CC BY
165
ИСТОРИЯ
Клеточной биологии - 100 лет: уроки на будущее
B.C. Репин
Директор НП Институт клеточных технологий и регенерационной медицины им. А.Я. Фриденштейна
The centenary of cell biology: lessons for the future
VS. Repin
A.S. Fridenstein Institute of Cell Technologies and Regenerative Medicine, Moscow
Подводя итог главных событий, открытий и ученых в пределах «Клеточной биологии XX века», следующие темы выдвинуты на первый план: 1} начало клеточной биологии и эпоха витализма, связанные с именами Ж. Леба, 3. Гаррисона, А. Карреля, Т. Моргана и Д.Х. Вильсона; 2} движение от концепции ультраструктуры к идее компартментализации клетки; 3} начало системной биологии и биоинформатики; 4} рекомбинантная молекулярная клеточная биология; 5} клеточная биология развития; 6} поведение клетки in vitro и in vivo; 7} клеточная биология и трансплантация органов; 8} постге-номная клеточная биология: препятствия и пределы для следующих этапов прогресса; 9] от молекулярной биологии до модульной биологии; 10} ведущая роль новых мега-проектов в XXI веке.
Summing up the main events, discoveries and scientists within the «Cell Biology XX», the following topics are highlighted: 1} The beginning of cell biology and the epoch of vitalism - the impact of J. Loeb, R. Harrison, A. Carrel, T. Morgan and D.H. Wilson; 2} from cell ultrastructure to the concept of cell compartmentalization; 3} the beginning of systemic system biology and bioinformatics; 4} recombinant molecular cell biology; 5} developmental cell biology; 6} cell behavior in vitro and in situ; 7} organ and cell transplantation -the impact into basic cell biology; 8} post-genomic gigabyte cell biology: hurdles and limits for the next round of progress; 9} from molecular biology to modular biology; 10} the leading role of a new mega -international project in the XXI century.
Во все эпохи наука делится на две реальности: 1 - новейшие методические прорывы, поток новизны и предчувствий в виде новых гипотез последнего десятилетия; 2 - всё остальное. Однако последний мир - не кладбище, а музей личностей и событий. Здесь время течёт медленней, а река жизни отбирает самое существенное. Прошлое и настоящее необходимо связаны творчеством каждого нового поколения учёных, поскольку меняется лишь глубина наших вопросов и ответов.
Сидней Бреннер
У истоков органных и клеточных культур
В первое десятилетие XX века Росс Гаррисон использо вал метод висячей капли, разработанный микробиологами, для наблюдения под микроскопом за ходом поведения не рвных клеток в эксплантатах нервной ткани цыплёнка [1,2]. Работая в университете Джона Гопкинса в Нью Йорке, Р. Гаррисон задался целью выяснить механизм роста нервной ткани в простых химических условиях вне организма. Как из вестно, механизм возникновения нервных отростков был в центре мировой дискуссии в первое десятилетие XX века. За 5 лет Р. Гаррисон описал более 211 трудоёмких методик, необходимых для стерильного выращивания эксплантатов ткани млекопитающих и человека. Учёные современники утверждали, что первая технология культивирования эксп лантатов была заимствована у Лео Лёба (брата Жака Лёба), работавшего в пригороде Нью Йорка с 1897 года [3].
Через 35 лет разработки Р. Гаррисона в области выра щивания органных культур получили мощный импульс к развитию в связи с федеральной программой США по разработке вакцины против полиомиелита. Долгие годы фундаментальные исследования в вирусологии были невоз можны, т.к. изолированные вирусы размножались только внутри соматических клеток in vitro. Сначала J.F. Enders,
Т.Н. Weller, F.C. Robbins показали, что вирус полиомиелита хорошо размножается в культуре эпителиальных/стромаль ных эмбриональных клеток. Через 5 лет R. Dulbecco и М. Vogt разработали методику крупномасштабного выращивания ви руса полиомиелита на клетках почки приматов для получения живой и мертвой вакцины. Эта методика была использована Ионасом Солком для первой вакцинации людей (вместе с А.А. Смородинцевым) в Карелии.
До Р. Гаррисона было известно о различной способности тканей человека и животных переживать без кровоснабже ния. Метод культуры in vitro позволил более точно опреде лять сроки выживания перивитальных тканей и клеток. Эти знания позже были использованы для разработки протоко лов изъятия и хранения органов для трансплантации. Как правило, сосудистый эндотелий, эпителиальная паренхима органов более чувствительны к гипоксии, чем строма и со единительная ткань органов. В лаборатории Ю.М. Лопухина было показано, что эндотелиальная выстилка крупных и мелких артерий первой повреждается в переживающих органах. Эти особенности клеточной биологии сосудистой стен ки сыграли важную роль в разработке новых гиперкалиевых сред для улучшения сохранности донорских органов в пе ривитальный период.
А
История
Клеточная биология в эпоху витализма
В начале XX века развитие экспериментальной биоло гии по всем направлениям сдерживалось представителями витализма. Виталисты считали, что все химические и физи ческие процессы управляются нематериальными силами. Любое разделение ткани (клеток) на составляющие неизбеж но приводит к утере «витальности» и артефактам. Предста вители витализма господствовали во всех университетах Европы и США. По этой причине не финансировалось разви тие экспериментальной биохимии и молекулярной биологии. Первой набирала силу экспериментальная морфология, по скольку здесь господствовали взгляды К. Линнея о кодиро вании функции органа его морфологическим устройством. Морфологические данные служили главным катализатором развития эволюционной теории и биологии развития.
Жак Лёб первым продемонстрировал, что изолированные яйцеклетки в культуре не только переживали, но и сохраняли автоматику оплодотворения. В 1899 году он получил личинку морского ежа из неоплодотворенных яиц в простой солевой среде. Партеногенетическое развитие зародышей Ж. Лёб вызывал градиентом одновалентных и двухвалентных катио нов. Затем он получил нормальных головастиков лягушки, стимулируя начальное развитие яйцеклетки микроиглой. От крытия Ж. Лёба нанесли первый сильный удар по позициям витализма в биологии. В 1901 году Ж. Лёб был выдвинут на соискание Нобелевской премии.
Много раньше других, когда классическая генетика в США и Европе делала лишь первые шаги, Ж. Лёб провид чески полагал, что язык наследственности материален и секреты поведения клеток зашифрованы на языке химии. «Мы должны преуспеть в создании искусственной живой материи, либо найти объяснение, почему это невозможно... Поведение наших клеток, как и наше поведение и инстинк ты, запрограммировано наследственным аппаратом. Мы подчиняемся законам наших клеток, которые живут двой ной жизнью: в мире химии и мире смысла». Тайны зачатия и начального развития в его понимании свелись к локальному сродству (тропизму) ионов к участкам клеточной мембраны клеток. Ж. Лёб в началеXX века стал самым популярным бор цом с витализмом. В письме к Эрнсту Маху Ж. Лёб писал:
«После открытия лабораторного партеногенеза сбылась моя мечта от описаний я перешел к лабораторному конструи рованию жизни».
