CC BY
20
ОРИГИНАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
© Коллектив авторов, 2011 г. УДК 612.82:612.015.1]-092.4
Н. С. Щербак, Д. А. Овчинников,
A. Н. Кузьменков, Е. Р. Баранцевич,
B. В. Томсон, Е. В. Шляхто
КЛЕТОЧНОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ И АКТИВНОСТЬ ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ В ОТДЕЛЬНЫХ СТРУКТУРАХ ГОЛОВНОГО МОЗГА ПЕСЧАНОК МОНГОЛЬСКИХ (МегюпеБ иадшсШаШв)
Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова; Федеральный центр сердца, крови и эндокринологии имени В. А. Алмазова, Санкт-Петербург
ВВЕДЕНИЕ
Острые и хронические нарушения мозгового кровообращения являются актуальной проблемой современной медицины, одной из ведущих причин инвалидиза-ции и смертности населения во всем мире. Разработка новых препаратов для фармакотерапии этих состояний является одной из активно развивающихся отраслей фармацевтики. Важным этапом внедрения новых лекарственных форм является их доклиническая апробация. Однако многие лекарственные препараты с доказанной в эксперименте цитопротективной активностью для защиты головного мозга от ишемического и реперфузионного повреждения нередко оказываются малоэффективными в клинической практике. Это может быть обусловлено рядом моментов, среди которых следует выделить неадекватность используемых моделей, нередко - явно недостаточное представление о физиологических и морфологических особенностях органов и систем используемого экспериментального животного, невозможность воспроизведения в полной мере в эксперименте патологических процессов, свойственных человеческому организму, и др.
Песчанки монгольские (Мегюпея ыщшеыШш) (далее - песчанки) в 1966 г. впервые были предложены в качестве объекта экспериментального исследования для моделирования ишемии головного мозга и с тех пор довольно активно используются зарубежными исследователями [10], в меньшей степени - отечественными [7]. Анатомической особенностью кровоснабжения головного мозга песчанок является незамкнутый виллизиев круг. Окклюзия общих сонных артерий головного мозга позволяет создавать обратимую ишемию переднего мозга, т. е. экспериментально воспроизводить ситуацию, близкую к клинической практике, в виде нарушения кровообращения головного мозга.
Несмотря на достаточно широкое использование песчанок в качестве объекта экспериментальных исследований, остаются не изученными некоторые особенности морфофункционального состояния ткани головного мозга, в частности, состояние ферментных систем нейронов и нейроглии, прежде всего, активности ключевых окислительно-восстановительных ферментов как наиболее уязвимого звена при ишемии головного мозга. Динамика активности указанных ферментов может служить достаточно чувствительным маркером состояния клеток в условиях нарушенного доступа кислорода.
Цель исследования - изучить распределение нейронов и оценить в них активность ключевых окислительно-восстановительных ферментов сукцинатдегидрогеназы (СДГ) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в коре и гиппокампе головного мозга песчанки монгольской (Meriones unguiculatus).
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Все эксперименты были проведены в соответствии с «Руководством по уходу и использованию лабораторных животных» (публикация Национального Института Здоровья, США № 85-23) и были одобрены локальным этическим комитетом. Исследование проводилось на песчанках-самцах массой 60-80 г (Ленинградский Зоологический парк, Санкт-Петербург), содержащихся в условиях 12/12-часового свето-темнового режима и получавших стандартный корм и воду ad libitum.
Животных первой группы (n=8) наркотизировали хлоралгидратом (450 мг/кг, внутрибрюшинно), извлекали мозг из полости черепа и нарезали на сегменты, используя фронтальную матрицу для головного мозга мелких грызунов (WPI США). Сегмент, содержащий зону гиппо-кампа, фиксировали 10 %-м нейтральным формалином и заливали в парафин по общепринятой методике. Фронтальные срезы толщиной 7 мкм, соответствующие сте-реотаксическому атласу песчанки монгольской (bregma 1,5-1,9 mm) [11], для получения обзорной характеристики анатомических структур мозга окрашивали гематоксилин-эозином и по методу Ниссля. В гистологических образцах от каждого животного проводили морфометрию по-клеточно пирамидальных нейронов в полях СА1, СА2, СА3 и СА4 гиппокампа. Относительный объем клеток в 3-х слоях коры головного мозга: в наружном зернистом (слой II), в слое наружных пирамидальных нейронов (слой III), во внутреннем пирамидальном слое (слой V) на гистологических срезах определяли с помощью сетки по методу Вайбеля [13].
