CC BY
21
■ И I II II
Новости клеточных технологий
ЛИТЕРАТУРА:
1. Bartholomew A., Sturgeon С., Siatskas М. et al. Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo. Exp. Hematol. 2002; 30: 42 8.
2. Glennie S., Soeiro P, Dyson PJ. et al. Bone marrow mesenchymal stem cells induce division arrest anergy of activated T cells. Blood. 2005; 105[7): 2821 7.
3. Aggarwal S., Pittenger M.F. Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cell responces. Blood. 2005; 105[4): 1815 22.
4. Beyth S., Borovsky Z., Mevorach D. etal. Human mesenchymal stem cells alter antigen presenting cell maturation and induce T cell unresponsiveness.
Blood. 2005; 105: 2214 9.
5. Di Nicola M., Carlo Stella C., Magni M. et al. Human bone marrow stromal cells suppress T lymphocyte proliferation induced by cellular or nonspecific mitogenic stimuli. Blood. 2002; 99: 3838 43.
6. Krampera M., Cosmi L, Angeli R. et al. Role for interferon r in the immunomodulatory activity of human bone marrow mesenchymal stem cells. Stem Cells. 2006; 24: 386 98.
7. Quirici N., Soligo D., Bossolasco P. et al. Isolation of bone marrow mesenchymal stem cells by anti nerve growth factor receptor antibodies. Exp. Hematol. 2002; 30: 783 91.
Порготовипа А.С. Григорян
По материалам: Haniffa М., Wang X.-N., Holtick U. et al. Adult Human Fibroblasts Are Potent Immunoregulatory Cells and Functionally Equivalent to Mesenchymal Stem Cells. The Journal of Immunology 2007; 179: 1595-604
Клетки костного мозга мигрируют в места локализаций новообразований и приобретают фенотип опухолевых клеток
В настоящее время получены убедительные доказатель ства, что стволовые/прогениторные клетки костного мозга взрослых могут мигрировать в удаленно расположенные орга ны [1, 2]. В нормальных условиях миграция клеток костного мозга, по видимому, не играет какой либо существенной функциональной роли, тогда как при некоторых патологи ческих состояниях может иметь большое значение. Ранее было продемонстрировано, что клетки костного мозга мигри руют в очаги повреждений и/или воспаления, что опосредо вано градиентами концентраций некоторых ассоциируемых с воспалением хемокинов [3, 4]. Роль, которую играют миг рирующие клетки в очаге воспаления, остается предметом дискуссий. Благодаря секреции цитокинов, дифференциров ке в необходимые клеточные типы или клеточному слиянию они могут способствовать репаративной регенерации.
Houghton J. etal. предположили, что мигрирующие в очаги хронического воспаления клетки костного мозга могут пре терпевать злокачественную трансформацию и служить ис точником новообразований.В опубликованной ими работе в журнале Science они использовали облученных мышей, которым трансплантировали меченые клетки костного мозга [5]. Позднее, животные инфицировались хеликобактером Felix, в результате чего у мышей развивались очаги хрони ческого воспаления в слизистой оболочке желудка, которые прогрессировали до рака. В течение 20 недель после ин фицирования меченые клетки костного мозга мигрировали в очаги воспаления в слизистой оболочке желудка. Здесь они дифференцировались и приобретали морфологию эпители альных клеток, при этом сохраняя маркеры клеток костного мозга. Меченые дифференцированные клетки имели призна ки злокачественной трансформации, и, по мнению авторов, служили источником возникновения новообразований. Таким образом, Houghton J. et al. предложили новую модель воз никновения злокачественных новообразований в виде трансформации стволовых/прогениторных клеток костного мозга в условиях хронического воспаления. На основании данной модели легко объяснить такие присущие клеткам опухоли свойства, как способность к самообновлению, от носительная резистентность к апоптозу, способность к ме тастазированию и ранней диссеминации. Richard Peek из
Vanderbilt University School of Medicine, один из ведущих спе циалистов по изучению Helicobacter, назвал данную гипо тезу интересной и перспективной в контексте разработки методов, направленных на профилактику рака желудка [6].