Работы следующих поколений учёных показали, что по ведение простейших, инфузорий, эукариот и даже прокари от управляется не столько локальными сигналами, сколько стратегией выживания. Эта стратегия всегда больше, чем сумма составляющих входных сигналов. Сложное адап тивное поведение клеток опирается на быстрое развитие автоматических навыков, расширяющийся спектр сенсор ного распознавания, новизну двигательных ответов, сек реторной активности, репрограммирование поведения.
Под влиянием Ж. Лёба хирург Алекс Каррель (только что получивший Нобелевскую премию за создание первых со судистых анастомозов) увлекся идеями и возможностями клеточной биологии в медицине. В 1912 году он основал первую специализированную лабораторию культуры клеток (до него Р. Гаррисон занимался лишь культивированием эм бриональных тканей) на базе Рокфеллеровского института в Нью Йорке. А. Каррель создал основное оборудование (прототип современных С02 инкубаторов, ламинарных шка фов, многоразовой стеклянной посуды флаконов Карреля). А. Каррель первым в мире получил линии фибробластов че ловека, которые пассировали в его лаборатории более 30 лет. А. Каррель нанёс второй сильнейший удар по витализму, по скольку сумел доказать, что фенотип и профиль поведения клеток человека/животных в культуре сохраняют особен ности, присущие им in situ. А. Каррель предсказал великое будущее культуры клеток для медицины, поскольку только клетки являются единственно морально допустимой формой «эксперимента на человеке». А. Каррель первый доказал, что неограниченная пролиферация in vitro позволяет наращивать биомассу соматических клеток в масштабах, сопоставимых с размерами органов. А. Каррель предвидел эпоху, когда трансплантация клеток будет использоваться как альтерна тива трансплантации органов. А. Каррель первым показал, каким образом клетки человека и животных могут исполь зоваться для изучения клеточных манифестаций и меха низмов заболеваний человека. В 30 х года А. Каррель сконструировал первый вариант искусственного сердца.
История
С 30 x годов XX века в лаборатории Т. Моргана с помо щью количественных морфологических и биохимических признаков началось изучение взаимосвязи генотипа и фе нотипа клеток/организма, что привело к бурному экспери ментальному прогрессу генетики развития. В первые 30 лет XX века удалось преимущественно добиться выращивания в пассажах тех популяций соматических клеток, которые первично мигрировали из эксплантатов ткани [4].
В 1907 году Д.Х. Вильсон впервые описал удивитель ный феномен регенерации морских губок. Он разрушил особь до составляющих ее клеток и затем воссоздал живой организм заново за счет спонтанной агрегации клеток. В середине XX века M.S. Steinberg продолжил изучение самосборки диссоциированных эмбриональных клеток в функциональную ткань у млекопитающих [5, 6]. Позднее на многих видах было показано, что регенерация начинает ся с повторной спонтанной сборки клеток на почве селек тивных клеточных узнаваний. Применение этого правила вылилось в технологии получения химерных зародышей и клеточную инженерию тканей [7].
Яркой фигурой в естествознании начала XX века в Рос сии был харьковский врач революционер А.А. Богданов. В 1905 году в Швейцарии он издал «Эмпириомонизм». Эта философская работа побудила В.И. Ленина написать «...эм пириокритицизм». В 20 х годах вышла «Тектология: все общая организационная наука» первая русская книга о кибернетике в биологии и обществе. В 1926 году А.А. Бог данов создал первый в России институт переливания кро ви. А.А. Богданов был увлечён идеей пересадки клеток и тканей для лечения человека. Он погиб в Ленинграде в ре зультате неудачно проведенного экспериментального пе реливания крови.
С 1912 года появились публикации харьковского про фессора Н.А. Белова об организме человека как самоизле чивающемся автомате, наделенном сетями обратных связей. Свои идеи Н.А. Белов докладывал на семинаре В.М. Бехте рева в Петербурге. Ряд серьёзных специалистов в наше время утверждают, что многие ключевые идеи кибернетики и теории систем были сформулированы Н.А. Беловым раньше Винера и Берталанфи.
От ультраструктуры
к компартментализации клетки
Изучение ультраструктуры клеток эукариот и прокариот быстро продвинулось вперед с наступлением эпохи элект ронных микроскопов. Первые электронограммы ультратон ких срезов клеток были опубликованы Кейтом Портером и Албертом Клодом в 1944 году. Эта команда Колумбийского университета в Нью Йорке на долгие годы стала лидером в клеточной биологии по нескольким причинам. Во первых, К. Портер и А. Клод создали новую философию одновре менного морфо биохимического изучения изолированных клеточных органелл. К. Портер создал стандартные воспро изводимые протоколы исследования клеток под электронным микроскопом, которые сразу стали доступны десяткам ла бораторий. Как и в случае с ДНК, качество подготовленных препаратов играло решающее значение для интерпретации полученных данных. А. Клод впервые разработал метод фракционирования составных частей клетки в растворах с изотоничной сахарозой (маннитом), которые препятствовали преждевременной гибели мембран и артефактному набуха нию органелл. Гомогенаты после мягкого разрушения ткани в гомогенизаторе разделяли в центрифуге на однородные слои в соответствии с величиной, формой и плотностью. Стан дартно изолированные клеточные органоиды параллельно изучались биохимическими и морфологическими методами. Электронный микроскоп соединил новыми мостами гистоло гию и биохимию, структуру и функцию клеточных органелл.
А. Клод, К. Портер и Паллад сыграли главную роль в со здании нового «профсоюза» клеточных биологов - Tissue Culture Organization. Эта организация стала функциониро вать и заниматься стандартизацией методов клеточной биологии с 1948 года. Этот этап был необходим для ин дустриализации и коммерциализации исследований.
В 50 60 е годы XX века опережающими темпами раз вивались идеи самособорки клеточных структур из исход ного набора молекул. В эту эпоху полагали, что химический порядок в клетке создаётся за счёт высоко аффинных хи мических взаимодействий, ферментативного катализа и разделения гидрофильных/гидрофобных отсеков (ком партментализации). За короткий срок удалось осуществить
История
самосборку in vitro нескольких вирусов, бактериофагов, рибосом и плазматической мембраны клеток эукариот. В 1974 году К. Де Дюв и А. Клод получили Нобелевскую пре мию за открытие универсальных законов компартментали зации эукариотических клеток. Важно, что с этого времени молекулярную и информационную «начинку» клеточных органелл стали изучать in vitro.
Казалось, что методы высокоаффинной сборки органелл подскажут принцип их функционирования. Однако желаемо го не случилось. Функция митохондрий, рибосом, аппарата Гольджи, синапсов не проглядывала сквозь двухмерные электронограммы и даже через 3D компьютерные макеты клеточных органоидов. Физика устройства не давала клю чей к расшифровке soft программ. Клеточная биохимия была вынуждена двигаться к биоинформатике и нековалент ным взаимодействиям макромолекул в клетке.