У животных второй группы (n=8) аналогичным образом, используя фронтальную матрицу для головного мозга мелких грызунов, выделяли сегменты головного мозга, содержащие гиппокамп, затем ступенчато замораживали через охлажденный изооктан в жидком азоте. С помощью криостата (при -20 оС) готовили срезы мозга во фронтальной плоскости толщиной 10 мкм, соответствующие стереотаксическому атласу песчанки (bregma 1,51,9 mm) [11] и выявляли стандартными гистоэнзимологи-
УЧЕНЫЕ ЗАПИСКИ СПбГМУ ИМ. АКАД. И. П. ПАВЛОВА • ТОМ XVIII • N04 • 2011
ческими методами с применением солеи тетразолия [3, 5] активность двух окислительно-восстановительных ферментов сукцинатдегидрогеназы и лактатдегидрогена-зы. Для выявления продукта реакции использовали растворы субстратов к ЛДГ - лактат № (Мыса, Германия), к СДГ- сукцинат № (Мыса, Германия). Оптическую плотность продуктов реакции в клетках головного мозга количественно в условных единицах определяли на цитоспек-трофотометре плаг-методом при увеличении х280, площадь зонда - 0,785 мкм2, длина волны - 546 нм [1, 3]. Активность ферментов оценивали в цитоплазме клеток пирамидального слоя полеИ СА1, СА2, СА3 и СА4 гиппо-кампа, а также в цитоплазме клеток 3-х слоев коры головного мозга: в слое II - наружном зернистом; в слое III -наружных пирамидальных неИронов; в слое V - внутреннем пирамидальном.
Результаты обрабатывались статистически, с вычислением среднеИ арифметической, ошибки среднеИ, дисперсии. Достоверность различии оценивали с помощью критерия Стьюдента, различия учитывались как достоверные при Р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Гистологическое исследование фронтальных срезов головного мозга песчанок монгольских Merion.es ыngыicыlatыs показало, что у животных структура коры головного мозга и гиппокампа типична для головного мозга грызунов [4]. Цитоархитектоническое строение коры характеризуется наличием всех 6 слоев клеток, которые присущи всем млекопитающим. МорфометрическиИ анализ слоя II - наружного зернистого - показал, что неИ-роны и клетки глии занимали 37,1 ±2,69 % объема, слоИ характеризовался наличием большого количества мелких и средних неИронов. СлоИ III - наружных пирамид альных неИронов - состоял в основном из пирамидальных неИронов средних размеров, все клетки составляли 38,9±3,46 % от объема слоя. Объем клеток, составлявшиИ слоИ V -внутренниИ пирамидальныИ - занимал 39,4±3,58 % и был представлен в основном крупными и гигантскими неИ-
Распределение ферментативной активности лактатдегидрогеназы и сукцинатдегидрогеназы в структурах головного мозга песчанки монгольской (теНопеэ unguiculatus)
Структура головного мозга Ферментативная активность (в условных единицах плотности)
лактатдегидрогеназа сукцинатдегидрогеназа
Кора:
слой II 0,24±0,048 0,48±0,122
слой III 0,29±0,061* 0,60±0,121
слой V 0,23±0,051 0,45±0,058
Гиппокамп:
поле СА1 0,26±0,057 0,47±0,099 ,
поле СА2 0,25±0,067 0,54±0,111
поле СА3 0,24±0,045 0,57±0,071
поле СА4 0,21±0,059** 0,52±0,014
* р<0,01, при сравнении со слоями коры; ** р<0,01, при сравнении с полями гиппО' кампа; р<0,01, при сравнении всех слоев коры между собой; р<0,01, при сравнении с полями СА2 и СА3; р<0,05 при сравнении с полем СА4; р<0,01 при срав-нении с полем СА3; р<0,05 при сравнении с полем СА4.
ронами. Для изучаемой области коры головного мозга было характерно преимущественное развитие слоев I и V-VI и практически отсутствие слоя IV. Уровень нейронной дифференцировки был достаточно низок, что подтверждается данными других авторов при анализе цито-архитектоники коры головного мозга грызунов [4]. Известно, что в разных отделах и участках полушарий кора значительно варьирует по общей толщине и толщине составляющих ее слоев, количеству этих слоев и подслоев, числу, плотности и размерам нейронов [2]. Среди млекопитающих из разных отрядов отмечается очень высокая степень цитоархитектонической вариабельности одноименных полей. Это касается как площади полей, так и их границ и конфигурации, ширины отдельных слоев, плотности клеток [4]. Количественные данные о распределении клеток в трех слоях фронтальной области коры головного мозга песчанки монгольской, соответствующей сте-реотаксическому атласу (bregma 1,5-1,9 mm), описаны впервые.