Тем не менее, некоторые ведущие специалисты в обла сти исследований стволовых клеток выразили сомнения от носительно данной модели возникновения злокачественных новообразований. В частности, Ирвинг Вейсман подверг критике данную работу, так как в ней не была исключена возможность слияния клеток костного мозга с эпителиаль ными клетками слизистой оболочки желудка [6]. Используя разные методики (исследование гистологических срезов на предмет наличия двуядерных эпителиальных клеток с мет ками; FACS анализ окрашенных пропидием разных типов клеток для сравнительной оценки содержания ДНК; FISH анализ меченых эпителиальных клеток на предмет наличия слившихся клеток с фенотипом XXY, XXXY), J. Houghton et al. не обнаружили признаков стабильного слияния клеток. Однако, Ирвинг Вейсман указал, что нет никаких оснований отвергать возможность нестабильного слияния клеток с последующим редукционным делением. Более того, слияние клеток костного мозга с клетками эпителия слизистой обо лочки желудка может являться одним из механизмов кан церогенеза, аналогично концепции миелоидных гибридных клеток, развиваемой J. Pawelek [7].
В новой работе, опубликованной в журнале Stem Cells, С. Cogle et al. получили данные, что часть клеток в составе некоторых опухолей могут иметь костномозговое происхож дение. Однако при этом клетки костного мозга не являются источником новообразования. В исследовании не было обна ружено признаков стабильного или нестабильного слияния клеток опухоли и костного мозга. На первом этапе анализи ровались биоптаты аденом толстой кишки, обнаруженных у двух женщин с признаками РТПХ (диарея), ранее перенесших трансплантацию гемопоэтических клеток от несовместимых доноров мужчин. Так как аденомы были обнаружены всего лишь через 2 месяца после трансплантации, предполага лось, что они имеют полностью реципиентское происхож дение. К удивлению, от 1 до 4% опухолевых клеток несли маркеры клеток костного мозга. Эти эпителиальные клетки
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, № 3, 2007
■ ИМИ!
Новости клеточных технологий
экспрессировали типичные для клеток аденомы маркеры и имели аналогичную морфологию в виде малой выраженности полярности и ядерной атипии. Интересно, что меченые опу холевые клетки в составе аденомы полностью находились в базальном слое, что может свидетельствовать о недавней миграции их костномозгового предшественника.
На втором этапе авторы использовали АРС мутантных мы шей (adenomatous polyposis coli gene mutant mice), имеющих высокую склонность к образованию аденом в толстой и тон кой кишке. Костный мозг от доноров самцов транспланти ровался облученным самкам, и, таким образом, трансплан тированные клетки были мечены Y хромосомой. Анализ образцов опухолей, полученных отданных мышей через 3 ме сяца после трансплантации, показал, что все аденомы в сво ем составе имели клетки донорского происхождения. Однако их количество составляло не более 10 на каждые 50 тысяч эпителиальных клеток. На третьем этапе исследовались об разцы опухолей кожи от четырех женщин и образец рака лег ких от одной женщины, которые перенесли трансплантацию гемапоэтических клеток от несовместимых доноров мужчин. Образцы новообразований были получены в сроки 1 4 года посттрансплантационного периода. Кроме того, все пациен ты имели признаки РТПХ. 20% клеток опухоли легкого имели донорское происхождение, тогда как в составе опухолей кожи клеток донорского происхождения обнаружено не было.
На заключительном этапе использовался метод транс плантации единственной GFP^ гемапоэтической клетки. Из 100 самок мышей, получивших трансплантат одной клетки от донора самца, гемапоэтический химеризм был обнаружен у 3 животных. Костный мозг от этих мышей был транспланти рован вторичным реципиентам. Эти же реципиенты получили внутримышечную инъекцию клеток рака легких от мышей самок. Через 14 недель после трансплантации опухолевых клеток не менее 1 % клеток образовавшихся опухолей со ставляли клетки костномозгового происхождения. Авторы
заключили, что к местам локализации опухолей мигрируют гемапоэтические стволовые клетки.