Однако идея «компартментализации» клетки, предло женная К. Портером, оказалась очень плодотворной и по родила множество новых подразделов клеточной биологии.
Все клеточные органеллы - это не только ферментатив ные фабрики, но и информационные чипы. Двойственные функции цитоскелета были первыми открыты в связи с изу чением циркуляции информации от рецепторов плазмати ческой мембраны в ядро и наоборот. Силы механического напряжения, сжатия, растяжения через цитоскелет и сенсо ры плазматической мембраны/экстраклеточного матрикса перекодируются в поток химических сигналов в локальных сигнальных сетях. Микронные деформации цитоскелета вызывают сопряженную активацию/ингибирование мета болических каскадов с помощью позитивных/негативных feed back сигналов [8].
Идея «нано компартментализации» клетки появилась в начале 50 х годов XX века. Инициатором этого направле ния в биологии был физик, Нобелевский лауреат Ричард Фейнман. Первая информация о нано компартментах клетки пришла от специалистов по конфокальной и сканирующей электронной микроскопии высокого разрешения. Около 100 лет назад клеточные биологи высказывали предполо жение, что клетки реагируют изменением формы на сигналы окружающей среды. Клетки нафаршированы сократитель ными нитями, использующими принцип взаимного скольже ния, моторами, помпами катионов и анионов. Масштабы производимой механической работы измеряются в пико ньютонах в нанометровой шкале и быстродействием порядка нескольких мсек. Молекулярные машины работают без инерции. Между входными и выходными характеристиками этих машин существуют гибкие связи, которые хорошо ре гулируются [9]. Передача сигналов опосредуется «конфор мационной волной» за счет природной гибкости (flexibility) вторичной структуры белков, обеспечивающей передачу сиг нала по сетям с максимальным быстродействием, помехо устойчивостью и минимальными затратами АТФ. Начальные ангстремные сдвиги рецепторного активированного доме на при передаче на миофибриллы и цитоскелет миоцитов транформируются в мышечное сокращение или клеточную подвижность. Масштаб выходных реакций уже измеряется сотнями микрон. Обратимые взаимодействия на уровне ли ганд/рецептор происходят в масштабе тысячных секунды. Геномные ответы клеток осуществляются в масштабе ча сов, перестройки фенотипа клеток в течение нескольких суток. Нетрудно видеть, что этот принцип «перевернутых ча сов» позволяет клетке сортировать наиболее существенные входные сигналы и автоматически игнорировать краткосроч ные «помехи».
Протеомика подчиняется правилам динамичной, обрати мой 3D сборки белков в функциональные мультиферментные комплексы, молекулярные машины, органеллы. Многоликий
фенотип клеток формируется на базе этих широких возмож ностей белков к комплексообразованию, которые выходят из границ и информационных лимитов генов. Динамичес кая перестройка хроматина, плазматической мембраны, органелл постоянно регулируется по «горизонтали» (внутри клетки) soft сетями. Другие софты контролируют «хореог рафию» белков по «вертикали» через множественные межклеточные взаимодействия в тканях. Софты отдельных клеток становятся средством для более высоких задач кле точных коопераций на уровне модулей. Поэтому изучение клетки сверху вниз от поведения ткани к геному составля ющих клеток становится наиболее производительной и продуктивной технологией. Клеточная биология наших дней, опираясь на функциональную геномику, нацелена на управ ление коллективным поведением клеток in vitro и in vivo.
Сейчас в разных лабораториях с помощью «нокаут мута ций» создаются линии клеток со стопроцентно однотипными поведенческими ответами в культуре. Барбара МакКлинток, получившая в 1985 году Нобелевскую премию за открытие мобильных генов, так сформулировала основную идею на следующие годы: «Главная задача на будущее определить те знания, которые есть в клетке, и знания, которые она выра батывает и использует для генерации разумного адекватного поведения».
CD5 иммунный рецептор Т и В лимфоцитов обеспечи вает распознавание нанометровых участков поверхности микробов и чужеродных клеток [10]. Понять функцию такого защитного белка можно в нано шкале взаимодействий мик робной и иммунной клетки.
Мезенхимальные клетки, мигрирующие внутри бластоце ля морских ежей, формируют многочисленные филоподии, которые используют как сенсорные органы для анализа фор мы поверхности и детекции химических сигналов в масштабе 75 120 нм [11]. Аналогичным образом мезенхимальные клетки млекопитающих с помощью филоподий детектируют строение и 3D микрорельеф кости или гидроксиапатита для выбора наиболее адекватных путей миграции, заселения и синтеза экстрацеллюлярного матрикса. Эпицентр регуля торных событий между клеткой и поверхностью матрикса локализован в масштабе 30 60 нм [12].
В микрошкале идет катализ в активном центре фермента. В нано шкале организована регуляция активности катали тических центров через нано регуляторные взаимодей ствия. Софты организованы в нано шкале. Регуляторная нано soft ниша фермента N0 синтазы уже полностью рас шифрована [13].
Молекула фибронектина имеет около 50 нано доменов, выполняющих разную роль в адгезии и локомоции клеток. Эти же участки являются источником афферентных сигна лов для цитоскелета клетки. Участки матрикса размером 11 нм способны эффективно менять взаимодействие клетки с подложкой, направленную адгезию и форму «contact guidance» [14]. Сигналы с рельефа экстраклеточного матрик са порядка нескольких десятков мка обеспечивают «грубую» шкалу архитектуры, тогда как сигналы с нано поверхности матрикса контролируют локальное образование филоподий, ламеллы или транспортных везикул для эндоцитоза.
У истоков системной биологии
Парадокс между простой линейной химией входных ре акций и нелинейно возрастающей сложностью выходных физиологических и поведенческих реакций клеток требо вал не модных тогда редукционистских решений, а менее категоричных, осторожных системных подходов для высшей архитектуры и порядка клеток. Кибернетика сыграла важ ную роль в открытии обратных связей между входными и выходными реакциями клеток. Молекулярные и клеточные
feed back устройства защищают содержимое клеток и тка ней от хаоса, провоцируя кооперативные и циклические гомео защитные циклы. Открытие аллостеризма - регуляторных и каталитических субъединиц в мире информационных моле кул объяснило, каким образом одни и те же макромолекулы участвуют в сборке софт программ и хард устройств или молекулярных машин клеток.
Ещё неоформленные идеи системной биологии в нашей стране породили оригинальное направление, которое стали называть биосинергетикой или интегратизмом. Его плодо творно развивали школы А.А. Ляпунова и Г.Р. Иваницкого.
Кауфман на многих моделях показал, что главной ми шенью селекции клеточных систем на стыке порядок/хаос является адаптивно приспособительное поведение кле ток. Оно включает: распознание новых важных сигналов окружения, выработку нового типа поведения, освоение новизны на уровне выходных физиологических ответов и поведения клеток.