При морфометрическом анализе пирамидального слоя гиппокампа наблюдалась клеточная гетерогенность разных полей и вариабельность по числу нейронов. Для поля СА1 характерно плотное расположение большого количества мелких пирамидных нейронов (241±10) в 4-5 слоев клеток и имеющих ровную и округлую форму клеточных тел. Поле СА2 гиппокампа также состояло из 4-5 рядов нейронов (92±7), но более крупных, чем в поле СА1, и расположенных достаточно плотно, между пирамидальными нейронами располагались клетки глии. В поле СА3 слой пирамидальных нейронов был представлен наиболее крупными нейронами по сравнению с другими зонами, неплотно расположенными в 5-6 рядов (96±8), а зона СА4 имела слой крупных не плотно расположенных пирамидальных нейронов толщиной 3-4 рядов клеток (104± 11). Наше исследование строения гиппокампа подтвердило имеющиеся данные других авторов о сходстве строения указанных областей у песчанок и крыс [6, 9].
При гистоэнзимологическом исследовании была выявлена неоднородность распределения клеток с активностью ЛДГ и СДГ в различных слоях коры головного мозга и в полях гиппокампа (таблица). В клетках коры головного мозга наибольшая активность ЛДГ регистрируется в нейронах III слоя (0,29±0,061 условные единицы). В клетках двух остальных исследованных слоев - второго и пятого - активность указанного фермента была сравнима и составила 0,24±0,048 и 0,23±0,051 условных единицы соответственно. Наибольшая активность фермента СДГ наблюдалась в нейронах наружного зернистого (III) слоя (0,60±0,121 условные единицы). В клетках наружного пирамидального и внутреннего пирамидального слоев коры головного мозга активность СДГ была значимо меньше и составила
ОРИГИНАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
0,48±0,122 и 0,45±0,058 условные единицы соответственно (таблица).
В разных зонах гиппокампа также наблюдались свои особенности распределения клеток с разной активностью исследованных ферментов. Наиболее низкая активность фермента ЛДГ наблюдалась в нейронах поля СА4 и составляла 0,21±0,059 условные единицы. В клетках других полей гиппокампа активность ЛДГ была выше и наибольшее ее значение отмечалось в поле СА1 (0,26±0,057 условные единицы) (таблица). Из результатов, представленных в таблице, которые характеризуют распределение активности ЛДГ, следует, что ферментативная активность неодинакова в пределах отдельных структур головного мозга и максимум ее активности регистрируется в III слое коры и минимум в поле СА4 гиппокампа. Уровень ферментативной активности ЛДГ в различных областях может зависеть от различной интенсивности протекания окислительно-восстановительных реакций в отдельных структурах головного мозга, а также, возможно, может быть связан с особенностями нейроно-глиальных контактов в этих областях. Можно полагать, что выявленная активность ЛДГ, неоднозначная в клетках исследованных полей гиппокампа, косвенно свидетельствует и о различной заинтересованности элементов гиппокампа в функционировании лактатного астроцит-нейронного шунта, ответственного, по мнению некоторых авторов, за долгосрочную память, где именно лактат является главным элементом нейрон-глиальных метаболических взаимодействий [8, 12].
При сравнении активности фермента СДГ в клетках разных полей гиппокампа также были обнаружены достоверные различия. Самая низкая активность регистрировалась в клетках поля СА1 и составляла 0,47±0,099 условные единицы, что значимо отличалось от активностей регистрируемых в клетках полей СА2 и СА3 (р<0,01), а также поля СА4 (р<0,05). В клетках поля СА3 интенсивность реакции была достоверно выше (р<0,01) при сравнении с другими полями и составляла 0,57±0,071 условные единицы. Однако при сравнении полей СА2 и СА4 различий в ферментативной активности СДГ обнаружено не было (р>0,05) (таблица). Таким образом, клетки с разной активностью СДГ в пределах одной структуры головного мозга - гиппокампа - распределяются неоднородно, их мозаика существенно изменяется в зависимости от топографии поля. Исходя из полученных результатов, следует, что в клетках различных слоев коры и полей гиппокампа интенсивность протекания окислительно-восстановительных реакций неодинакова. Она, возможно, существенно связана с функциональными задачами конкретной области, и клетки этих зон могут по-разному отвечать на различные физиологические состояния: гипотермия, гипертермия, ишемия и т. д.
