CC BY
19
https://doi/org/10.33647/2074-5982-17-3-48-55
(«0
BY 4.0
КЛЕТОЧНАЯ ТЕРАПИЯ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ ПОВРЕЖДЕНИЙ ЖКТ У БИОМОДЕЛИ С НПВС-ИНДУЦИРОВАННЫМ ЭНТЕРОКОЛИТОМ
Р.А. Клёсов1*, О.И. Степанова1, В.Н. Каркищенко1, О.В. Баранова2
1ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России» 143442, Российская Федерация, Московская обл., Красногорский р-н, п. Светлые горы, 1
2 ФГАУ «Национальный медицинский исследовательский центр "Лечебно-реабилитационный центр"» Минздрава России 125367, Российская Федерация, Москва, Иваньковское ш., 3
Для клеточной терапии у крыс Wistar с НПВС-индуцированным декскетопрофеном хроническим энтероколитом ЖКТ внутрибрюшинно двукратно с интервалом 30 дней трансплантировали культивированную аллогенную суспензию клеток, состоящую из фракций мононуклеарных клеток (40 млн) и мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (10 млн). Культивированные аллогенные фракции клеток костного мозга ускоряют процессы регенерации длительно незаживающих язв ЖКТ за счет сокращения сроков и выраженности воспалительной фазы и активизации регенераторной фазы язвенного процесса. Установлено, что одновременное введение исследуемых культивированных стволовых клеток может использоваться для лечения хронических, длительно незаживающих, трудно рубцующихся язвенно-некротических патологий ЖКТ.
Ключевые слова: аллогенные фракции клеток костного мозга, трансплантация, ЖКТ, НПВС, крысы Конфликт интересов: авторы заявили об отсутствии конфликта интересов.
Для цитирования: Клёсов Р.А., Степанова О.И., Каркищенко В.Н., Баранова О.В. Клеточная терапия патологических повреждений ЖКТ у биомодели с НПВС-индуцированным энтероколитом. Биомедицина. 2021;17(3): 48-55. https://doi/org/10.33647/2074-5982-17-3-48-55
Поступила 01.04.2021
Принята после доработки 23.07.2021
Опубликована 10.09.2021
CELL THERAPY OF PATHOLOGICAL GASTROINTESTINAL LESIONS IN MODELED NSAID-INDUCED ENTEROCOLITIS
Roman A. Klesov1*, Olga I. Stepanova1, Vladislav N. Karkischenko1, Oksana V. Baranova2
1 Scientific Center of Biomedical Technologies of the Federal Medical and Biological Agency of Russia 143442, Russian Federation, Moscow Region, Krasnogorsk District, Svetlye Gory Village, 1
2 National Medical Research Center "Treatment and Rehabilitation Center■" of the Ministry of Health Care of Russia 125367, Russian Federation, Moscow, Ivan'kovskoe Highway, 3
IWistar rats with NSAID-induced (dexketoprofen) chronic enterocolitis of the gastrointestinal tract were treated with a cultured allogeneic cell suspension consisting of mononuclear cells (40 millions) and multipotent mesenchymal stromal cells (10 millions). The suspension was transplanted intraperitoneally, 2 times with an interval of 30 days. Cultured allogeneic fractions of bone marrow cells accelerate the regeneration of long-term non-healing gastrointestinal lesions by reducing the duration and severity of the inflammatory phase and activating the regenerative phase of the ulcerative process. It was found that the simultaneous ad-
ministration of the studied cultured stem cells can be used for the treatment of chronic, long-term non-healing, poorly-scarring ulcerative necrotic gastrointestinal pathologies.
Keywords: allogeneic fractions of bone marrow cells, transplantation, gastrointestinal tract, NSAIDs, rats Conflict of interest: the authors declare no conflict of interest.
Fof citation: Klesov R.A., Stepanova O.I., Karkischenko V.N., Baranova O.V. Cell Therapy of Pathological Gastrointestinal Lesions in Modeled NSAID-Induced Enterocolitis. Journal Biomed. 2021;17(3):48-55. https://doi/org/10.33647/2074-5982-17-3-48-55
Submitted 01.04.2021 Revised 23.07.2021 Published 10.09.2021
Введение
Наш предварительный опыт и данные немногочисленных литературных источников дают возможности повышать неспецифическую резистентность организма методами клеточной терапии и элементами клеточного метаболизма как способа лечения и профилактики заболеваний ЖКТ.