Биоинформатика
Биоинформатика пришла в биологию на смену витализ му через многие экспериментальные двери. Выдающиеся физики XX века первыми сформулировали вопрос вопро сов: как неживые молекулы становятся живой клеткой с целе направленной деятельностью? Когда и как организованное вещество превращается в существо, мир молекул соеди няется мостами с миром мегабайтов, давая на выходе фи зиологию и целенаправленное поведение клеток? Питер Мидавар первый указал на непродуктивность поиска про стых формул, связывающих биологическую организацию с законами термодинамики. Лексикон химии и морфоло гии не имел работающего дискрипторного словаря в мир физиологии и высших форм поведения клетки. Вклад фи зика Э. Шредингера оказался решающим для материали зации концепции гена. Его идея колинеарного кода смогла соединить воедино мир ДНК/РНК/белков. В этот период Э. Шредингер активно занимался поиском того «дополни тельного» принципа, который бы объяснил физиологичес кий масштаб и уровень поведенческих реакций клетки. Э. Шредингер рассматривал клетку как «лестницу чудес» где простые химические реакции на входе рождали пока необъяснимый порядок целесообразного поведения на вы ходе. Л. Сцилард первый предположил, что клетка работает как «киллер хаоса». Импортируя энергию, клетка экспорти рует энтропию. В ходе эволюции клетки и организмы не столько воюют друг с другом, сколько сражаются с хаосом окружающей среды за выживание. Организация и регуля торные мегабайты минимизируют законы вероятности внут ри клеток. Структуры клетки подготовлены для хранения, накопления, циркуляции и генерации новой информации. Накопление новой информации проявляется в новом фено типе или новом организованном поведении клеток. Только организованные системы не перегреваются в условиях интенсивного клеточного метаболизма [15].
Ноберт Винер предложил концепцию живой клетки как информационного чипа. Входные потоки энергии, веществ и информации перекодируются в целесообразные физио логические ответы и целостное адекватное поведение клеток.
Н. Винер повернул рассуждения биологов в новом направ лении: «Мы лишь водовороты в вечно текущей реке жизни. Мы представляем собой не вещество, а тройную спираль из потока веществ, энергии и информации, которые преобра жаются в целесообразное поведение и физиологию клеток». Вернер Л ёвенстайн оказался первым, кто доказал, что именно потоки входной информации управляют потоками энергии, веществ и метаболизмом клетки [16].
Эра рекомбинантной молекулярной биологии
Первый ген человеческого инсулина «заработал» в культуре кишечной палочки в 1982 году. Первая рекомби нантная вакцина против вируса гепатита В была получена в культуре дрожжевых клеток в 1986 году. Биотехнологии на основе клеточных культур в короткое время изменили лицо и возможности диагностической медицины (моно клональные антитела и ПЦР). С 1998 года герцептин стал использоваться для лечения прогрессирующего рака мо лочной железы.
Исследования в культуре показали, что гены человека работают эффективно как в клетках эукариот, так и прока риот. На этой платформе с 80 х годов XX века стали фор сированно развиваться трансгенные технологии для двух главных целей: 1. изучения функции генов человека и животных in vivo; 2. создания экспериментальных живот ных моделей главных наследственных болезней человека. Оказалось, что мутантные гены человека работают в хро мосомах животных и способны вызывать схожую морфоло гическую патологию органов, которая сочетается с похожей клинической манифестацией «моногенного» заболевания человека. Это дало возможность приступить к реализации многолетней программы моделирования наиболее простых моногенных заболеваний человека на лабораторных животных.
В 1973 году Сальвадор Лурия и Макс Дельбрюк созда ли модель для изучения лабораторной эволюции ДНК фа гов в кишечной палочке in vitro, а также законы пластичной модификации ДНК у прокариот in vitro. Молекулярная био логия первой нашла способ изучать эволюцию в пробирке. Империя прокариот содержит на многие порядки больше смысловой информации, чем вся современная инфо инду стрия планеты. Если эти сети сопоставлять по плотности выходных мегабайтов на мг химического продукта клетки, то биология и современная промышленность и индустрия сосуществуют в разных мирах [17].
Биология развития
В 1950 году Поль Вайс предложил термин «биология развития» для создания мультидисциплинарной платфор мы исследований эмбриогенеза. Входные молекулярные сигналы эмбриональных клеток изучались молекулярными биологами, тогда как развитие и построение тканей было в руках у описательной морфологии и физиологии. П. Вайс пы тался выйти на одновременное изучение афферентных и эфферентных систем клеток, чтобы приблизиться к кодам эмбриогенеза. Создание новых моделей и мультидисципли нарных парадигм было необходимо, чтобы избежать моно кулярного зрения узких профессионалов.
Эмбриональная индукция является главной масштабной программой координации развития зародыша как целост ной развивающейся системы. Для проверки гипотезы пре формации/эпигенеза Вильгельм Ру и Ганс Дриш разрабо тали изящные методы фрагментации зародыша с помощью микроинструментов для изучения их роли в развитии. Пер вые же эксперименты выявили множественные эффекты пересаженных эксплантатов на развивающийся зародыш. В середине 20 х годов XX века Ганс Шпеманн и Хильда Манголд обнаружили дупликацию нервной трубки при пе ресадке дорзальной мезодермы в область вентральной ме зодермы вьюна. У млекопитающих дорзальная мезодерма ответственна за образование экстра дорзальных осевых структур, включая нервную трубку и осевую мускулатуру. Уди вительной оказалась способность дорзальной эктодермы к множественной эктопической репликации осевых структур зародыша [18]. Уже через 11 лет после первой публика ции Г. Шпеманн получил Нобелевскую премию. X. Манголд
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, № 3, 2007
История
погибла в 1925 году от взрыва бытового газа в квартире, не увидев даже своей первой научной публикации. Иссле дования эмбриональной индукции проложили дорогу к изу чению антагонизма генов в развитии, а также к открытию нового класса сигнальных молекул - морфогенов. Молекуляр ный механизм действия самого организатора у млекопита ющих был расшифрован лишь в конце XX века. В настоящее время дупликацию осевых структур можно получить инъекцией мРНК одного гена (goosecoid). 70 лет спустя Роза Беддингтон использовала идеи эмбриональной индукции для расшифровки осевого развития пост гаструлы млекопита ющих. Пересадки кусочков примитивной полоски индуциро вали эктопический дубликат нервной трубки без головной части. Перекрестные пересадки показали важную индукцион ную роль экстраэмбриональной энтодермы в формировании главных осей развития зародыша дубликата [19, 20]. Глав ные организаторы гаструлы и осевого органогенеза (экстра эмбриональная энтодерма, эктодерма, нотохорд и узелок) со держат сигналы антагонисты, блокирующие дальнейшую дифференцировку зародышевых листков. Организованное 3D развитие зародыша и органный паттернинг зависит от баланса индукторов/репрессоров, контролирующих появле ние новых эмбриональных/фетальных линий - временных исполнителей программ формирования дефинитивных линий клеток плода и экстра эмбриональных органов.