Ишемическое и реперфузионное повреждение головного мозга сопровождается изменением скорости протекания окислительно-восстановительных реакций и приводит к сдвигам активности ферментов, вовлеченных в эти процессы. Однако необходимо учитывать, что адек-
ватность выводов и суждений, полученных в эксперименте, об изменении метаболизма тканей головного мозга в ответ на повреждение - ишемическое или реперфузионное, а также на эндогенные и фармакологические способы нейропротекции возможна при достаточной полноте знаний об особенностях протекании этих процессов в интактном организме, чему, собственно, и было посвящено это исследование.
Таким образом, в исследовании впервые получены сведения о количественном распределении нейронов в разных слоях коры головного мозга и полях гиппокампа песчанки монгольской и выявленной в них активности ключевых ферментов цикла Кребса - СДГ и ЛДГ. Эти результаты могут быть использованы при решении экспериментальных задач по изучению метаболической характеристики и морфологических изменений коры и гиппокампа при некоторых патологических процессах.
ЛИТЕРАТУРА
1. Агроскин, Л. С. Цитофотометрия / Л. С. Агроскин, Г. В. Папаян. - Л. : Наука, 1977. - 295 с.
2. Адрианов, О. С. О принципах структурно-функциональной организации мозга (избранные труды) / О. Адрианов. - М. : Медицина, 1999. - 237 с.
3. Журавлева, Т. Б. Введение в количественную гистохимию ферментов / Т. Б. Журавлева, Р. А. Прочуханов. - М. : Медицина,
1978. - 238 с.
4. Обухов, Д. К. Современные представления о развитии, структуре и эволюции неокортекса конечного мозга млекопитающих животных и человека / Д. К. Обухов // Вопросы морфологии XXI века : сб. науч. тр., посвященный 100-летию кафедры мед. биологии СПбГМА им. И. И. Мечникова. - 2009. - Вып. 1. -С. 200-223.
5. Пирс, Э. Гистохимия теоретическая и прикладная / Э. Пирс. -М. : Изд-во иностранной литературы, 1962. - 962 с.
6. Шаповалова, В. В. Структурно-функциональная организация пирамидного слоя гиппокампа правого и левого полушарий мозга белых крыс в норме и в восстановительном периоде после острой тотальной ишемии : автореф. дис.... канд. мед. наук / В. В. Шаповалова. - Томск, 2008. - 24 с.
7. Щербак, Н. С. Эффект ишемического посткондиционирования при экспериментальной глобальной ишемии головного мозга / Н. С. Щербак [и др.] // Артериальная гипертензия. - 2011. -Т. 17. - № 2. - С. 182-188.
8. Dalsgaard, M. K. A reduced cerebral metabolic ratio in exercise reflects metabolism and not accumulation of lactate within the human brain / M. K. Dalsgaard [et al] // J. Physiol. - 2004. - № 554 (Pt 2). -Р. 571-578.
9. Kaundal, R. K. Protective effects of pioglitazone against global cerebral ischemic-reperfusion injury in gerbils / R. K. Kaundal [et al] // J. Pharmacol Sci. - 2009. - № 109 (3). - Р. 361-367.
10. Levine, S. Effects of ischemia and other procedures on the brain and retina of the gerbil (Meriones unguiculatus) / S. Levine, H. Payan // Exp. Neurol. - 1966. - № 16 (3). - Р. 255-262.
11. Loskota, W. J. A Stereotaxic Atlas of the Mongolian Gerbil Brain. / W. J. Loskota [et al]. - Ann Arbor Science Publishers, Ann Arbor, Mich., USA, 1974. - 234 p.
12. Suzuki, A. Astrocyte-neuron lactate transport is required for long-term memory formation / A. Suzuki [et al] // Cell. - 2011. -№ 4. - P. 810-823.
13. Weibel, E. R. Stereological Methods. Vol. I : Practical Methods for Biological Morphometry / E. R. Weibel. - London ; N.-Y. ; Toronto,
1979. - 415 p.