Для клеточной трансплантации используют гемопоэтическую или стромальную фракции клеток аутологичного костного мозга (КМ), которые содержат стволовые и прогениторные клетки [9]. Эффективность гемопоэтических клеток КМ обусловлена иммунорегуляторной активностью выделяемых ими биорегуляторных пептидов. Эффективность стромальной фракции клеток КМ обусловлена не только тем, что эти клетки секретируют широкий спектр ци-токинов и ростстимулирующих факторов, но и тем, что, являясь предшественниками мультипотентных мезенхимальных стро-мальных клеток (ММСК), они способны активно пролиферировать в культуре, дифференцироваться в мезенхимальные клетки других фенотипов и непосредственно участвовать в процессах восстановительной регенерации поврежденных тканей [6, 10]. Кроме того, известно, что ММСК КМ могут участвовать в регуляции дифферен-цировки Т-клеток, вызывают супрессию пролиферации эффекторных клеток (цито-токсических Т-лимфоцитов, натуральных киллеров), а также ограничивают диффе-ренцировку дендритных клеток [7, 8], спо-
собствуя ингибированию системной воспалительной реакции.
На модели аутоиммунной длительно незаживающей язвы желудка на крысах изучены иммунопатологические механизмы развития хронической язвы в слизистой оболочке желудка с применением ММСК и мононуклеарных клеток (МНК) аутоло-гичного костного мозга для ускоренной регенерации аутоиммунных длительно незаживающих язв ЖКТ (ДНЯ ЖКТ), выявлена предпочтительность (более высокая эффективность) ММСК. Установлено, что трансплантированные ММСК и МНК КМ обеспечивают более качественную и быструю регенерацию язв желудка за счет стимуляции неоангиогенеза и восстановления микроциркуляторного русла, улучшения процессов метаболической регуляции в системе «простагландины — циклические нуклеотиды», следствием чего становится ингибирование процессов усиленного апоптоза эпителиоцитов в слизистой оболочке желудка, и, как результат, повышение уровня противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови животных коррелирует со снижением активности апоптоза трансплантации ММСК и МНК КМ и может служить показателем качественной регенерации слизистой оболочки желудка, т. к. устраняются факторы прогрессирова-ния деструктивно-язвенного процесса [1]. Установлен терапевтический потенциал трансплантированных ММСК при остром и хроническом поражении кишечника, ин-
49
дуцированном натрий декстран-сульфатом, в лечении воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК) на крысах Wistar [2, 4].
Цель работы — трансплантация культивированных клеток аллогенного костного мозга разных фракций (МНК и ММСК) при одновременном их введении как новый метод терапии повреждений ЖКТ.
Материалы и методы
Работа выполнена на 50-ти крысах-самцах Wistar массой 250-300 г. Животные были получены из филиала «Андреевка» ФГБУН НЦБМТ ФМБА России и отобраны в эксперимент методом рандомизации. Эксперименты проводили в соответствии с приказом Минздрава России от 01.04.2016 г. № 199н «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики» и требованиями Федерального закона «О защите животных от жестокого обращения» от 01.09.1997 г.
При проведении экспериментальной клеточной терапии у животных с повреждениями ЖКТ готовили аллогенную суспензию клеток, состоящую из МНК и ММСК, которую трансплантировали двукратно с интервалом 30 дней животным экспериментальной группы внутрибрюшино с одновременным введением в количестве по 40 млн МНК и по 10 млн ММСК (общая доза — 80 млн МНК и 20 млн ММСК), на 30-е и 60-е сут после моделирования язвенного энтероколита.
Для культивирования первичной алло-генной культуры клеток КМ использовали ростовую среду DMEM c HEPES (Пан Эко), содержащую 10% бычьей эмбриональной сыворотки («HyClone», USA), 0,58 г/л глю -тамина, инсулин 0,4 мкМ, 0,25 мг/л гента-мицина.
