CC BY
50
2013
ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
Сер. 11
Вып. 4
ПЕДИАТРИЯ
УДК 616-08-039.73
М. В. Эрман, О. В. Рыбальченко, О. Г. Орлова, Т. М. Первунина, Л. В. Кирюхина
КЛИНИЧЕСКИЙ ЭФФЕКТ АНТИМИКРОБНОЙ ТЕРАПИИ МОЧЕВОЙ ИНФЕКЦИИ У ДЕТЕЙ
Инфекционный процесс мочевой системы (ИПМС) является одной из наиболее распространенных патологий детского возраста и занимает по частоте второе место после заболеваний респираторного тракта. Показатель ИПМС у детей Санкт-Петербурга в 2010 г. составил 7,1 на 1000 детей [1]. Аналогичные цифры заболеваемости приводит Р. Н. Соп№ауе1а1 — 8,1 на 1000 детей [2]. В последние десятилетия отмечают неуклонный рост ИПМС у детей, причем среднегодовой темп прироста составляет 6,1% [3]. Наиболее значительный рост ИПМС отмечается у детей первого года жизни — за последние 5 лет он увеличился на 23% [4]. При проведении независимой экспертизы качества медицинской помощи при острых инфекциях моче-выводящих путей в поликлиниках Санкт-Петербурга в 92% случаев ведение пациентов было признано ненадлежащим [5, 6]. Анализ качества лечения инфекции мочевой системы у 780 детей первого года жизни штата Вашингтон (США) (всего родились за изучаемый период 38985 детей) показал, что только у 51% пациентов была проведена адекватная антибактериальная терапия [7]. От 5 до 25% случаев ИПМС осложняются рубцовыми изменениями в почках [8]. Отмечена коррелятивная связь между назначением пролонгированной бесконтрольной антибактериальной терапии и развитием нефросклероза [9]. Однако раннее начало антибактериальной терапии (в первые семь дней дебюта заболевания) позволило уменьшить микробное
Эрман Михаил Владимирович — доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой педиатрии медицинского факультета, Санкт-Петербургский государственный университет, главный детский нефролог СПб; e-mail: [email protected]
Рыбальченко Оксана Владимировна — доктор биологических наук, профессор, руководитель курса микробиологии, вирусологии и иммунологии, Санкт-Петербургский государственный университет; e-mail: [email protected]
Орлова О. Г. — кандидат биологических наук, старший преподаватель, Санкт-Петербургский государственный университет; e-mail: [email protected]
Первунина Т. М. — кандидат медицинских наук, доцент, Санкт-Петербургский государственный университет; e-mail: [email protected]
Кирюхина Л. В. — кандидат медицинских наук, ассистент, Санкт-Петербургский государственный университет; e-mail: [email protected]
© М. В. Эрман, О. В. Рыбальченко, О. Г. Орлова, Т. М. Первунина, Л. В. Кирюхина, 2013
поражение интерстиция и предотвратить развитие нефросклероза: 21% — пациенты с рефлюкс-нефропатией, получавшие нерегулярную антибактериальную терапию, и только 1% — получавшие своевременную и адекватную терапию [10]. Показано, что даже сам по себе ИПМС может являться одним из факторов задержки роста почки [11]. В то же время назначение антимикробных препаратов в детском возрасте существенно отличается от проведения терапии взрослых пациентов. До достижения 15-летнего возраста не назначают фторхинолоны, активно используемые терапевтами [12]. Назначение некоторых этиотропных препаратов ограничено из-за развития у возбудителей заболеваний резистентности, например, к ко-тримоксозолу [13]. В Санкт-Петербурге разработан и внедрен в медицинскую практику «Формуляр антибактериальных препаратов для лечения осложненной и неосложненной инфекции мочевой системы у детей» [14]. Препаратами выбора являются полусинтетические ингибитор-защищенные аминопенициллины, цефалоспорины 11-го поколения, фурамаг и препарат из растительного сырья — канефрон. Рекомендации об использовании вышеперечисленных препаратов при лечении ИПМС приведены в ряде руководств [15-17].