Таким образом, в разных моделях авторы показали, что, за исключением опухолей кожи, клетки костного мозга спо собы мигрировать к местам локализации новообразований, дифференцироваться, приобретая фенотип окружающих тканей и иметь характерные для неопластической трансфор мации морфологические черты. Необходимо отметить, что во всех моделях в области локализации опухолей имелись очаги воспаления, РТПХ или инфекционное поражение, что являлось необходимым условием для трансформации клеток костного мозга, согласно концепции J. Houghton et al. Интересно, что полученные данные уже были подтверждены в новом иссле довании, опубликованном в он лайн версии журнала Stem Cells [8].
Во всех приведенных случаях исключалась возможность клеточного слияния, используя FISH анализ клеток опухоли на предмет наличия фенотипа слияния (XXXY, XXY). Для ис ключения возможности «редукционного деления» тетраплоид ных клеток использовались данные X. Wang [9], согласно которым среди общего количества слившихся клеток дип лоидные клетки составляют не более 30 %. Проанализиро вав 40 Y позитивных клеток аденомы толстой кишки и 14 Y позитивных клеток рака легкого, авторы не обнаружили ни одной тетраплоидной клетки. Таким образом, вероятность клеточного слияния с последующим редукционным делени ем была пренебрежительно мала.
Механизм представленного в данной работе явления остается неясным. Феномены стабильного и нестабильного слияния были исключены. Являются ли клетки К0СТН0М03 гового происхождения в составе опухоли трансформирован ными? Для ответа на этот вопрос необходимо выделение клеток опухоли костномозгового происхождения с помощью FACS и последующей серийной трансплантацией для иссле дования туморогенного потенциала.
Роль клеток костного мозга в формировании новообразований эпителиального происхождения: А - концепция, развиваемая J. Houghton et al., предусматривает, что клетки костного мозга мигрируют в очаги хронического воспаления, дифференцируются в клетки эпителия и затем подвергаются злокачественной трансформации;
Б - согласно концепции С. Cogle et al. клетки костного мозга мигрируют в места локализации опухолей, где по неизвестным причинам приобретают фенотип опухолевых клеток
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, № 3, 2007
■ И I II II
Новости клеточных технологий
ЛИТЕРАТУРА:
1. Dalakas Е., Newsome P., Harrison D. and Plevris J. Hematopoietic stem cell trafficking in liver injury. The FASEB Journal. 2005; 19:1225 31.
2. Krause D, Theise N, Collector M. et al. Multi organ, multi lineage engraftment by a single bone marrow derived stem cell. Cell. 2001; 105: 369 77.
3. Askari A., Unzek S., Popovic Z. et al. Effect of stromal cell derived factor 1 on stem cell homing and tissue regeneration in ischaemic cardiomyopathy. Lancet. 2003; 362: 697 -703.
4. Hatch H., Zheng D., Jorgensen M. et al. SDF 1 alpha/CXCR4: a mechanism for hepatic oval cell activation and bone marrow stem cell recruitment to the injured liver of rats. Cloning Stem Cells. 2002; 4: 339-51.
5. Houghton J., Stoicov C., Nomura S., et al. Gastric cancer originating from bone marrow derived cells. Science. 2004; 306: 1568 71.
6. Marx J. Bone Marrow Cells: The Source of Gastric Cancer? Science. 2004, 306; 1455 6.
7. Pawelek J. Tumour cell fusion as a source of myeloid traits in cancer. Lancet Oncol. 2005; 6: 988 993.
8. Avital I., Moreira A., Klimstra D. et al. Donor Derived Human Bone Marrow Cells Contribute to Solid Organ Cancers Developing After Bone Marrow Transplantation. Stem Cells. First published online August 9, 2007.
9. Wang X., Willenbring H., Akkari Y., et al. Cell fusion is the principal source of bone marrow derived hepatocytes. Nature. 2003; 422: 897 901.