УЧЕНЫЕ ЗАПИСКИ СПбГМУ ИМ. АКАД. И. П. ПАВЛОВА • ТОМ XVIII • №4 • 2011
РЕЗЮМЕ
Н. С. Щербак, Д. А. Овчинников, А. Н. Кузьменков, Е. Р. Баранцевич, В. В. Томсон, Е. В. Шляхто
Клеточное распределение и активность окислительно-восстановительных ферментов в отдельных структурах головного мозга песчанок монгольских (твгюпвБ ищшеиШт)
Изучены морфофункциональные особенности коры головного мозга и гиппокампа интактных песчанок монгольских (Мепопея ыщыкыЫыя). Получены сведения о количественном распределении неИронов в разных полях гиппокампа и в некоторых слоях коры головного мозга песчанки монгольскоИ и выявленноИ в них активности ключевых ферментов цикла Кребса сукцинатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы. Результаты, полученные авторами, могут быть использованы при решении экспериментальных задач по изучению метаболическоИ характеристики и морфологических изменениИ коры и гиппокампа песчанок монгольских при некоторых патологических процессах.
Ключевые слова: лактатдегидрогеназа, сукцинатдегидроге-наза, головноИ мозг, песчанка монгольская.
SUMMARY
N. S. Shcherbak, D. A. Ouchinnikou, A. N. Kuzmen-koo, E. R Barantseoich, V. V. Tomson, E V. Shlyakhto
Cellular distribution and activity of redox enzymes in separate structures of brain mongolian gerbils (meriones ungui-culatus)
Morpho-functional features of the cerebral cortex and hippocampus in Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus) was studied. Received information on the quantitative distribution of neurons in different fields of the hippocampus and in certain layers of the cerebral cortex in Mongolian gerbils and identified them in the activity of key enzymes of the Krebs cycle succinate dehydrogenase and lactate dehydrogenase. The results obtained by the authors may be used in solving experimental problems in studying the metabolic characteristics and morphological changes in the cortex and hippocampus in Mongolian gerbil under certain pathological processes.
Key words: lactate dehydrogenase, succinate dehydrogenase, brain, Mongolian gerbil.
© И. П. Артюхов, М. М. Петрова, И. О. Логинова, Д. С. Каскаева, 2011 г. УДК 378.12:614
И. П. Артюхов, М. М. Петрова, И. О. Логинова, Д. С. Каскаева
ФОРМИРОВАНИЕ ЗДОРОВОГО ОБРАЗА ЖИЗНИ ПРЕПОДАВАТЕЛЕЙ КАК ИДЕОЛОГИЯ УПРАВЛЕНИЯ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЙ СРЕДОЙ ВУЗА
КрасноярскиИ государственныИ медицинскиИ университет имени профессора В. Ф. ВоИно-Ясенецкого
Здоровье каждого человека - не только его благо, но и необходимое условие роста производительности труда, экономическоИ мощи страны, благосостояния народа. Сохранить и продлить здоровую жизнь возможно только благодаря здоровому образу жизни, которыИ подразумевает рациональные физическую активность и питание, контроль над стрессом, исключение вредных привычек, а также применение оздоровительных методик. При этом важны систематичность оздоровительных мероприятиИ, а также мотивация для соблюдения требованиИ здорового образа жизни.
В настоящее время актуальноИ задачеИ является сохранение капитала здоровья сотрудников для повышения эффективности соответствующеИ сферы общественного производства (образование, здравоохранение) через внедрение и развитие здорового образа жизни.
Приоритетными направлениями в концепции Красноярского государственного медицинского университета им. профессора В. Ф. ВоИно-Ясенецкого выступают создание
здоровьесберегающей среды для физического, психического и нравственного развития личности и формирование мотивации к здоровому образу жизни у преподавателей и работников университета через физкультурно-оздоровительную и образовательно-воспитательную работу.
Работа в университете по формированию культуры здоровья и здорового образа жизни базируется на следующих принципах:
- непрерывности и преемственности, который определяет необходимость проводить работу систематически и регулярно;
- комплексного междисциплинарного подхода, основанного на интеграции вопросов здоровья в различные учебные программы;
- формирования ответственности преподавателей и работников КрасГМУ за свое здоровье, поведение и жизнь;
- использования современных информационных технологий при формировании сберегающей здоровье среды университета;
- доступности медицинских, оздоровительных и образовательных услуг преподавателям и сотрудникам, особенно с ограниченными физическими возможностями;
- контроля и оценки результатов, основанных на получении обратной связи, благодаря различным видам диагностики и самодиагностики;
- сочетания охранительной и тренирующей стратегии (охранительная стратегия связана с реализацией правила «не навреди», а тренирующая направлена на повышение адаптационных возможностей организма);
- дифференцированного подхода к организации мероприятий по совершенствованию физкультурно-массовой и спортивной работы в университете с учетом специфики и целевой установки на развитие массовой физической культуры и спорта высших достижений;
