Клиническая протеомика: новые диагностические возможности масс-спектрометрии Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ISSN 0868-5886

НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2008, том 18, № 4, c. 16-23

. МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ ДЛЯ БИОТЕХНОЛОГИИ. ИНТЕРПРЕТАЦИЯ ДАННЫХ, МЕТОДОЛОГИЯ, ПРИМЕНЕНИЕ

УДК[577.1: 613.6]:: [615.9: 543.632: 585]

© А. В. Манойлов, И. Ю. Торопыгин, Ю. П. Козьмин, Н. В. Краснов, Н. Л. Самус, А. В. Новиков, Р. А. Бубляев, О. А. Миргородская

КЛИНИЧЕСКАЯ ПРОТЕОМИКА: НОВЫЕ ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ВОЗМОЖНОСТИ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ

Разработан масс-спектрометрический метод идентификации сывороточного амилоида А (САА) — характерного маркера для диагностика рака яичника. Его определение осуществлено непосредственно в сыворотке крови человека без предварительного фракционирования с использованием регулируемого трипсинолиза. Разработаны подходы к количественному определению содержания этого белка в сыворотке крови по содержанию триптического фрагмента (68-87) САА, присутствующего в гидролизатах. Разработан масс-спектрометрический метод определения а2-макроглобулина (а2-М) в сыворотке и плазме крови человека. С использованием разработанного метода проанализировано содержание а2-М в сыворотке крови при раке яичника и плазме крови при болезни Альцгеймера. Показано, что концентрация а2-М существенно возрастает при раке яичника и уменьшается при болезни Альцгеймера.

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время масс-спектрометрия находит все более широкое использование в медицине. Благодаря масс-спектрометрии возникло новое направление исследований в медицине — клиническая протеомика, которая занимается инвентаризацией белков человека, кодируемых его генами, и таким образом дополняет геномные исследования. При всей индивидуальности геномных карт именно состав белков определяет функциональное назначение каждой клетки, а также отражает реализацию возможностей проявления имеющихся наследственных или приобретенных генетических дефектов.

В качестве особого раздела клинической протео-мики следует выделить выявление изменений компонентного состава белков при возникновении онкологических, сердечно-сосудистых, неврологических и других заболеваний. Как правило, именно изменение концентрации отдельных белков указывает на появление патологии и может быть использовано в диагностических целях. В связи с этим интенсивно развиваются подходы, которые позволяют наряду с идентификацией осуществлять количественное определение белка с использованием масс-спектрометрии [1-5].

В основе большинства известных масс-спектрометрических методов количественного определения белков лежат два процесса:

• гидролиз белков с использованием специфических ферментов, главным образом трипсина;

• добавление стандарта и масс-спектрометрический анализ.

В качестве стандартов используются аналогичные триптические фрагменты, но отличающиеся по молекулярной массе за счет содержания в них стабильных изотопов. Из интенсивностей изотопного распределения смеси анализируемого вещества и стандарта вычисляется количественное соотношение, на основании которого может быть оценено относительное содержание белка или его абсолютное значение, если концентрация стандарта известна. Таким образом, возможность использования масс-спектрометрии для количественных измерений обусловлена доступностью индивидуальных стандартов для каждого анализируемого соединения.

В настоящей работе использована предложенная ранее [6] универсальная технология получения стандартов, основанная на изотопном обмене 16О на 18О в карбоксильных группах пептидов и белков. Эта технология позволяет получать стандарты, не меняя химической структуры, не только из любых индивидуальных карбоксилсодержащих соединений, но и их смесей. Источником таких смесей могут служить, например, триптические гидролизаты белков. С использованием этого подхода проведено измерение относительного содержания сывороточного амилоида А (САА) — характерного маркера онкологических заболеваний для сыворотки крови больных раком яичников.

Также в работе проведено измерение относительного содержания в сыворотке или плазме крови трех функциональных белков: двух основных ингибиторов — а1-антитрипсин (а1-ИП) и а2-макроглобулин (а2-М), а также плазминогена (Пг) — одного из основных компонентов фибри-нолитической системы крови. Отметим, что со-

держание этих белков изменяется при возникновении патологических состояний и может быть использовано в диагностических целях.

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТА И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Традиционно при выборе сывороток или плазмы крови в качестве источника для масс-спек-трометрического анализа отдельных белков осуществляется предварительное фракционирование. Это обусловлено тем обстоятельством, что изменяемая часть белков составляет существенно меньшую часть на фоне высоких концентраций отдельных белков в биологической пробе. Так, например, в плазме или сыворотке крови — материалах, наиболее часто используемых для анализа, — около 90 % белкового состава приходится на альбумин, и поэтому без предварительного фракционирования и полном трипсинолизе сложно выявить появление или убыль каких-либо белков на таком фоне [7].