Для идентификации специфичности клеток в культуре ММСК КМ использовали иммуногистохимический метод выявления коллагена I типа. Технологию подсче-
та культивированных аллогенных клеток костного мозга, окрашенных 0,4% р-ром трипанового синего, в соответствии с протоколом, проводили на автоматическом счетчике Countess II® (США). С целью получения высокой терапевтической индукции регенерации повреждений ЖКТ использовались культивированные алло-генные клетки МНК и ММСК с 96% выживаемостью клеток.
На 30-е и 90-е сут после трансплантации клеток изучали динамику эффективности регенерации повреждений ЖКТ и осуществляли оценку эффективности клеточной терапии гистологическими методами. Гистологические исследования были проведены на парафиновых срезах. Образцы тканей ЖКТ (пищевода, желудка, 12-перстной кишки, тощей, фрагменты из отдела толстого кишечника) фиксировались в 10% р-ре формалина в течение 24 ч. Далее на санном микротоме получали срезы толщиной 5-6 мкм, которые помещали на предметные стекла и высушивали. После депарафинирования полученные срезы окрашивали гематоксилин-эозином. Фазово-контрастную микроскопию материала проводили на микроскопе фирмы «NIKON» (Япония) с цифровым фотоаппаратом («OLYMPUS», Япония).
Результаты и их обсуждение
Для лечения хронического язвенного энтероколита была создана модель хронического НПВС-индуцированного язвенного энтероколита (декскетопрофеном) у лабораторных крыс Wistar и изучены патогенетические нарушения [3].
На 7-е сут после трансплантации культивированных аллогенных МНК и ММСК КМ была отмечена стабилизация массы тела экспериментальных животных. Через 45 дней после последнего одновременного введения двух фракций ККМ (ММСК и МНК) масса тела экспериментальных животных стабильно нарастала
и составляла 311±2,4 г, тогда как масса больных животных (без введения ККМ) в этот период составляла 236±2,0 г.
На 30-е сут после трансплантации с одновременным введением ММСК и МНК отмечалось достоверное уменьшение язвенных дефектов. В контрольной группе дно язвы покрыто тонким некротическим слоем и диффузно инфильтрировано лейкоцитами, в подлежащем слое созревающая грануляционная ткань имела частично упорядоченный ход коллагеновых волокон и умеренно выраженную воспалительную инфильтрацию гистиоцитами, лимфоцитами и нейтрофилами, в краях язвы выявлялись кистозно-расширенные железы, выстланные пролиферирующим эпителием (рис. 1А). В опытной группе отмечалась эпителизация язвенного дефекта желудка, в слизистой оболочке язвенных дефектов не выявлено, обнаружены лишь зоны, где определялись железистые полости, выстланные пролиферирующим эпителием. В подлежащей строме слизистой оболоч-
ки определяется фиброзная ткань с упорядоченным ходом коллагеновых волокон и слабо выраженной воспалительной лим-фоидно — гистиоцитарной инфильтрацией (рис. 1Б).
Клеточная терапия также оказала позитивные эффекты в тонком кишечнике. В контрольной группе слизистая оболочка с примесью незначительного количества круглых клеток, местами сохранены мелкие очаги некроза, некоторые переходят на подслизистый слой, неравномерно выраженная полиморфноклеточная инфильтрация подслизистого и мышечного слоев, местами плотная, с преобладанием нейтро-филов с распадом значительного их количества (рис. 2А). В опытной группе строение стенки тонкой кишки сохранено, ворсинки выражены, покрыты однослойным цилиндрическим каемчатым эпителием, отмечались отек стромы, выраженная диффузная воспалительная инфильтрация стромы ворсинок, представленная преимущественно лимфоцитами, с примесью небольшого
Рис. 1. Гистологическое строение желудка крыс на 30-е сут после трансплантации ККМ: А — после введения физ. р-ра (контроль без ККМ); Б — после трансплантации МНК и ММСК КМ. Окраска гематоксилин-эозином. Ув. х200.
Fig. 1. Histological structure of the rat stomach on the 30th day after transplantation of bone marrow cells: A — after the introduction of physical solution (control without bone marrow cells); E — after transplantation of mononuclear cells and multipotent mesenchymal stromal cells of bone marrow. Hematoxylin-eosin staining. Magn. x200.
