности сочетания биоразлагаемого гидрогеля и стволовых клеток при лечении кожного дефекта у собаки. Полученные данные позволяют рекомендовать применение мезенхимальных стволовых клеток на полимерном биоразлагаемом носителе в ветеринарной практике.
Ключевые слова: гидрогель, мезенхимальные стволовые клетки.
ВВЕДЕНИЕ
В клинической практике дефекты кожи, вызванные ожогами, хроническими язвами или травмами, являются широко распространённой проблемой. Применение аутологичных и аллогенных имплантов является традиционным терапевтическим подходом к лечению таких дефектов, однако он ограничен в клинической практике в связи с проблемами связанными с сохранением ограниченного участка здоровой ткани, например, при обширных ожогах, а также нанесения дополнительных повреждений при взятии аутотрансплантата. В настоящее время в области тканевой инженерии кожи наметилась тенденция к прогрессу в формировании эпидермальных, дермальных и цельнокожных эквивалентов как неограниченного источника кожных имплантов для пациентов с кожными дефектами.
Последние исследования стволовых клеток, в частности, эпидермальных, дермальных стволовых клеток и мезенхимальных стволовых клеток (МСК) из костного мозга, предлагают технологию восстановления кожи [ 1, 409].
Источником мезенхимальных стволовых клеток с множеством путей дифференцировки может также служить жировая ткань, которая может быть получена малоинвазивным способом липосакции.
Однако для успешной регенерации дефектов мягких тканей необходимо применение биосовместимых и биоразлагаемых матриксов, способствующих пролиферации и дифференцировке стволовых клеток. Наиболее многообещающим материалом для тканевой инженерии кожи является коллаген, в связи с его высокой биосовместимостью, деградабельностью и слабыми антигенными свойствами. Кроме того, среди всех белковых биополимеров, коллаген является наиболее распространённым в живой природе. Желатин является производным коллагена, при этом, имея все преимущества исходного соединения приобретает низкую иммуногенность. Кроме того желатин содержит аминокислотную последовательность, которая является сигнальной в отношении клеточной адгезии и
© Науменко Е.А., Закирова Е.Ю., Гурьянов И.Д., Глаголева И.С., Фахруллин Р.Ф., 2016 г.
пролиферации. Данный биополимер также успешно применяется для получения композитов, используемых в тканевой инженерии [2, 141; 3, 523].
Другой полимер - хитозан - также является широко распространённым биополимером полисахаридной природы, получаемым из хитина путём деацетилирования. Его свойство формировать гидрогели, а также биоразлагаемость и биосовместимость, ранозаживляющие, гемостатические, антимикробные и иммуностимулирующие свойства делают хитозан перспективным материалом для биомедицинских приложений [4, 255].
Наше исследование направлено на оценку эффективности применения биополимерного композитного носителя на основе хитозана и желатина в сочетании с аллотрансплантацией мезенхимальных стволовых клеток для лечения животных с дефектами кожных покровов.
Материалы и методы
Животное
Беспородный щенок в возрасте 2 мес, весом 1кг был доставлен на осмотр в ветеринарную клинику по поводу незаживающих скарифицированных ран на дорзальной поверхности передних лап. Травма была получена 10 дней назад в результате попадания щенка под капот автомобиля с работающим двигателем.
Приготовление гидрогелевого биополимерного носителя
Низкомолекулярный хитозан, желатин и агароза были получены из фирмы Sigma-Aldrich, США. Смесь полимеров (1% хитозана, 1% желатина, 2 % агарозы) была помещена в 1% уксусную кислоту и подверглась нагреванию до 80 0С при перемешивании на магнитной мешалке в течении 2 ч. Далее горячий раствор был помещён в чашку Петри слоем 2 мм и оставлен для застывания при комнатной температуре. Для приведения значения рН к необходимому для клеток значению (рН 7,4), полученный носитель был залит средой ДМЕМ и помещён на 24 ч в атмосферу с содержанием 5 % СО2 и влажностью 95 % при 37 °С.
Выделение мезенхимальных стволовых клеток
Аллогенные МСК были выделены из подкожной жировой клетчатки взрослой собаки. Забор жировой ткани проводился в стерильных условиях ветеринарной операционной. Образец был помещен в стерильный контейнер с физиологическим раствором и в течение 4 часов доставлен в лабораторию. Адипогенные МСК выделяли, культивировали и дифференцировали по описанной ранее методике [5, 82].
Клетки на третьем пассаже (1х106 клеток) были покрашены мембранным витальным красителем Dil (Sigma-Aldrich, США) и помещены на поверхность гидрогеля; через сутки гидрогелевая плёнка с адгезированными клетками была использована для терапии. Для исследований in vitro ядра были докрашены Hoechst 33342.
Результаты и обсуждение
Полученные МСК из жировой ткани проявляли способность к дифференцировке в костном и хрящевом направлении, что было использовано нами для подтверждения их принадлежности к МСК (Рис. 1).
Q \ ". *
Рис. 1. Дифференцировка МСК из жировой ткани собаки. А - контроль, Б -хондрогенная дифференцировка, В - остеогенная дифференцировка.
Через сутки после внесения суспензии МСК к гидрогелю клетки полностью адгезировались на носителе (рис.2).
Рис. 2. Адипогенные МСК собаки на гидрогелевом носителе. Клетки окрашены Dil, ядра дополнительно окрашены Hoechst 33342.