В настоящей работе в отличие от традиционной пробоподготовки предлагается использовать регулируемый трипсинолиз белков сыворотки

крови для последующего масс-спектрометриче-ского анализа.

Для эксперимента использовались три образца сыворотки: 417 — здоровой пациентки и 411, 431 — двух пациенток с раком яичника. К образцам сывороток добавляли раствор трипсина из расчета, чтобы его молярная концентрация была ниже концентрации а1-ИП и несколько выше, чем а2-М. Через 1.5 ч реакцию останавливали добавлением трифторуксусной кислоты (ТФУ). Пробы анализировали с использованием МЛЬБ1-М8. Результаты масс-спектрометрической детекции представлены на рис. 1.

Анализируя полученные данные по трипсино-лизу в выбранных условиях, прежде всего следует отметить следующее:

• гидролизаты всех сывороток не содержат триптических фрагментов, альбумина;

• количество триптических фрагментов существенно больше в сыворотке больных по сравнению со здоровой, и их интенсивности существенно выше "фона";

• в раковой сыворотке присутствует ряд новых продуктов, представленных в масс-спектре интенсивными ионами.

J^UI^Owuiii mlj иД i

ilibi Ы.

яЗ ; 5

Ч г- Л

! Я

[ L

? S

Л I

ию

lili

íii s

£ в

м- 1

Рис. 1. Масс-спектры сыворотки в норме (а), раковой сыворотки 411 (б) и 431 (в) через 2 ч 15 мин трипси-нолиза при 37 оС. (Аппаратные надписи на спектрограммах продублированы для разборчивости)

а

б

в

о

Рис. 2. Аминокислотная последовательность белков САА и регистрируемые в них масс-спектрометрически триптические пептиды

Рис. 3. Масс-спектры сывороток онкологических больных (п2- п4) после ограниченного протеолиза и в смеси с сывороткой п1, выбранной в качестве стандарта

По результатам поиска в МАСКОТ в образцах раковых сывороток 411 и 431 был с высокой достоверностью идентифицирован белок САА (score составлял 117 и 143, а перекрывание аминокислотной последовательности составляло 77 и 83 % соответственно). Пики, соответствующие трипти-ческим пептидам САА, отмечены на рис. 1 звездочками. Аминокислотная последовательность

белка САА и зарегистрированные пептиды представлены на рис. 2.

Таким образом, обнаружена способность трипсина в комплексе с а2-М селективно гидролизовать САА, что позволяет использовать ограниченный трипсинолиз в сочетании с масс-спектрометрией для выявления этого белка в сыворотке крови.

Фрагмент САА (91-104) m = 1640.81

Фрагмент САА (88-104) m = 1912.97

Фрагмент САА (68-87) m =2177.91

хЮ4-

2-

4000-

200Q-

э хЮ4

J2.

vi 1.0

С

.Sä с 05

х104

2

xIO4

2 1 0

_ullUljüL^_

—I-Г--1—

Í&ÍC iS<íS 165s? m/z

х10л

Iii A A.

8

all в lllllu.

г LIUáaj^_

Д úlilkb_

<104 4-

кЮ4 1.0

0.5

kIO4

1.5 1.0 0.5

xIO4

xIO4

m/z

Jk

□

JLAaaAJIÍIÍ^

m/z

Рис. 4. Фрагменты масс-спектров сыворотки 411 после (А) и до (Б) изотопного обмена, смесей стандарта и раковых сывороток, смешанных в соотношении 5:1: 303 (В), 349 (Г) и 400 (Д)

Определение относительных концентраций САА в раковых сыворотках

Идентификация САА в крови пациентов всегда указывает на наличие патологии, причем тем более серьезной, чем выше концентрация этого белка. В связи с этим представляло интерес масс-спектро-метрически не только обнаружить этот белок, но и определить его концентрацию. Для этого достаточно определить концентрацию одного триптиче-ского фрагмента САА, поскольку она соответствует содержанию исходного белка. Стандарты для определения САА получены из триптического гидролизата раковой сыворотки 411. Для этого гидролизат высушен и перерастворен в среде, подходящей для изотопного обмена. Полученный из гидролизата сыворотки 411 стандарт смешали с другими триптическими гидролизатами сывороток 303, 439 и 400 (соответствуют n2, n3, n4 на рис. 3)

и провели масс-спектрометрическим анализ этих смесей. Масс-спектры таких смесей представлены на рис. 3.