В середине 50 х XX века К. Гробстайн показал, что раз витие зачатка эпителиальных желёз и почки (метанефроза) можно изучать в органной культуре. Такая система содер жит всю необходимую информацию развития. Если эпи телий и мезенхиму зачатка разделить механически или разделить ткани полупроницаемой мембраной, то разви тие эпителия и стромы органа останавливается. К. Г робстайн показал, что главные индукционные события органогенеза происходят по всей площади взаимодействия эпителия и мезенхимы.
Основной прогресс в изучении генетики/эпигенетики индивидуального развития достигнут по трем направлениям:
1. эмбриональные стволовые клетки и мезенхимальные стволовые клетки взрослых тканей; 2. механизмы первич ной и вторичной эмбриональной индукции; 3. обратимые эпителио мезенхимальные конверсии в эмбриональных и «взрослых» тканях.
Эмбриональные стволовые клетки в культуре проложили дорогу к лабораторному воспроизводству первичной экто дермы, мезодермы, энтодермы, экстра эмбриональной про визорной ткани. Многие события ранней эмбриональной индукции уже удается воспроизводить в смешанных куль турах, используя законы антагонизма генов в развитии.
Для получения высокоочищенной мезодермы, энтодермы используют не только сигналы индукторы, но и сигналы репрессоры альтернативных путей развития.
Изучение потенциала развития мезенхимальных ство ловых клеток (МСК) из взрослых тканей млекопитающих и человека подтвердило предположение, что потенциал этих клеток природно ориентирован на участие в процессах естественного обновление стромы/эпителия, а также на участие в экстренной репарации ткани после массивных ме ханических/биологических (вирусных) поражений ткани.
Пластичность фенотипа и путей дифференцировки МСК позволяет множественными путями соучаствовать в локальной репарации паренхимы за счет массовой кон версии МСК в эпителий в зонах активной регенерации и репарации. На этой удивительной программе сосущество вания в качестве клеток предшественниц эпителия in situ построено будущее терапевтическое использование МСК в клинике.
Поведение клеток in vitro
Одна из великих загадок биологии - сложные постоян ные целенаправленные движения клеток. Клетки меняют форму, делятся, пролиферируют, замирают в неактивном состоянии, строят ткань. Целостность и очевидная целесо образность поведения клеток заставила многих учёных за думаться о материальной подоплёке этого феномена. P. Weiss первый показал, что клетки в культуре предпочи тают мигрировать по экстрацеллюлярному матриксу (contact guidance). Это свидетельствуето том, что важнейшие управ ляющие поведением клетки сигналы концентрируются на стыке базальной части плазматической мембраны и компо нентов матрикса [21, 22]. В середине XX века Abercrombie открыл феномен контактного ингибирования в монослое нормального эпителия или плотной многослойной культуре фибробластов. Эта важная feed back автоматика роста в культуре отсутствовала у малигнизированных клеток. Это было первым указанием на дефекты регуляторных модулей в раковых клетках. Более того, монослой/плотные культуры нормальных клеток влияли на пролиферацию раковых клеток только в том случае, когда индуцировали дифференцировку части незрелых мультипотентных клеток.
Второе важное отличие нормальных от малигнизирован ных соматических клеток заключалось в том, что вырастить пассаж из одиночных нормальных клеток не удавалось, тогда как одиночные раковые клетки легко формировали колонии. Только в 1948 году К.К. Sanford, W.R. Earle, G.D. Likely на учились получать первые клоны из одиночных нормальных соматических клеток в микрообъеме кондиционированной среды, помещенной в кончик пастеровской пипетки. Когда одиночные клетки формировали колонии из 20 50 клеток, их переносили в обычные чашки Петри и получали первый пассаж. Другой способ клонирования одиночных клеток на облученном фидере был предложен Т.Т. Puck и P.I. Marcus в 1955 г.
В 1931 году S.A. Lewis описал пиноцитоз (water drinking) в культуре клеток, который в дальнейшем стали широко ис пользовать для подбора оптимальных условий культивирова ния. Изучение пиноцитоза, затем рецепторного эндоцитоза привело К. Де Дюва к открытию лизосом.
В работах Ю.М. Васильева было показано, что поведе ние изолированных дифференцированных соматических клеток человека в культуре повторяет навыки клеток в ткани они строят или восстанавливают ткань. Малигнизированные клетки ведут себя «асоциально», утрачивая способность к гистогенезу и репарации ткани [23 25].
В 1970 году в журнале «Успехи современной биоло гии» появилась статья крупного ленинградского цитолога
В.Я. Александрова «Проблема поведения на клеточном уровне (цитоэтология)» [26]. В этой пионерской статье были сформулированы две важные новые мысли: 1. в природе клеток предусмотрен протоинтеллект, который управляет их поведением; 2. в клетке есть молекулярные машины рас познавания сигналов, новизны, а также наработки новой сиг нальной информации, которые отличены от интеллекта на базе ЦНС и высшей нервной деятельности. Молекулярные машины самообучающихся клеток плодят в организме новую информацию, которая наиболее эффективно управляет по ведением клеток.
В середине 70 х годов акад. В.А. Энгельгардт экспе риментально обосновал предположение, что информаци онная и метаболическая устойчивость клеток покоится на семантических (смысловых) кодах, работающих в клетках. В 1980 году на совместной сессии АН и АМН СССР он выс тупил с докладом, в котором предсказал переход медицины на новый уровень, когда клетки человека станут не только глав ным объектом и моделью, но и новым средством лечения.
В отличие от генетики, молекулярной медицины, меди цинская клеточная биология будет использовать способ ность клеток к самообновлению и регенерации [27, 28].
В середине 50 х годов XX века великий эрудит биохи мик Дэвид Кошланд (бывший долгое время редактором жур нала Science) занялся генетикой поведения бактерий. Он показал, что клетки кишечной палочки в состоянии детек тировать один новый сигнал среди 10 ООО старых, чтобы принять единственно правильное решение и избавиться от смертельной угрозы. Новый детектирующий поверхностный рецептор и жгутик, направляющий движение микроба, оказа лись собранными в одну молекулярную машину. Д. Кошланд первый обратил внимание на двойственные функции цито скелета в принятии новых решений: формирование новых информационных сетей от рецептора и реорганизация ске лета осуществляются практически одновременно. Позднее аналогичные феномены были обнаружены у клеток эукари от. «Двойная» жизнь цитоскелета в инфо и опорно двига тельных сетях связана с наличием в белках «регуляторных» и «локомоторных» сиквенсов (доменов), обеспечивающих одновременное формирование hard устройств и soft про грамм клеток. В белках обнаружены участки, ответственные за направленную доставку белков в ядро, лизосомы и плаз матическую мембрану [29].
Плотность информационных потоков в микробной клетке оказалась сопоставимой с нервной клеткой высших живот ных. Бактерия - это простейший инфо чип, наделенный целесообразным поведением. В бактериальной клетке су ществует система сопоставления входных и выходных от ветов. Эта согласующая система (intelligent primer) постоян но манипулирует и балансирует простыми химическими входными сигналами и комплексными выходными поведен ческими реакциями. Эта софт органелла перекодирует мо лекулярную химию входных реакций на язык физиологии и поведения. Бактериальные клетки наделены способностью к самообучению.