А Б
Рис. 2. Гистологическое строение тонкой кишки крыс на 30-е сут после трансплантации ККМ: А — после введения физ. р-ра (контроль без ККМ); Б — после трансплантации МНК иММСККМ. Окраска гематоксилин-эозином. Ув. х100.
Fig. 2. Histological structure of the small intestine of rats on the 30th day after transplantation of bone marrow cells: A — after the introduction of physical solution (control without bone marrow cells); Б — after transplantation of mononuclear cells and multipotent mesenchymal stromal cells of bone marrow. Hematoxylin-eosin staining. Magn. x100.
количества гистиоцитов и плазматических клеток. Крипты выстланы также однорядным цилиндрическим каёмчатым эпителием, как и в ворсинках, отмечается выраженная митотическая активность эпителия крипт. Мышечная пластинка и подслизи-стый слой хорошо различимы. Мышечный слой представлен двумя слоями гладкомы-шечной ткани, внутренним циркулярным и наружным продольным. Серозная оболочка представлена одним слоем клеток мезотелия (рис. 2Б).
В толстой кишке у животных контрольной группы сохранялся некроз и десквама-ция клеток поверхностных участков слизистой оболочки, собственная пластинка слизистой оболочки отечная, с выраженной диффузной воспалительной инфильтрацией, распространяющейся на прилежащие отделы стенки, мышечная пластинка плохо выражена. Подслизистая основа отечная, с полнокровными сосудами. Мышечная оболочка слабо выражена, представлена двумя слоями гладкомышечных клеток — внутренним циркулярным и наружным продольным. Серозная оболочка представлена рыхлой волокнистой соединительной тканью, покрытой слоем клеток мезотелия
(рис. 3А). После трансплантаций ККМ у экспериментальных животных мышечная и серозная оболочка толстой кишки без изменений. В области слизистой оболочки и подслизистой основы прослеживалась выраженная очаговая воспалительная инфильтрация без полиморфноядерных лейкоцитов с формированием крупных, сливающихся лимфоидных фолликулов с выраженными регенераторными центрами (рис. 3Б).
На 30-е сут у животных контрольной группы язвенно-некротические дефекты сохранялись (воспалительная инфильтрация ткани нейтрофилами, лимфоцитами и умеренным количеством гистиоцитов). В опытной группе отмечалась эпителиза-ция язвенного дефекта (коллагеновая ткань с упорядоченным ходом коллагеновых волокон в подлежащей строме слизистой оболочки). Высокий темп регенерации язвенных дефектов при трансплантации был также обусловлен присутствием МНК и ММСК КМ в зоне язвенно-некротического дефекта. Сохраняя свою жизнедеятельность в области язвы, культивированные аллогенные МНК и ММСК обеспечивали продукцию биорегуляторных пептидов,
Рис. 3. Гистологическое строение толстой кишки крыс на 30-е сут после трансплантации ККМ: А — после введения физ. р-ра (контроль без ККМ), ув. х200; Б — после трансплантации МНК и ММСККМ, ув. х100. Окраска гематоксилин-эозином.
Fig. 3. Histological structure of the rat colon on the 30th day after transplantation of bone marrow cells: A — after the introduction of physical solution (control without bone marrow cells), magnification x200; Б — after transplantation of mononuclear cells and multipotent mesenchymal stromal cells of bone marrow, magnification x100. Hematoxylin-eosin staining.
которые способствовали восстановлению местного и системного гомеостаза и создавали адекватные условия для регенерации ДНЯ ЖКТ. Выявлена выраженная митоти-ческая активность эпителия крипт, что кос -венно подтверждает наличие репаративных (адаптационных) процессов с ускорением дифференцировки и миграции клеток в системе «крипта—ворсинка».
МНК и ММСК аллогенного КМ, длительно функционируя в зоне язвенно-некротического дефекта, становятся продуцентами не только дефицитных тканеспецифиче-ских пептидов, но и биологически активных веществ, которые при совместном воздействии на организм восстанавливают регуляцию межклеточного взаимодействия (цАМФ/цГМФ), что создает условия для ускоренного и качественного заживления патогенетических нарушений, характерных для хронического язвенного энтероколита ЖКТ. Известно, что ММСК КМ являются продуцентами ТвБр, который является важнейшим регулятором гемопоэза и иммунного ответа [5, 11].