Отметим, что во всех сыворотках присутствуют одинаковые триптические фрагменты. В данном случае сигналы каждого пептида достаточно широкие, поскольку в них смесь со стандартом, в результате чего имеет место более широкое распределение.

Для анализа сывороток использованы 3 пептида с m/z 1640.81, 1912.97 и 2177.91, аминокислотные последовательности которых представлены на рис. 2. На рис. 4 показаны фрагменты масс-спектров трех пептидов, выбранных для количественных расчетов в качестве стандартов сыворотки 411 (А), этих же пептидов до обмена и пептидов в смесях гидролизатов других сывороток 303, 349 и 400 (n2-4 на рис. 3).

Табл. 1. Относительная интенсивность пептидов в гидролизатах сывороток разных пациенток

n Serum Пептиды — фрагменты САА Относительная скорость гидролиза Соотношения концентраций САА/СААст in %

(91-104), m/z = = 1640.81 (88-104), m/z = = 1912.97 (68-87), m/z = = 2177.91 (91-104)/ (88-104) (68-87), m/z = 2177.91

1 411 (ст) — — — — 100

2 303 13 2 6 6.5 30

3 349 47 32 35 1.7 175

4 400 17 11 15 1.5 75

Рис. 5. Масс-спектры М-(тозил)-аргинина (ТА).

а — исходное вещество; б — стандарт ТА; в — смесь ТА с его стандартом

Рассчитанные относительные концентрации пептида (относительно стандарта) в сыворотках 303, 439 и 400 представлены в табл. 1.

Из этих пептидов только (68-87) CAA представляет собой продукт предельного гидролиза и может быть использован для количественных измерений САА. Два других — (88-104) CAA и (91104) CAA — не могут быть использованы для этих целей, поскольку первый из них представляет собой промежуточный продукт при получении второго. И их соотношение в гидролизатах зависит от времени трипсинолиза. Процесс гидролиза связи внутри пептида (88-104) CAA протекает существенно медленнее из-за его структурных особенностей. Вместе с тем из соотношения интенсивно-стей именно этих двух пептидов можно рассчитать относительные значения скоростей непосредственно трипсинолиза по убыли пептида (91-104) САА и по накоплению пептида (88-104) САА. Полученные значения представлены в табл. 1. Как следует из этих результатов, относительная ско-

рость, рассчитанная из соотношения концентраций пептидов (88-104) САА и (91-104) САА, — наибольшая; но близкая наблюдается для сывороток 349 и 400 и наименьшая — для 303. Поскольку гидролиз осуществляется в одинаковых условиях включая концентрацию вносимого трипсина, относительные скорости отражают относительное содержание в сыворотках а2-М, поскольку чем выше концентрацая а2-М, тем выше активность трипсина [7]. Таким образом, из полученных данных можно судить об относительном содержании а2-М, изменения концентрации которого, по данным литературы [8-11], также отражает наличие и степень патологии.

Количественное масс-спектрометрическое определение а2-М по индуцированной триптической активности в сыворотке и плазме крови

Определение содержания а2-М в плазме и сыворотке крови осуществлялось по сохранению

<я

CL IX

CD

X

о

12 10

0

N Пу <Ъ fc fc 'Ъ ^ ^ ^

гЛ . . гЛ -vv .vv .vv .vv .vv .vv

^ ^ ^ oSb J ^

А ^Ъ

^ ^ ^ ^ ^ ^^ууу

ч^Г Ч^Г ^

(У (У сг # # # #

^

^ ^ ^ ^

Рис. 6. Концентрации а2-М в сыворотках в норме, болезни Альцгеймера и при раке яичника (Альц 1-4, 2-4,..., 6-2 — идентификаторы проб)

8

6

4

2

активности трипсина после его введения в плазму в концентрациях, несколько меньших, чем возможное содержание а1-ИП. При этом трипсин прежде всего количественно связывается с а2-М с сохранением активности по отношению к метиловому эфиру К-тозил-аргинина (ТАМЕ). Остатки трипсина необратимо ингибируются а!-ИП. Определение трипсина в комплексе с а2-М осуществлялось с использованием ВЭЖХ и масс-спектрометрически по скорости превращения ТАМЕ в N (тозил)-аргинин (ТА). Для масс-спектрометри-ческого контроля за процессом гидролиза путем изотопного обмена был получен стандарт ТА. Масс-спектры исходного ТА, его стандарта, а также их смеси, представлены на рис. 5. В выбранных условиях обмена степень обмена в стандарте составляет 1.6. Из соотношения интенсивностей изотопного распределения смеси оценивалась степень превращения субстрата, которая составляет 29 % за 15 мин при 20 °С.