Status localis: Патологические очаги расположены на дорсальной поверхности передних конечностей. Повреждение кожных покровов наступило в результате механического воздействия работающих частей двигателя автомобиля. Рана, подвергнутая далее лечению, имела следующие размеры: длина 4 см, ширина 2-3 см. Повреждены все слои кожи, либо кожный покров отсутствует. Отмечается наличие некротических масс; подкожные слои раны гиперемированы, отёчны (Рис.3).
Рис. 3. Состояние ран при поступлении собаки в клинику. А, Б: рана на передней правой лапе, до наложения носителя. С - частично ушитая рана на передней левой лапе, оставленная заживать без наложения носителя.
Нами был предложен метод восстановления дефекта кожного покрова с помощью биоразлагаемого полимерного носителя с адгезированными на его поверхности аллогенными МСК адипогенного происхождения (рис.4). Процедура проходила в условиях ветеринарной операционной под общим наркозом, применяемым в ветеринарной клинике ВетБарс г. Зеленодольска, (Татарстан, РФ). Предварительно рана была очищена от некротических масс и обработана антисептиком. Затем на раневую поверхность был нанесен носитель с МСК, который зафиксировали влагонепроницаемой повязкой. Рану второй лапы также очистили и
обработали антисептиком и наложили повязку с мазью левомеколь. Была проведена антибиотикотерапия согласно протоколу, принятому в данной клинике.
Рис. 4. Наложение носителя с МСК на рану (А) и вид раны на 4 сут после наложения
носителя с МСК.
В течение первых суток после наложения повязки и на протяжении всего периода наблюдения за животным не было установлено каких-либо негативных влияний проведённой процедуры на здоровье собаки. На 4 день в стерильных условиях повязку открыли. Следует отметить, что за истекший период гидрогель подвергся частичному биоразложению за счёт действия ферментов биологических тканей. Рана была очищена от остатков носителя, промытас последующим наложением новой асептической повязки. Микроскопия остатков ном=сителя не выявила присутствия МСК, таким образом был сделан вывод о том, что клетки мигрировали в рану. Через 2 дня повязку сняли; рану оставили заживать открытым способом, для предотвращения пересыхания на раневую поверхность наносили мазь левомеколь. В течение следующего месяца за собакой велось динамическое наблюдение. На рис. 4Б видно, что идет активный процесс заживления раны по вторичному натяжению. Наблюдается активный рост грануляционной ткани. Площадь раневой поверхности уменьшилась в 2 раза, поврежденные такни гиперемированы. На заживленной части раны отмечается отсутствие отека и рост волосяного покрова.
Через 2 недели после начала лечения раневые поверхности на лапах сравнялись по площади, т.е. можно сделать вывод, что регенеративные процессы в ране, обработанной гидрогелевой аппликацией с МСК шли более интенсивно, чем в контрольной ране. На рис. 5 можно наблюдать процесс активной эпителизации тканей, раневой дефект практически полностью закрылся (рис.5 А). Через месяц после начала лечения раны полностью закрылись без образования келоидных рубцов и иных осложнений, кроме того на месте ран наблюдался активный рост волосяного покрова (рис.5Б).
Рис. 5. Состояние ран через 2 недели (А) и через месяц (Б) после начала лечения.
Таким образом, описанный нами клинический случай позволяет сделать вывод, что применение аллогенных МСК адипогенного происхождения, в сочетании с биоразлагаемым гидрогелем из хитозана, желатина и агарозы в качестве носителя в ветеринарной практике для закрытия дефектов кожи стимулирует регенеративные процессы и не имеет побочных эффектов.
БЛАГОДАРНОСТИ
Работа выполнена за счет средств субсидии, выделенной в рамках государственной поддержки Казанского (Приволжского) федерального университета в целях повышения его конкурентоспособности среди ведущих мировых научно-образовательных центров. Работа поддержана грантом РФФИ 14-04-32330 мол_а. Авторы выражают благодарность врачу клиники ВетБарс Потапову М. А. за оказанное содействие в проведении экспериментов.
Литература
1. L.E. Richardson, J. Dudhia, P.D. Clegg, R. Smith - Stem cells in veterinary medicine - attempts at regenerating equine tendon after injury. - TRENDS in Biotechnology. - 2007. - Vol.25 No.9. - 409416.
2. T.W. Wang, H.C. Wu, Y.C. Huang, J.S. Sun, F.H. Lin, Biomimetic bilayered gelatin-chondroitin 6 sulfate-hyaluronic acid biopolymer as a scaffold for skin equivalent tissue engineering. - Artificial Organs - 2006. - 30 (3). - 141-149.
3. T.W. Wang, Y.C. Huang, J.S. Sun, F.H. Lin. - Organotypic keratinocyte fibroblast cocultures on a bilayer gelatin scaffold as a model of skin equivalent. - Biomedical Sciences Instrumentation. - 2003. -39. - 523-528.
4. H. Nagahama, H. Maeda, T. Kashiki, R. Jayakumar, T. Furuike, H. Tamura. - Preparation and characterization of novel chitosan/gelatin membranes using chitosan hydrogel. - Carbohydrate Polymers. - 2009. - Vol.76, 2. - 255-260.
5. Катина М. Н., Гайфуллина Р. Ф., Хаятова З. Г., Эмене Ч. Ч., Ризванов А. А. - Выделение, культивирование и дифференцировка мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток из жировой ткани крыс RATTUS NORVEGICUS и хомяков MESOCRICETUS AURATUS. - 2012. -Гены и клетки. - №3. - 82-87.