Сложности в лечении ИПМС связаны еще и с тем, что при развитии инфекционного процесса бактериальные возбудители образуют так называемые биопленки на поверхности слизистых оболочек мочевыводящей системы [18].
Такие биопленки характеризуются большей плотностью популяции, высокой физиологической активностью составляющих ее особей и высокой колонизационной резистентностью по отношению к факторам иммунной защиты, неблагоприятным воздействиям и действию этиотропных препаратов [19, 20].
Цель исследования — изучение эффективности использования 2-х защищенных ингибиторами бета-лактамазэтиотропных препаратов: флемоклав солютаб и аугментин в терапии инфекции мочевой системы у детей.
Материалы и методы. В исследованиях использовали защищенные ингибиторами бета-лактамаз синтетические аминопенициллины: флемоклав солютаб и ауг-ментин. Флемоклав солютаб представляет собой препарат в инновационной лекарственной форме (амоксициллин / клавулановая кислота), аугментин является аналогом, также содержащим амоксициллин / клавулановую кислоту.
Защищенными клавулановой кислотой аминопенициллинами проведено лечение 50 детей с ИПМС, рандомизированных на две группы: 25 детей — флемоклав солютаб (1-я группа) и 25 детей — аугментин (2-я группа), находившихся на излечении в нефрологическом отделении ГУЗ детской городской больницы № 2 святой Марии Магдалины (университетская клиника СПбГУ). Возраст детей составлял от 4 месяцев до 17 лет, причем 13 детей были в возрасте до 1 года; средний возраст — 7,72±2,03 года. Среди пациентов преобладали девочки (соотношение девочек и мальчиков 4,5:1). В работе проводили разделение ИПМС на: неосложненную инфекцию мочевой системы (анатомически и функционально нормальный мочевой тракт) и осложненную инфекцию мочевой системы (анатомически и функционально измененный мочевой тракт — везико-ренальный рефлюкс; пороки развития; хронический цистит и др.) [21]. Неосложненная инфекция мочевой системы была у 9 детей, осложненная инфекция — у 41 ребенка.
Отбор детей в группы наблюдения осуществляли методом случайной выборки. Критерии назначения ингибитор-защищенных аминопенициллинов: верифициро-
ванная инфекция мочевой системы с клиническими и лабораторными показателями активности; отсутствие назначений полусинтетических защищенных пеницилли-нов в течение последнего года. Длительность лечения — 7 суток. Другие антибактериальные препараты-уросептики не назначали.
Всех больных подвергали тщательному клиническому и лабораторному обследованию перед началом и после окончания курса лечения. Оценивали: клиническую симптоматику, клинический анализ мочи в динамике (до назначения, на 4-й, 8-й и 15-й день после назначения); посев мочи в динамике (до назначения, 8-й день после назначения); клинический анализ крови. Выявление и оценку возможных нежелательных лекарственных реакций проводили по историям болезни и опросу матерей.
In vitro воздействие антимикробных препаратов на рост бактериальных биопленок изучали на примере грамотрицательных (Escherichia ooli 132) и грамположитель-ных (Staphylococcus aureus 234) микроорганизмов из коллекции штаммов, выделенных от пациентов с ИПМС. Электронно-микроскопическое исследование влияния антимикробных препаратов проводили на модели биопленок, разработанной при выращивании бактерий на мясо-пептонном агаре [22]. Ультраструктурные изменения в клетках и в архитектонике бактериальных биопленок, подвергнутых воздействию аугментина, исследовали двумя различными методами трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ): методом позитивного окрашивания 0,1%-ным водным раствором уранилацетата и методом ультратонких срезов. Препараты просматривали в трансмиссионном электронном микроскопе JEM 100C (JEOL, Япония) при ускоряющем напряжении 100 кВ [22, 23].