Применение клеточной трансплантации оказывает выраженный противовоспалительный эффект. Благодаря широ-
кому спектру вырабатываемых клетками КМ пептидов, цитокинов, факторов роста и др. сигнальных молекул (до 174 различных факторов) восстанавливается баланс про- и противовоспалительных цитокинов. Устранение цитокинового дисбаланса после клеточной трансплантации создает условия для редукции иммунного воспаления и регуляции апоптоза эпителиоцитов, лимфоцитов и др. клеток, вовлеченных в воспалительный процесс в слизистой оболочке ЖКТ.
Выводы
Трансплантация культивированных алло-генных клеток костного мозга — монону-клеарных клеток и мультипотентных мезен-химальных стромальных клеток — при их одновременном введении является эффективным методом лечения длительно незаживающих, трудно рубцующихся язвенных повреждений ЖКТ, ускоряя процесс восстановительной регенерации в зоне язвенного дефекта, корригируя патологические изменения в организме и ликвидируя тем самым условия для их возникновения.
Ускорение процессов регенерации происходит за счет быстрой смены фаз язвенного
процесса (сокращения сроков и выраженности деструктивно-воспалительной фазы и активизации пролиферативно-регенера-торной фазы), стимуляции неоангиогенеза и восстановления микроциркуляторного
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ | REFERENCES
1. Аскаров М.Б., Трубицына И.Е., Богатырев С.Р., Онищенко Н.А. Аутологичные стромальные клетки костного мозга коррегируют факторы регуляции морфогенеза и ускоряют регенерацию длительно незаживающих язв желудка: Тез. докл. Ежегод. Всеросс. и межд. науч.-практ. конф. «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении». М., 2007:55-56. [Askarov M.B., Trubicyna I.E., Bogatyrev S.R., Onishchenko N.A. Autologichnye stromal'nye kletki kostnogo mozga korregiruyut faktory regulyacii morfogeneza i usko-ryayut regeneraciyu dlitel'no nezazhivayushchih yazv zheludka [Autologous stromal cells of the bone marrow correct factors regulating morphogenesis and accelerate the regeneration of long-term non-healing gastric ulcers]: Tez. dokl. Ezhegod. Vseross. i mezhd. nauch.-prakt. konf. «Stvolovye kletki i perspektiva ih ispol'zovaniya v zdravoohranenii» [Abstracts of report of Yearly All-Russian and Int. Scientific-practical Conf. "Stem cells and the prospect of their use in health care"]. Moscow. 2007:55-56. (In Russian)].
2. Князев О.В., Коноплянников А.Г., Лазебник Л.Б., Румянцев В.Г. Перспектива использования мезен-химальных стволовых клеток у больных с патологией органов пищеварения. Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. 2008;6:64-78. [Knyazev O.V., Konoplyannikov A.G., Lazebnik L.B., Rumyancev V.G. Perspektiva ispol'zovaniya mezen-himal'nyh stvolovyh kletok u bol'nyh s patologiej organov pishchevareniya [Prospects for the use of mesenchymal stem cells in patients with pathology of the digestive system]. Experimental and clinical gastroenterology. 2008;6:64-78. (In Russian)].
3. Клесов Р.А., Каркищенко В.Н., Степанова О.И., Баранова О.В. Сравнительное экспериментальное биомоделирование НПВС-индуцированного энтероколита. Биомедицина. 2020;1:65-81. [Klesov R.A., Karkischenko V.N., Stepanova O.I., Baranova O.V. Sravnitel'noe eksperimental'noe biomodelirovanie NPVS-inducirovannogo enterokolita [Comparative experimental biomodelling of NSAID-induced enterocolitis]. Biomeditsina [Journal Biomed]. 2020;1:65-81. (In Russian)].
4. Лазебник Л.Б., Князев О.В., Парфенов А.И., Ручкина И.Н., Ефремов Л.И. Успешное применение аллогенных мезенхимальных стволовых клеток у больного с язвенным колитом. Экспериментальная
русла, улучшения процессов метаболической регуляции, следствием чего становится ингибирование процессов усиленного апоптоза эпителиоцитов в слизистых оболочках ЖКТ.