Для определения а2-М в сыворотки вносился трипсин в тех же концентрациях что и при определении концентрации САА в сыворотках (предыдущий именованный подраздел). После образования комплекса сыворотки с трипсином полученные растворы смешивали с ТАМЕ и определяли скорости его гидролиза по отношению к скоро-

стям гидролиза ТАМЕ трипсином в известной концентрации. Содержание а2-М определяли исходя из концентрации активного трипсина. При этом принимали во внимание тот факт, что содержание активного трипсина в исходном препарате порядка 40 %. Полученные таким образом концентрации а2-М приведены на рис. 6.

В результате проведенного эксперимента было обнаружена пониженная концентрация а2-М в плазме крови носителей болезни Альцгеймера (в 2-5 раз по сравнению с сывороткой крови доноров) и повышенная концентрация а2-М у больных раком яичника (в 4-6 раз).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Реактивы. Трипсин СПОФА (Чехия); метиловый эфир N-тозил-аргинина (TAME), M = 378.88 (Sigma, США); N-тозил-аргинин (ТА) фирмы Reannal (Венгрия), М = 328.8; гидрокарбонат аммония NH4HCO3 (Sigma-Aldrich), M = 79.08; триф-торуксусная кислота (ТФУ) (Merck, Германия), M = 114.0; муравьиная кислота (Merck, Германия), M = 46.03; ацетонитрил фирмы Вектон, M = 41.05.

Биологический материал. Были использованы сыворотки крови.

Табл. 2. Клинический материал

Носитель Заболевание

Донор 1 (1980 г.р.)* Нет

Донор 2 (1982 г.р.)* — " —

Донор 3 (1973 г.р.)* — " —

Альц 1-4** Болезнь Альцгей-мера

Альц 2-4** — " —

Альц 3-3** — " —

Альц 4-2** — " —

Альц 5-4** — " —

Альц 6-3** — " —

#303* Рак яичника

#349* — " —

#400* — " —

#411* — " —

Примечание. Биологический материал: — сыворотка крови, — плазма крови.

Хроматографирование проводили на приборе Ми-лихром А-02 при температуре 35 °С, градиенте (НСООН 0.25 % + H2O), (НСООН 0.25 % + CH3CN) 0-12 мин — 0-100 % при скорости потока 200 мкл/мин. Объем аликвоты при проведении хроматографии — 20 мкл.

Масс-спектрометрия. Масс-спектрометрические измерения проводили на времяпролетном масс-спектрометре МХ-5310, с ортогональным вводом ионов и оборудованном электрораспылительным источником ионов (ESI-o-TOF) (Институт аналитического приборостроения РАН, Санкт-Петербург). Все спектры получены в режиме съемки положительных ионов. Объем пробы — 10-50 мкл, скорость подачи пробы — 15 мкл/мин.

MALDI масс-спектры были получены на приборе Ultraflex (Bruker Daltonics, Bremen, Германия) в НИИ БМХ РАМН им В.Н. Ореховича (г. Москва). Все спектры получены в режиме съемки положительных ионов. В качестве матрицы использовалась а-циано-4-гидроксицинаминовая кислота.

Получение стандарта ^(тозил)-аргинина. Навеску 4.7 мг тозил-аргинина растворили в смеси 50 мкл H218O (соотношение ^О/16О — 50 %) и 3 мкл ТФУ. Обмен проводился в течение 3 ч при 50 °С. После проведения обмена соотношение 16O/118O/218O стало равным 2/38/60, степень вклю-

чения метки — 1.57. Для определения концентрации стандарта раствор смешивали с раствором исходного ТА точной концентрации и регистрировали масс-спектр смеси. После чего с помощью специального алгоритма [6] вычисляли соотношение концентраций исходного ТА и его стандарта.