Статистическую обработку полученных результатов осуществляли на персональном компьютере Intel Pentium III и проводили с применением стандартных пакетов программ прикладного статистического анализа (Microsoft Excel, Statistica for Windows v.7.0). Проверку количественных признаков на нормальность распределения осуществляли с использованием критерия Шапиро—Уилка. Проверку гипотезы о равенстве дисперсий проводили с помощью критерия Левена. Сравнение количественных признаков, удовлетворяющих условиям нормального распределения и равенству дисперсий, проводили с помощью t-критерия Стьюдента. Для сравнения количественных признаков, не удовлетворяющих условиям нормального распределения или равенству дисперсий, использовали критерий Вилкоксона—Манна—Уит-ни. Сравнительный анализ качественных переменных проводили с помощью критерия Хи-квадрат и точного двустороннего критерия Фишера. Различия в показателях и исходах считали достоверными при значении p < 0,05.
Результаты. Бактериурия. До начала терапии 52% пациентов 1-й группы и 56% 2-й группы имели диагностически значимую бактериурию (>106КОЕ в 1 мл мочи), полученные результаты соответствовали данным исследований других авторов [15]. Микробный спектр при ИПМС, в основном, был представлен: Escherichia ooli — 61%, Staphylococcus aureus — 15%, Enterococcus — 12%, Klebsiella pneumoniae — 8%, Morganella morganii — 4%. При высевах клинического материала часто обнаруживали бактериальную микст инфекцию.
Отчетливое клиническое улучшение течения мочевой инфекции в ходе терапии ингибитор-защищенными пенициллинами обеих групп отмечено у всех пациентов. К 3-им суткам нормализовалась температура у всех 8-ми пациентов, которые имели
гипертермию выше 37,8°С до начала терапии. После завершения терапии (8-е сут) ни у одного пациента не было жалоб и экстраренальных симптомов. Мочевой синдром до лечения был представлен: лейкоцитурией различной степени у всех пациентов; протеинурией от следовой до 0,7 г/л (1 группа — 48%; 2 группа — 40%); диагностически значимой бактериурией (1 группа — 52%; 2 группа — 56%).
Лейкоцитурия. Через 3 дня анализы нормализовались у 7 детей 1-й группы и 10 детей 2-й группы (p < 0,01). На 8-й день анализ мочи нормализовался у 17 детей 1-й группы; у 3 больных количество лейкоцитов в поле зрения не превышало 20, а у 5 — 10 лейкоцитов (p < 0,001). У всех детей, получавших аугментин, лейкоцитурия к 8-му дню не определялась (p < 0,001). После завершения терапии эффект лечения не только сохранялся, но и проявлялся в виде дальнейшего затихания воспалительных изменений. Через неделю после отмены флемоклав солютаба нормальный анализ мочи имели уже 23 пациента (92%), а у 2-х детей отмечали только микролей-коцитурию — 7-10 лейкоцитов в поле зрения (p < 0,0001). После отмены аугментина нормальный анализ мочи сохранялся у всех пациентов (p < 0,0001).
Протеинурия. При исследовании мочи перед началом терапии протеинурию различной степени выявляли у 22-х детей 1-й группы (следовую — у 10 и различной степени — у 12 (0,112±0,044 г/л)) и у 20-ти детей 2-й группы (следовую — у 9 и различной степени — у 11 (0,121±0,039 г/л)). Через 4 дня в 1-й группе протеинурию определяли у 15 детей: следовую — у 5 и различной степени — у 10 (0,049±0,021 г/л), а 40% порций мочи были свободными от белка. Во 2-й группе протеинурия сохранялась у 11 детей: следовая — у 6-ти и различной степени — у 5-ти (0,054±0,018 г/л), а 56% порций мочи были свободными от белка (p < 0,01). По завершении терапии протеинурия выявлена у 10 детей 1-й группы (следовая — 9 и у 1 пациента — 0,066 г/л) и 5 детей 2-й группы (следовая — 4 и у 1 пациента — 0,099 г/л). Протеинурия при неосложненной инфекции может иметь экстраренальный характер, а при осложненной инфекции обусловлена тубулярными нарушениями. При дальнейшем про-грессировании заболевания протеинурию связывают с развитием фокально-сегментарного гломерулосклероза. В указанном выше наблюдении характер протеинурии имел экстраренальный и тубулярный характер.
