CC BY
45
ИММУНОЛОГИЯ № 2, 2012
7. Титов В. Н. Патогенез атеросклероза для XXI века // Клин. лаб. диагн. - 1998. - № 3. - С. 3-11.
8. Титов В. Н. Общность атеросклероза и воспаления: специфичность атеросклероза как воспалительного процесса // Клин. лаб. диагн. - 2000. - № 1. - С. 3-10.
9. Ястребова Н. Е. Результаты мониторинга антибактериальных и противотканевых антител у людей в норме и при различных заболеваниях // Журн. микробиол. - 2007. - № 3. - С. 42-47.
10. Andrie R., Braun P., Welsch U. et al. Chlamydial and human heat shock protein 60 homologues in acute coronary syndromes. Autoimmune reactions as a link between infection and atherosclerosis // Kardiol. - 2003. - Vol. 92, N 6. - P. 455-465.
11. Belland R. J., Ouellette S. P., Gieffers J. Chlamydia pneumoniae and atherosclerosis // Cell Microbiol. - 2004. - Vol. 6, N 2. - P. 117-127.
12. Burian K., Kis Z., VirokD. Independent and joint effects of antibodies to human heat-shock protein 60 and Chlamydia pneumoniae infection in the development of coronary atherosclerosis // Circulation. - 2001. - Vol. 103, N 11. - P. 1503-1508.
13. Muhlestein J. B. Secondary prevention of coronary artery disease
with antimicrobials: current status and future directions // Am. J. Cardiovasc. Drugs. - 2002. - Vol. 2, N 2. - P. 107-118.
14. Multhoff G. Heat shock proteins in immunity // Handb. Exp. Pharmacol. - 2006. - Vol. 172. - P. 279-304.
15. Nilsson J. et al. Immunomodulation of atherosclerosis. Implications for vaccine development // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. - 2005. - Vol. 25, N 1. - P. 18-28.
16. Perschinka H., MayrM., Millonig G. et al. Cross-reactive B-cell epitopes of microbial and human heat shock protein 60/65 in atherosclerosis // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. - 2003. - Vol. 23, N 6. - P. 1060-1065.
17. Wick G. Atherosclerosis - an autoimmune disease due to an immune reaction against heat-shock protein 60 // Herz. - 2000. -Bd 25, N 2. - S. 87-90.
18. Xu Q., Schett G., Perschinka H. Serum soluble heat shock protein 60 is elevated in subjects with atherosclerosis in a general population // Circulation. - 2000. - Vol. 102. - P. 14-20.
19. Xu Q. Role ofheat shock proteins in atherosclerosis //Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. - 2002. - Vol. 22, N 10. - P. 1547-1559.
Поступила 15.09.11
©КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 616.348-006.66-097-091.8-078.33
A. В. Соснина1, Е. С. Михайлова1, А. И. Аутеншлюс1, А. В. Вонаршенко2,
B. М. Липкин2, Н. А. Вараксин3
И. А Костанян
классы и субклассы антител к фактору дифференцировки HLDF И пептидам гапонина, взаимосвязь их уровня с патогистологическими параметрами аденокарцином толстой кишки
Лаборатория физико-химической индикации иммунных процессов Учреждения Российская академия медицинских наук НИИ молекулярной биологии и биофизики СО РАМН (630117, Новосибирск, ул. Тимакова, 2); Лаборатория белков гормональной регуляции Учреждения РАН Институт биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН (117997 ГСП, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10); Лаборатория цитокинов ЗАО “Вектор-Бест” (630559, Новосибирская область, пос. Кольцово, административнобытовой комплекс)
При аденокарциномах толстой кишки в сыворотке крови повышен уровень антител класса G к а- и р-пептидам гапонина, субкласса G3 к а-пептиду гапонина, и снижен уровень антител субкласса G1 к этому пептиду. Уровень антител к фактору дифференцировки HLDF и пептидам гапонина субкласса G2 был более высоким при большем содержании высокодифференцированных клеток в опухоли. Предполагается, что аутоантитела к фактору дифференцировки HLDF и гапонину являются регуляторами их биологических эффектов.