Определение концентрации а2-М. Были приготовлены реакционные смеси: 20 мкл сыворотки (1/5), 10 мкл трипсина 0.08 мг/мл и 70 мкл буфера. После 15 мин комплексообразования по 4 мкл этих смесей были смешаны со смесью 10 мкл раствора ТАМЕ (2 мг/мл) и 36 мкл буфера. Реакция проходила в течение 15 мин. После чего реакцию останавливали разбавлением в 10 раз 0.2 %-й муравьиной кислотой. Для проведения масс-спектро-метрических измерений полученную смесь смешивали с раствором стандарта ТА с соотношением ТАМЕ до реакции / С (стандарта ТА) 1/0.4. При этом учитывалось, что ТАМЕ с исходной концентрацией 2 мг/мл разбавлялся в 50 раз. Итоговая концентрация сыворотки в реакционной смеси — 1/312.5. Помимо этого стандартным образом была проверена активность трипсина (20 мкл раствора трипсина 0.001 мг/мл были смешаны с 10 мкл ТАМЕ 2 мг/мл и 20 мкл буфера, время реакции — 15 мин). Концентрацию а2-макроглобулина определяли следующим образом:

С(а2-М) =

v(sera) х C (trypsin) x M (a2 - M) v(trypsin) x C (sera) x M (trypsin) x 2

При этом учитывалось, что одна молекула а2-макроглобулина способна образовывать комплекс с двумя молекулами трипсина.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Mirgorodskaya O.A., Kozmin Yu.P., Titov M.I., Körner R., Sänken C.P., Roepstorff P. // Rapid Comm. Mass Spectrom. 2000. V. 14. P. 12261232.

2. Miyagi M., Rao K.C.S. // Mass Spectrometry Reviews. 2007. V. 26. P. 121-136.

3. Aebersold R., Mann M. // Nature. 2003. V. 422. P.198-207.

4. Ивахно C., Корнелюк А. // Биохимия. 2006. Т. 71, вып. 10. С. 1312-1327.

5. Ong S.E., Foster L.G., Mann M. // Methods. 2003. V. 29, N 2. P. 124-130.

6. Манойлов А.В., Новиков А.В., Бубляев Р.А.

и др. Особенности включения стабильного 18

изотопа О в сильнокислой среде в карбоксильные группы пептидов // Здесь. С. 61-72.

7. Toropygin I., Serebryakova M.V., Khrya-pova E.V., Mirgorodskaya O.A. // VI symposium

"Chemistry of proteolytical enzymes", 2007. P. 54.

8. Lisivka-Myjak B., Kazynska B., Miszkurka G., Kadzelia K. // Acta Diabetologica. 2006. V. 43, N 4. P. 88.

9. Hanas J.S. et al. Biomarker Identification in Human Pancreatic Cancer Sera // Pancreas. 2008. V. 36, N 1. P. 61-69.

10. Sinnreich O., Kratzsch J., Reichenbach A., Gläser C., Huse K., Birkenmeier G. // Prostate. 2004. V. 61, N 3. P. 201-208.

11. Scacci R., Ruggeri M., Gambina G., Martini M.C., Corbo R.M. // Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 2002. V. 40, N 4. P. 333336.

Институт аналитического приборостроения РАН, Санкт-Петербург (Манойлов А.В., Краснов Н.В., Новиков А.В., Бубляев Р.А., Миргородская О.А.)

ГУ НИИ БМХ РАМН им В.Н. Ореховича, Москва

(Торопыгин И.Ю.)

Институт биоорганической химии

им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,

Москва (Козьмин Ю.П.)

Поликлиника РАН, Санкт-Петербург (Самус Н.Л.)

Материал поступил в редакцию 14.10.2008.

CLINICAL PROTEOMICS: NEW DIAGNOSTIC POSSIBILITIES

OF MASS SPECTROMETRY

1 2 3 1

A. V. Manoylov , I. Yu. Toropygin , Yu. P. Kozmin , N. V. Krasnov , N. L. Samus4, A. V. Novikov1, R. A. Bublyaev1, O. A. Mirgorodskaya1

1 Institute for Analytical Instrumentation RAS, Saint-Petersburg 2Oreсhovich Institute of Biomedical Chemistry RAMS, Moscow 3Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry RAS, Mosrnw 4The Hospital of RAS, Saint-Petersburg

A mass spectrometric method of serum amyloyd A (SAA) identification was developed. SAA is a protein, characteristic marker for ovarian cancer diagnostics. Its determination was accomplished directly in the human blood serum by regulated trypsinolysis without a preliminary separation. New approaches to quantitative determination of this protein in blood sera with using of concentration of its tryptic fragment (67-87) SAA, present in hydrolysates, were developed. Besides mass spectrometric method of determination of a2-macroglobulin (a2-M) in blood sera and plasma were developed. Concentrations of a2-M in blood sera under ovarian cancer and in blood plasma under Alzheimer disease were measured using developed methods. It was shown that concentration of a2-M significantly increases under ovarian cancer and decreases under Alzheimer disease relatively of donor's blood sera.