Бактериурия. Все контрольные посевы мочи пациентов, имевших бактериурию до назначения препарата, после завершения лечения флемоклав солютабом и ауг-ментином либо не содержали бактерий, либо имели их в титре значительно ниже диагностического (p < 0,001).
Полученные результаты определили интерес к проведению электронно-микроскопического исследования антимикробного воздействия аугментина на бактериальные биопленки, образованные клетками клинических уропатогенных штаммов Escherichia coli 132 и Staphylococcus aureus 234.
Подавление биопленкообразования грамотрицательных бактерий клинического штамма E. coli 132. Действие аугментина на биопленки, сформированные клетками E. oi, сопровождалось выраженными деструктивными изменениями практически всех клеток исследуемых микробных популяций (рис. 1). Ультраструктурные нарушения, вызванные воздействием аугментина, достаточно четко различимы при сравнении с интактными биопленками кишечной палочки (рис. 2). На электронограммах биопленок после обработки аугментином выявлен практически полный лизис всех клеток кишечных палочек, а также образующиеся в результате
этого воздействия фрагменты цитоплазматических мембран и клеточных стенок с агрегатами белково-рибосомального комплекса. Необходимо подчеркнуть, что при полной деструкции клеток в биопленках целостность поверхностных пленок на них сохранялась неизменной (рис. 1).
Рис. 1. ТЕМ. Ультратонкий срез биопленки E. coli 132 при воздействии аугментина.
Стрелками указаны агрегаты деструктурированного матрикса, лизированные клетки и поверхностная пленка. Ув. х 10000.
Рис. 2. ТЕМ. Ультратонкий срез интактной биопленки E. coli 132, контроль.
Стрелками указана поверхностная пленка. Ув. х 80000.
Подавление биопленкообразования грамположительных бактерий клинического штамма S. aureus 234. Архитектоника и характер деструктивных изменений в биопленках, образованных клетками стафилококков в присутствии аугментина, были практически идентичны таковой кишечных палочек, выращенных в аналогичных условиях (рис. 3).
Однако ультраструктурные изменения в клетках грамположительных стафилококков, вследствие особенности строения их клеточных стенок, отличались от де-
структивных нарушений в грамотрицательных клетках эшерихий. При сравнении на ультратонком уровне с интактными биопленками S. aureus (рис. 4) видно, что в толще биопленок, обработанных аугментином, лизированные клетки стафилококков представлены в виде электронно-плотных фрагментов пептидогликановых слоев клеточных стенок и ламеллярно-везикулярных включений цитоплазматических мембран различной конфигурации.
Рис. 3. ТЕМ. Ультратонкий срез биопленки S. aureus 234 при воздействии аугментина.
Стрелками указаны электронно-плотные фрагменты пептидогликановых слоев клеточных стенок, мембран и поверхностная пленка. Ув. х 10000.
На ультратонких срезах интактных биопленок S. aureus видны целые клетки без каких-либо деструктивных изменений (рис. 4).
Рис. 4. ТЕМ. Ультратонкий срез интактной биопленки S. aureus 234, контроль.
Стрелками указана поверхностная пленка. Ув. х 40000.
Таким образом, сравнительный электронно-микроскопический анализ интакт-ных и подвергнутых воздействию аугментина биопленок E. coli 132 и S. aureus 234 выявил значительные деструктивные изменения в клетках как грамотрицательных, так и грамположительных бактерий при действии ингибитор-защищенного аминопени-циллина.
Обсуждение. Исследования последних лет подтверждают доминирование кишечной палочки при инфекции мочевыводящей системы у пациентов как в Санкт-Петербурге, так и в различных регионах РФ [24]. По официальным данным, уропа-тогенные E. coli вызывают 80-90% внебольничных и 26% нозокомиальных поражений. Особенно часто они вызывают заболевания у детей (более 90% случаев).