Порготовип B.C. Сергеев
По материалам: Cogle С., Theise N„ Fu D. et al. Bone Marrow Contributes to Epithelial Cancers in Mice
and Flumans as Developmental Mimicry. Stem Cells 2007:25: 1881-7
Использование митотической зиготы для репрограммирования ядра соматической клетки и клонирования
До сих пор клонирование животных и получение эмбри ональных стволовых клеток (ЭСК) основано на технологии переноса ядра соматической клетки ядер в мейотические овоциты. Попытки перенести ядро соматической клетки в оплодотворенный овоцит (зиготу в интерфазе) чаще всего оканчивались неудачей. В связи с этим с целью получения «собственных» линий чЭСК традиционно для процесса переноса ядра принято использовать неоплодотворенные человеческие овоциты. Исследовательская группа под ру ководством Кевина Еггана из Harvard Stem Cell Institute сообщает о том, что мышиные зиготы (остановленные в ми тозе) способны поддерживать репрограммирование сома тической клетки и могут использоваться как для получе ния линий ЭСК, так и для клонированных животных. Таким образом, человеческие зиготы, и, возможно, бластомеры, помимо овоцитов, могут стать реальными кандидатами для использования в технологии создания индивидуальных ли ний чЭСК.
В первых успешных экспериментах по переносу ядра на грызунах, исследователи провели обмен пронуклеусами между двумя оплодотворенными зиготами [1]. Полученные эмбрионы развились в полноценных взрослых животных. Однако при проведении похожих экспериментов с исполь зованием ядер на стадиях дробления такого результата не получили, поэтому предположили, что клонирование млеко питающих невозможно, т.к. репрограммирование позднего ядра блокировано. Однако вскоре было обнаружено, что ци топлазма неоплодотворенного овоцита способна вносить изменения в программу перенесенного ядра, и тогда были реализованы проекты по клонированию овцы, кролика, сви ньи и мыши (2 4].
Не так давно было показано, что потенциал развития за родыша после переноса ядра в неоплодотворенный овоцит существенно выше такового по сравнению с переносом в оплодотворенный или искусственно активированный овоцит. То есть, потенции яйцеклетки, необходимые для успешного развития особи после переноса ядра, теряются (изменяются) после ее оплодотворения. Таким образом, и для процедуры переноса ядра с целью получения индивидуальных линий чЭСК необходимы неоплодотворенные овоциты.
Группа Кевина Еггана предположила, что факторы, необ ходимые как для репрограммирования или/и эмбрионального развития, присутствующие в цитоплазме неоплодотворен ных мейотических овоцитов, становятся изолированными (уединенными) в пронуклеусах зигот. Такая компартмента лизация может объяснить невозможность энуклеированной интерфазной зиготы поддерживать развитие после переноса ядра, так как удаление пронуклеусов во время энуклеации может элиминировать одновременно и эти факторы, тем самым предотвращая дальнейшее развитие. Удаление кон денсированных хромосом во второй метафазе мейоза из овоцита, напротив, не влияет на эти процессы. Если эта мо дель верна, то разрушение ядерного конверта (ядерной обо лочки) при вступлении в первый эмбриональный митоз, мо жет привести к высвобождению критических факторов в цитоплазму, что позволит удалять хромосомы без удаления тех самых необходимых сигналов к развитию.
Для того, что бы определить? может ли цитоплазма ми тотической зиготы поддерживать репрограммирование ядра, исследователи обратимо затормозили зиготы в ми тозе, удалили хромосомы и заменили их хромосомами либо эмбриональной, либо соматической донорской клетки. Ученым удалось обнаружить, что такие генетически рекон струированные зиготы могут использоваться для получения клонированных животных и линий ЭСК.
Мышиные зиготы синхронизировали на стадии двух от дельных пронуклеусов путем разборки микротрубочек в мито зе. Другие зиготы были синхронизированы таким же спосо бом, но в интерфазе. Затем оба пронуклеуса в интерфазных зиготах были удалены, а вместо них трансплантированы про нуклеусы другой группы зигот. В таком случае происходи ло полное развитие. При пересадке ядер от 2 х дневного эмбриона происходило формирование бластоцисты, одна ко с гораздо более низкой эффективностью (70%).
Важнейшим результатом работы также является полу чение клонированных животных. Для их получения вместо вынесенных хромосом были использованы хромосомы куль тивируемых линий ЭСК, для того, чтобы различить хромосо мы из ЭСК (донора) и хромосомы зиготы (реципиента) хро мосомы донора несли флуоресцентную метку, связанную с
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, № 3, 2007