В середине 60 х годов XX века Ф. Жакоб и Ж. Моно выс казали предположение, что сигнальные сети, соединяющие внешние рецепторы с геномом и органеллами, управляют поведением клеток про и эукариот. Более того, эволюци онно родственные сигнальные системы управляют поведе нием всех клеток биоценозов (что справедливо для Е, coli, то работает и для клеток слона и человека). По этой причине гены человека работают в клетках микроорганизмов и других млекопитающих. По той же причине мышечные или сердеч ные клетки человека работают, приживляются и функциональ но интегрируются в тканях животных. В случае регенерации или локальной репарации ткани клетки разных видов де монстрируют общие паттерны поведения [30]. Общность по ведения клеток построена на общей платформе генов.
В виде метафоры упорядоченную платформу сигнальных сетей и цитоскелета клетки можно представить себе следу ющим образом: 1. общая универсальная часть сети во всех клетках контролирует фенотип и физиологические ответы клеток по общим правилам (подобно правилам шахматной игры); 2. вторая более индивидуальная часть сетей вокруг intelligent primer формулирует стратегию поведения клетки как баланс между правилами игры и витальными сигналами микроокружения [31].
Трансплантация клеток
В 1884 году Вильямс подкожно имплантировал больно му сахарным диабетом фрагменты ткани поджелудочной железы овцы. В 1890 году Томсон в Нью Йоркском уни верситете провёл эксперименты по пересадке клеток голов ного мозга от кошки собаке. В 1906 году была выполнена первая успешная пересадка роговицы. В 1907 - первое
успешное переливание АВО совместимой крови. В 1922 году в США надпочечники плода были пересажены двум паци ентам с болезнью Аддисона, после чего наблюдали дли тельный терапевтический эффект. В 1931 году П. Ниханс в Швейцарии спас от смерти пациентку, которая после оши бочного удаления околощитовидной железы находилась в коматозном состоянии. П. Ниханс в это время разрабаты вал метод получения растворимого кофе из замороженного сырья для компании «Nestle». Одновременно он получил па тент на заморозку функционально полноценных клеток жи вотных. В дальнейшем терапия с помощью замороженных клеток животных получила его имя. В 1928 году в Италии была произведена первая безуспешная пересадка подже лудочной железы пациенту с инсулин зависимым сахарным диабетом. Начавшаяся в середине XX века эра успешной пе ресадки органов надолго приостановила фундаментальные и прикладные разработки с трансплантацией соматических клеток.
Пересадки донорского аллогенного костного мозга, по чек, печени сердца привели к выявлению важной законо мерности: строма пересаженного органа в течение 2 3 лет практически полностью замещается собственными МСК и прогениторными стромальными клетками. Одновременно в ряде случаев донорские МСК из пересаженного органа рас селяются по всем больным и здоровым органам пациента и дают стабильные линии клеток соединительной ткани и эпителиальной паренхимы. Аллогенные МСК стабильно хи меризуют органы взрослых животных. Часть нейральных стволовых клеток и МСК после пересадки переходят в ста туе «дормантных» резервных стволовых клеток.
Новый этап клеточной трансплантации начался в 1985 году попытками лечения тяжёлых форм нарушения двигатель ной активности при болезни Паркинсона пересадкой хро маффинной ткани фетальных надпочечников в стриатум. Оказалось, что донорские ДОФА продуцирующие клетки способны контролировать гиперкинез и другую симптома тику заболевания у пациентов, не реагирующих на лекар ственную терапию. С тех пор клеточные пересадки шаг за шагом развиваются в медицине многих стран мира, когда прекращаются стандартные медицинские услуги по страхов ке. Пересадки гематогенных и мезенхимальных стволовых клеток стали регулярной медицинской услугой в гематоло гии, онкологии, в случае некоторых иммунодефицитов. Особо следует выделить успехи экспериментальных пересадок клеток в изучении эмбриогенеза низших и высших организ мов. Механизмы эмбриональной индукции, потенциал развития эмбриональных стволовых клеток, экто мезо и энтодермы, экстра эмбриональных тканей был выяснен с помощью ауто и аллогенных трансплантаций. До сих пор фетальные ткани и клетки остаются уникальным источником информации для изучения геномики и протеомики пост гаст рулы, органогенеза, вторичной индукции и формирования терминальных соматических линий паренхимы/мезенхимы в дефинитивных органах и тканях [32].
Постгеномная клеточная биология:
проблемы экспоненциального роста
Наметившийся идейный кризис в современной клеточ ной биологии из за дефицита крупных научных идей про является в беспрецедентной затоваренности рынка сырой гигабайтной инструментальной информацией. Более того, геномные данные банка Национального Центра Биотехно логии США продолжают удваиваться каждые 18 месяцев. Традиционные грантовые академические исследования в клеточной биологии XX века не имели возможности выходить за рамки частных вопросов и деталей. Фокус исследований от центральных глобальных проблем всё более смещался на
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, № 3, 2007
История
периферию вторичных задач. Подсчитано, что только зна комство с экспериментальными данными вокруг 5 генов дрозофилы потребует годовой работы примерно 1200 спе циалистов.
Между тем будущее принадлежит сплаву крупных новых идей с огромным корпоративным капиталом. Эта мысль Карла Поппера нашла первое воплощение в мега проекте «Геном человека», который организовал на 15 лет работу более 300 международных лабораторий с годовым бюджетом более 200 млн долларов. Клеточная биология XXI века и в даль нейшем будет рывками развиваться за счет новых «Манхэт тенских мега проектов». Почему редукционизм молекулярных биологов в начале XXI века стал таким же тормозом про гресса биологии, как витализм в начале XX века?
Пока стопроцентное линейное секвенирование геномов человека и других многоклеточных подтвердило старую ак сиому: первичное устройство генов не объясняет правила их функционирования в дифференцированных и эмбриональ ных клетках. Однако знание полной линейной структуры ДНК было непременным условием системной биологии, чтобы начать атаковать функциональные коды клетки сверху (up to bottom) (от их поведения) и снизу (bottom to up) (от пра вил синхронной активации/репрессии генов к правилам функциональной кластеризации белков в функциональных и регуляторных модулях клетки) [33]. Первый проект «Геном человека» создал методическую платформу для последую щих мега проектов в виде: 1. полностью автоматизи рованных лабораторий; 2. компьютерного обеспечения для интерпретации серийной мегабайтной информации. «Увидеть, чтобы понять». Этой логике следует стратегия пост геномной клеточной биологии.