Уропатогенные кишечные палочки характеризуются пониженной ферментацией некоторых сахаров (лактозонегативностью), особым свойством связывать конго-красный, наличием большого числа факторов патогенности, узким спектром ко-лициночувствительности, полиантибиотикорезистентностью, объясняемой, в том числе, и повышенной способностью к биопленкообразованию [25].
Серьезной проблемой клинической практики является широкое распространение устойчивых форм микроорганизмов, снижающее эффективность применения антибактериальных препаратов. В связи с этим особое внимание исследователей привлечено к изучению феномена биопленкообразования. Защитные структуры биопленок делают клетки бактерий в ее составе устойчивыми не только при атаке эффекторов иммунной системы, но и увеличивают резистентность микроорганизмов к антимикробным препаратам. Бактерии в составе биопленок способны выживать при воздействии антимикробных препаратов в таких высоких концентрациях, которые не могут быть достигнуты в организме человека при стандартных терапевтических дозировках [19]. Еще одна негативная характеристика биопленок заключается в их способности к полирезистентности к антимикробным препаратам разных групп [26]. В клинических условиях столь высокая выживаемость микроорганизмов в составе биопленок может привести к хронизации инфекционного процесса [27].
В связи с этим возникает необходимость в разработке новых подходов в исследовании антибиотикорезистентности микробных популяций в составе биопленок.
Выраженный клинический эффект терапии инфекционного процесса моче-выводящих путей синтетическими пенициллинами указывает на то, что подавляющее большинство выделенных возбудителей проявляли чувствительность к применяемым препаратам. При электронно-микроскопическом исследовании биопленок E. coli 132 и S. aureus 234 были выявлены выраженные деструктивные изменения в клетках обеих культур при воздействии стандартных доз аугментина. Характер разрушения клеток E. coli 132 и S. aureus 234 в биопленках при воздействии аугмен-тина существенно отличался от автолитических изменений в этих же клетках в ходе естественного отмирания, наблюдаемого в конце стационарной фазы роста планктонных культур. На данной стадии развития популяции значительная часть клеток, как правило, еще способна сохранять интактную форму, а гибель единичных особей происходит в результате фокальной деструкции клеточных стенок, при этом можно наблюдать целостность «клеточных теней». В случае воздействия аугментина на клетки стафилококков целостность клеточных стенок нарушается одновременно в нескольких местах и на ультратонких срезах видны лишь фрагменты клеточных стенок.
Результаты электронно-микроскопического анализа объясняют столь высокую эффективность результатов клинических исследований, полученных при использовании защищенных ингибиторами бета-лактамаз синтетических аминопеницил-линов, что подтверждает целесообразность их назначения при терапии инфекции мочевой системы у детей.
Работа поддержана грантом СПбГУ № 0.37.123.2011.
Литература
1. Эрман М. В. Инфекция мочевой системы // Детская медицина Северо-Запада. 2011. T. 2, № 1. С. 61-68.
2. Conway P. H., Cnaan A., Zaoutis T. et al. Recurrent urinary tract infections in children: Risk factors and association with prophylactic antimicrobials // JAMA. 2007. Vol. 298(2). Р. 179-186.
3. Лукьянов А. В. Инфекции мочевой системы у детей (этиология, механизмы развития, диспансеризация): автореф. дис. ... д-ра мед. наук. Омск, 2005. 45 с.
4. Письмо МЗ и СР РФ от 26 января 2007 года № 567-ВС «Об организации медицинской помощи детям с инфекцией мочевыводящих путей».
5. Замятин С. А. Амбулаторная помощь больным с инфекцией мочевой системы // Медицина Петербурга. 2009. № 39. С. 289.
6. Захарова И. Н. Инфекции мочевой системы у детей: современные представления об этиологии // Нефрология и диализ. 2001. Т. 5, № 1. С. 20-24.