и клиническая гастроэнтерология. 2009;4:112-115. [Lazebnik L.B., Knyazev O.V., Parfenov A.I., Ruchkina I.N., Efremov L.I. Uspeshnoe primenenie al-logennyh mezenhimal'nyh stvolovyh kletok u bol'no-go s yazvennym kolitom [Successful use of allogeneic mesenchymal stem cells in a patient with ulcerative colitis]. Experimental and clinical gastroenterology. 2009;4:112-115. (In Russian)].
5. Новик А.А., Камилова Т.А., Цыган В.Н. Введение в молекулярную биологию канцерогенеза. Под ред. Ю.Л. Шевченко. М.: ГЭОТАР-МЕД, 2004:224. [Novik A.A., Kamilova T.A., Tsygan V.N. Vvedenie v molekulyarnuyu biologiyu kancerogeneza [Introduction to the molecular biology of carcinogen-esis]. Ed. by Yu.L. Shevchenko. Moscow: GEOTAR-MED Publ., 2004:224. (In Russian)].
6. Потапов И.В., Ильинский И.М., Куренкова Л.Г. и др. Пленочные системы Эласто ПОБ с иммобили-зированными стромальными клетками костного мозга оптимизируют условия регенерации поврежденных тканей. Клеточные технологии в биологии и медицине. 2005;51(3):151-157. [Potapov I.V., Il'inskij I.M., Kurenkova L.G., et al. Plenochnye siste-my Elasto POB s immobilizirovannymi stromal'nymi kletkami kostnogo mozga optimiziruyut usloviya re-generacii povrezhdennyh tkanej [Film systems Elasto PHB with immobilized stromal cells of the bone marrow optimize the conditions for the regeneration of damaged tissues]. Kletochnye tekhnologii v biologii i meditsine [Cell technologies in biology and medicine]. 2005;51(3):151-157. (In Russian)].
7. Aggarwal S., Pittinger M.F. Human mesenchymal progenitor allogenic immune cell responses. Blood. 2005;105(4):1815-1822.
8. Assmus B., Schachinger V., Teupe C., et al. Transplantation of progenitor cells and regeneration enchancement in acute myocardial infarction. Circulation. 2002;206:3009-3017.
9. Caplan A.I. The mesengenic process. Clin. Plast. Surg. 1994;21:429-435.
10. Parekkadan B., van Poll D., Suganuma K., et al. Mesenchymal stem cell-derived molecules reverse fulminant hepatic failure. Biochem. Biophys. Res. Commun. in press. 2007;9:941-947.
11. Zhao R.C., Liao L., Han Q. Mechanisms and perspectives on the mesenchymal stem cell in immunotherapy. J. Lab. Clin. Med. 2004;143:284-291.
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ | INFORMATION ABOUT THE AUTHORS
Клёсов Роман Алексеевич*, ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России»;
e-mail: klesrom@mail.ru
Степанова Ольга Ивановна, к.б.н., ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России»; e-mail: olgsima50@mail.ru
Каркищенко Владислав Николаевич, д.м.н., проф., ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России»; e-mail: scbmt@yandex.ru
Баранова Оксана Владимировна, ФГАУ «Национальный медицинский исследовательский центр « Лечебно-реабилитационный центр» Минздрава России; e-mail: oksanagosha@mail.ru
Roman A. Klesov*, Scientific Center of Biomedical Technologies of the Federal Medical and Biological Agency of Russia; e-mail: klesrom@mail.ru
Olga I Stepanova, Cand. Sci. (Biol.), Scientific Center of Biomedical Technologies of the Federal Medical and Biological Agency of Russia; e-mail: olgsima50@mail.ru
Vladislav N. Karkischenko, Dr. Sci. (Med.), Prof., Scientific Center of Biomedical Technologies of the Federal Medical and Biological Agency of Russia; e-mail: scbmt@yandex.ru
Oksana V. Baranova, National Medical Research Center "Treatment and Rehabilitation Center" of the Ministry of Health Care of Russia; e-mail: oksanagosha@mail.ru
* Автор, ответственный за переписку / Corresponding author