Секвенирование двухметровой цепочки ДНК человека выявило, что 30 ООО с небольшим генов занимают около 2% длины молекулы. «Островки» генов разбиты «озёрами» и «морями» бессмыслицы. Как такие структуры работают в пространстве? В 2002 году Европейский Союз выделил 2,2 млн евро научному консорциуму из 7 крупнейших инсти тутов, которые начали разрабатывать проект «3D GENOME». Проект был закончен в 2006 году. Его главная задача со стояла в разработке методов одновременной экспрессии всех генов с помощью визуальных метчиков, локализован ных вблизи «бессмысленной» ДНК. Результаты этого второго мега проекта в пост геномную эпоху пока остаются не опубликованными.
Например, попытки каталогизировать список универ сальных, незаменимых белков стволовых клеток дал трудно интерпретируемые результаты. Сопоставление 2D проте омных карт всех анализируемых ЭСК выявил 92 общих белка. Сопоставление 2D протеомных карт ЭСК и МСК позволило идентифицировать 52 общих белка [34]. Однако найти об щий функциональный смысл этой весьма гетерогенной группе белков не удалось. Правила функциональной интег рации генов лучше всего могут быть поняты на примере организации и поддержания фенотипа стволовых и диффе ренцированных клеток. Иногда правила перекодировки мо лекулярных сетей в поведение клеток лучше всего изучать на линиях клеток с первичными дефектами клеточной адге зии, цитоскелета, хемотаксиса или репарации [35]. Клеточная биология сегодня, как и во времена двойной спирали ДНК, должна получить ответ на вопрос вопросов: как организо ванное поведение информационных и сигнальных молекул в сетях перекодируется в организованное целесообразное поведение клеток? Концепция функциональных и регулятор ных модулей в клетке помогает выделить те (пока незримые) «клеточные лифты», которые превращают организованный химический катализ в физиологический процесс. Все белки являются частью множества протеомных сетей. Однако
только модули являются теми уникальными органеллами клетки, где стыкуется молекулярный и физиологический порядок явлений [36]. Для всех метаболических и физио логических ответов клетки существует свой модуль. Более того, все модули интегрированы иерархически в общий модуль клетки с плотным и рыхлым «кластерингом» сиг нальных связей [37].
Функциональные и регуляторные молекулярные модули сейчас изучают как на стволовых, так и на дифференциро ванных клетках в культуре. Не исключено, что многие рако вые линии клеток, утрачивающие способность к гистогенезу и репарации, подскажут способы диалога молекул и мега байтов, молекулярных устройств и функции (поведения). Изучение формирования фенотипа дифференцированных клеток уже привело к открытию многочисленных функцио нальных супрамолекулярных модулей, обеспечивающих реализацию элементарных специализированных функций соматических дефинитивных клеток. В эмбриогенезе во всех тканях формируются модулярные повторяющиеся струк туры, собранные из стволовых/прогениторных клеток, подвергающиеся клональной экспансии и обеспечивающие аксиальный паттернинг и органогенез зародыша [38]. Регу ляторные модули развития лишены физиологии и поведе ния, характерных для клеток дефинитивных тканей. Более 280 регуляторных модулей уже идентифицировано в има гинальных дисках и других структурах дрозофилы [39]. Регуляторные модули опережающе клонируют новые про граммы и клеточные модули для реализации новых фаз эм бриональной индукции, формирования плакоды/папиллы для вторичного органогенеза в зародышевой эктодерме и энтодерме.
В дифференцированных соматических клетках фокус протеомных исследований пока находится на стадии визуа лизации крупных супрамолекулярных агрегатов, собирающих в едином пространстве несколько мультиферментных комп лексов, цитоскелета, транспортных везикул, ионных каналов и рецепторов в единый функциональный выходной модуль клетки. Начальная активация рецептора и ангстремные из менения его конформации на выходе модуля транслиру ются в видимые под микроскопом микронные изменения формы клеток и направленной подвижности. Важно другое, что такие мультимодальные комплексы, собранные из регуляторных и каталитических доменов, обеспечивают множественную амплификацию сигналов в наношкале кон формационными «волнами» (так называемый информа ционный катализ софт информации) [40]. Циркуляция и амплификация сигналов между аллостерическими доменами сопровождается минимальными затратами АТФ. Отдельные функциональные модули содержат до 15 аллостерических субъединиц и более 150 нано доменов для эоЛсигнали зации [41 ].
Технически двухмерная и трехмерная визуализация функ циональных модулей начинается с составления дифферен циальных протеомных карт клеток в покоящемся и активном состоянии. К сожалению, множество факторов культураль ной среды, комбинации ростовых факторов и матрикса создают серьёзные помехи для идентификации тех сетевых сборок белков, которые отвечают за одну выходную функцию клетки [42].
Современные клеточные модели, используемые для идентификации и визуализации мультимодальных молеку лярных комплексов, должны одновременно использовать контрольные замеры экспрессии/супрессии маркерных ге нов относящихся к моделируемой физиологической функции клеток (секреция, направленная миграция, сокращение, апоптоз и т.д.). Алгоритмы таких программ и компьютер ная графическая обработка данных уже доступны в виде
коммерческих продуктов Click, Expander, VennMapping, CoPub, Go Miner, GEPAT [43 46]. Важным маркером мо дульной сборки является кластеризация ключевых транс крипционных факторов в зоне промоторов/энхансеров. Плотность мультидоменных белок белковых взаимодей ствий здесь достигает максимума [47]. Первые описания патологии кластеризации протеомных сетей в функциональ ных модулях описаны для клеток сетчатки (пигментозный ретинит), нервных клеток (болезнь Альцгеймера, боковой амиотрофический склероз), коронарного атеросклероза, диабета II типа, некоторых видов эпителиального рака [48].
Изучение базовой и функциональной организации про теомных сетей в рамках одного функционального модуля дифференцированных клеток или регуляторного модуля на уровне эмбриональных столовых клеток требует организа ционных, финансовых и людских творческих усилий в объеме, не меньшем, чем программа «Геном человека».
Как и витализм в XIX веке, редукционизм XX века исчер пал свои лидирующие творческие возможности в пост ге номную эпоху. Новые глобальные идеи клеточной биологии требуют масштабных финансовых затрат и пристального внимания государства во имя нашего общего будущего.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Harrison R.G. Further experiments on the development of peripheral nerves. Am. J. Anat. 1906; 5: 121 31.
2. Harrison R.G. The outgrowth of the nerve fiber as a mode of protoplasmic movement. J. Exp. Zool. 1910; 9: 787 46.
3. Landecker H. New times for biology: nerve culture and the advent of cellular life in vitro. Stud. Hist. Phil. Biol. Biomed. Sci. 2002; 33: 667 94.
4. Fell H.B. Tissue culture and its contribution to biology and medicine. J. Exp. Biol. 1972; 57: 1 13.
5. Steinberg M.S. Mechanism of tissue reconstruction by dissociated cells II. Time course of events. Science 1962; 137: 762 63.
6. Steinberg M.S. Reconstruction of tissues by dissociated cells. Some morphogenetic tissue movements and the sorting out of embryonic cells may have a common explanation. Science 1963; 141: 401 8.