7. Brians S., Alper M. D., Sarah H., Curry M. D. Urinary tract infections in children // Am. Fam. Physician. 2005. Vol. 72. Р. 2483-2488.
8. Deshpande P. V., Verrier J. K. An audit of RCP guidelines on DMSA scanning after urinary tract infection // Arch. Dis. Child. 2001. Vol. 84. Р. 324-327.
9. Montini G., Tullus K., Hewitt I. K. Febrile Urinary tract infections in children // N. Engl. J. Med. 2011. Vol. 365. P. 239-250.
10. Goldraich N., Barrat T. Vesicoureteral reflux and renal scarring // Ped. Nephrology. 2-ed / ed. by M. Holliday. Baltimore. 1987. P. 647-668.
11. Эрман М. В. Лечение инфекции мочевой системы у детей (клиническая лекция) // Клиническая нефрология. 2011. № 3. С. 16-19.
12. Колбин А. С., Шабалов Н. П., Карпов О. И. Эффективность и безопасность использования фторхинолонов в педиатрии // Педиатрия. 2005. № 5. С. 70-74.
13. Страчунский Л. С., Шевелев А. Н. Антибактериальная терапия инфекций мочевыводящих путей у детей // Детский доктор. 2001. № 8. С. 12-13.
14. Эрман М. В. Нефрология детского возраста. СПб.: СпецЛит, 2010. 683 с.
15. Steven L., Chang M. D., Linda D., Shortliffe M. D. T. Pediatric urinary tract infections // Pediatr. Clin. N. Am. 2006. N 53. Р. 379-400.
16. Urinary tract infection in children: diagnosis, treatment and long-term management. National Collaborating Centre for Women's and Children's Health // Clinical Guideline. London. 2007. 178 р.
17. WHO Model Formular for Children. World Health Organization. 2010. URL: http://www.who.int/ childgrowth/standards/weigh't_for_age/en/index.html.
18. Бондаренко В. М. Факторы патогенности бактерий и их роль в развитии инфекционного процесса // Микробиол. 1999. № 5. С. 34-39.
19. Donlan R. M., Costerton J. W. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms // Clin. Microbiol. Rev. 2002. № 15. С. 93-167.
20. Бондаренко В. М. Роль условно-патогенных бактерий при хронических воспалительных процессах различной локализации. Тверь: ООО «Изд-во «Триада», 2011. 88 с.
21. Лопаткин Н. А., Деревянко И. И. Неосложненные и осложненные инфекции мочеполовых путей. Принципы антибактериальной терапии // Рус. мед. журн. 1997. Т. 24. С. 1579-1589.
22. Рыбальченко О. В., Бондаренко В. М., Гуслева О. Р. и др. Дезорганизация биопленок клинических штаммов стафилококков метаболитами лактобацилл // Журн. микробиол. 2010. № 6. С. 66-70.
23. Рыбальченко О. В., Бондаренко В. М., Добрица В. П. Атлас ультраструктуры микробиоты кишечника человека. СПб.: Изд. ИИЦ ВМА, 2008. 112 с.
24. Цыгин А. Н., Комарова О. В., Сергеева Т. В. и др. Инфекция мочевыводящих путей // Клинические рекомендации. Педиатрия / под ред. А. А. Баранова. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2005. С. 81-96.
25. Честнова Т. В., Серегина Н. В. Особенности существования бактерий в составе биопленок на примере уропатогенных кишечных палочек // Вестник новых медицинских технологий. 2010. Т. XVII, № 4. С. 28-30.
26. Weigel L. M., Donlan R. M., Shin D. H. High-level vancomycin-resistant Staphylococcus aureus isolates associated with a polymicrobial biofilms // Antimicrob. Agents. Chemother. 2007. № 51. Р. 231-238.
27. Чеботарь И. В., Маянский А. Н., Кончакова Е. Д. и др. Антибиотикорезистентность биопленочных бактерий // Клин. микробиол. антимикроб. химиотер. 2012. Т. 14, № 1. С. 51-59.
Статья поступила в редакцию 15 августа 2013 г.