7. Shastri V.P. Future of Regenerative Medicine: challenges and hurdles. Art. Organs 2006; 30: 828 34.
8. Vogel V., Scheetz M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2006; 7: 265 71.
9. Osawa F. Loose coupling mechanism in molecular machines of living cells. Genes to Cells 2000; 5: 9 16.
10. Rodamilans B., Ibanez S., Bragado Nilsson E. et al. Expression, purification ans crystallization of human CD5 domain III, a nanoscale cristallization example. J. Struct. Biol. 2007; 159: 144 8.
11. Wood W., Martin P. Structures in focus - filopodia. Int. J. Biochem. Cell Biol. 2002; 34: 726 30.
12. Dalby M.J., Gadegaard N., Riehle M.O. et al. Investigating filopodia sensing using arrays of defined nano pits down to 35 nm diameter in size. Int. J. Biochem. Cell Biol. 2004; 36: 2005 15.
13. Haruyama T., Asakawa H., Migita S. et al. Bio , nano technology for cellular biosensing. Curr. Appl. Physics. 2005; 5. 108 11.
14. Curtis A., Wilkinson C. New depth in cell behavior: reactions of cells to nanotopography. Biochem. Soc. Symp. 1999; 65: 15 26.
15. Gatenby R.A., Frieden B.E. Information theory in living systems, methods, applications, and challenges. Bull. Math. Biol. 2007; 69: 635 57.
16. Loewenstein W.L. The Touchstone of Life. 1999: Oxford Univ. Press.
17. Drexler K.E Building molecular machine systems. TIBTECH 1999; 17:5 8.
18. Hartwell K.A., Muir B., Reinhardt F. Spemann organiser gene goosecoid promotes tumor metastases. PNAS 2006; 103: 18969 74.
19. Beddington R.S. Induction of a second neural axis by the mouse node. Dev. 1994; 120:613 20.
20. Beddington R.S., Robertson E.J. Axis development and early asymmetry in mammals. Cell 1999; 96: 195 209.
21. Weiss P., Garber B. Shape and movement of mesenchymal cells as functions of the physical structure of the medium - contributions to a quantitative morphology. PNAS 1952; 38: 264 80.
22. Dunn G.A., Heath J.P. New hypothesis of contact guidance in tissue cells. Exp. Cell Res. 1976; 101: 1 14.
23. Васильев Ю.М. Клетка как архитектурное чудо. 1. Живые нити. Сорос. Образ. Журнал 1996; 2: 36 43.
24. Васильев Ю.М. Клетка как архитектурное чудо. 2. Цитоскелет, способный чувствовать и помнить. Сорос. Образ. Журнал 1996; 4: 4 10.
25. Васильев Ю.М. Социальное поведение нормальных и асоциальное поведение опухолевых клеток. 3. Клетки строят ткань. Сорос. Образ. Журнал 1997; 5: 20 25.
26. Александров В.Я. Проблема поведения на клеточном уровне [цитозтология). Успехи соврем, биологии 1970; 69[2): 22040.
27. Энгельгардт В.А. Интегратизм путь от простого к сложному в познании явлений жизни. В кн.: Материалы к 2 му Всесоюз. совещ. по филос. вопр. соврем. Естествознания. М.: Ин т философии АН СССР; 1980.
28. Энгельгардт В.А. Клетки на службе медицины. В кн.: Фундаментальные науки медицине. М.; 1981.
29. Arnoys E.J., Wang J.L Dual localization: proteins in extracellular and intracellular compartments. Acta Histochem. 2006; 14: 295 305.
30. Williams D.F. To engineer is to create: the link between engineering and regeneration. Trends Biotechnol. 2006; 24: 4 8.
31. Strohmann R. Maneuvring in the complex path fromgenotype to phenotype. Science 2002; 296: 701 3.
32. Репин B.C., Сабурина И.Н., Сухих Г.Т. Клеточная биология фетальных тканей и медицина. Клеточные технологии в биологии и медицине. 2007; 3:123 33.
33. Bruggman F.J., Westerhoff V.H. The nature of systems biology. Trends Microbiol. 2007; 15: 45 59.
34. Baharvand H, Fathi A., van Hoof D. et al. Concise Review: trends in stem cell proteomics. Stem Cells 2007; 25: 1888 903.
35. Wolkenhauer 0., Mesarovich М., Well stead P. A plea for a more theory in molecular biology. Ernst Shering Res. Found. Workshop 2007; 61:117 37.
36. Schlosser G., Wagner G. eds. Modularity in Development and Evolution.. Chicago: Univ. Chicago Press; 2004.
37. Ravazh E., Somera A.L., Mongru D.A. et al. Modularity in metabolic networks. Science 2002; 297: 1552 6.
38. Allen C.E. The «Eyespot Module» and eyespots as modules: development, evolution, and integration of a complex phenotype. J. Exp. Zool. B. Mol. Dev. Evol. 2007; in press.
39. Li L, Zhu Q., Sinha S. et al. Large scale analysis of transcriptional cis regulatory modules reveals both common features and distinct subclasses. Genome Biol. 2007; 8: R101 4.
40. lii M.S., Gianneschi N.C., Oliveri C.G. et al. Allosterically Regulated Supramolecular Catalysis of Acyl Transfer Reactions for Signal Amplification and Detection of Small Molecules. J. Am. Chem. Soc. 2007; in press.
41. Del Sol A., Arauzo Bravo M.J., Amaros D. et al. Modular architecture of protein structures and allosteric communications: potential implications for signaling proteins and regulatory linkages. Genome Biol. 2007; 8: R92 9.
42. Wagner W., Feldmann R.E., Seckinger A. et al. The heterogeneity of
human mesenchymal stem cell preparations..........evidence from simultaneous
analysis of proteomes and transcriptomes. Exp. Haematol. 2006; 34: 536 48.
43. Sharan N., Maron Katz A., Shamir R. CLICK and EXPANDER: a system for clustering and visualizing gene expression data. Bioinformatics 2003; 19: 1787 99.
44. Alako B.I., Veldhoven A., van Baal S. et al. CoPub Mapper: mining MEDLINE based on search term со publication. BMC Bioinformatics 2005; 6: 51 6.
45. Feng W., Henning P., Wang M.D. EGOMiner: a comprehensive genomics and proteomics data analysis and biological function interpretation system. Conf. Proc. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 2004; 4: 2809 12.
46. Weniger М., Engelmann J.G., Schultz J. Genome Expression Pathway
Analysis Tool...analysis and visualization of microarray gene expression data
under genomic, proteomic and metabolic context. BMC Bioinformatics 2007; 8: 179 89.
47. Wagner A. A computational «genome walk» technique to identify regulatory interactions in gene networks. Рас. Symp. Biocomput. 1998; 264: 78.
48. Lage K., Karlberg E., Storling Z.M. et al. A human phenome interactome network of protein complexes implicated in genetic disorders. Nat. Biotechnol. 2007; 25: 309 16.
Поступила 24.08.2007
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, № 3, 2007