Ключевые слова: антитела, фактор дифференцировки HLDF, гапонин, аденокарциномы толстой кишки
Sosnina A.V., Mikhailova E.S., Autenshlus A.I., Vonarshenko A.V., Kostanyan I.A., Lipkin V.M., Varaksin N.A.
THE CLASSES AND SUBCLASSES OF ANTIBODIES AGAINST THE DIFFERENTIATION FACTOR HLDF AND HAPONIN PEPTIDES, THE RELATIONSHIP BETWEEN THEIR LEVELS AND PATHOGENETIC PARAMETERS OF COLONIC ADENOCARCINOMA
Colonic adenocarcinoma is associated with the elevated levels of serum G-class antibodies against a- and b-haponin peptides and G3-subclass antibodies against a-haponin peptide; simultaneously, the level of G1-subclass antibodies against a-haponin peptide decreases. The levels of antibodies against the differentiation factor HLDF and subclass G2 antibodies against haponin peptides correlate with the amount of highly differentiated cells in the tumour. It is supposed that autoantibodies against the differentiation factor HLDF and haponin function as the regulators of biological effects of these peptides.
Key words: antibodies, the differentiation factor HLDF, haponin, colonic adenocarcinomas
Введение. HLDF (Human Leukemia Differentiation Factor), представляющий собой гликозилированный белок молекулярной массой 8,2 кД, был выделен из культуральной среды клеток HL-60 промиелоцитарного лейкоза человека группой сотрудников Института биоорганической химии им. академиков М. М.
Соснина Анастасия Викторовна - канд. мед. наук, ст. науч. сотр., тел. 8 (913) 009-73-49, e-mail:[email protected]
Шемякина и Ю. А. Овчинников РАН. Этот гликопротеин вызывал дифференцировку исходной клеточной линии по грану-лоцитарному пути [5]. Обнаружены его антипролиферативное действие и участие в процессах апоптоза [3, 4]. Из клеток той же линии был выделен белок, названный гапонином, молекулярной массой 20 кД [2], взаимодействующий с глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой, ключевым ферментом гликолиза, обладающим также широким спектром неканонических функций, среди которых стимуляция апоптоза [11, 13, 15]. Поэтому не
- 92 -
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ АЛЛЕРГОЛОГИЯ
исключено опосредованное участие апонина в апоптозе через его взаимодействие с тицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназой. Выделены две формы мРНК, кодирующие пептиды гапонина человека: а-гапонин, содержащий 165 аминокислотных остатков [2], и р-гапонин, содержащий 64 аминокислотных остатка. В то же время последовательности 50 N-концевых аминокислотных остатков у них были одинаковыми, мРНК р-гапонина человека возникает за счет выщипления 3-го экзона в гене гапонина, в результате чего происходит сдвиг рамки считывания, и стоп-кодон происходит раньше. С помощью антител обнаружено присутствие эндогенного гапонина в человеческих клеточных линиях различного происхождения: U-87 MG (глиобластома), Hek-293 (эмбриональные клетки почки), PANC-1 (рак поджелудочной железы), MCF7 (рак молочной железы), NC1-H640 (рак легких), К-562 (миелоидный лейкоз), HL-60 (промиелоцитарный лейкоз). В этих клетках выявлена специфическая мРНК, кодирующая гапонин [2, 7].
Показано, что и в норме и при патологии в сыворотке крови определяются HLDF и аутоантитела к нему, что свидетельствует о наличии в организме человека клеток, продуцирующих этот фактор дифференцировки, и гуморального иммунного ответа на него [9]. Поскольку HLDF не имеет специфических рецепторов на клетках, то его эффект, обусловленный взаимодействием с липидами клеточной мембраны, может распространяться на различные типы клеток организма, что подтверждается, в частности, обнаружением HLDF в клетках эндометрия в норме и при их неопластической трансформации [3, 4, 6].
Таким образом, сведения о функциональных особенностях HLDF и гапонина, локализации их в опухолевых клетках и способности организма вырабатывать антитела к ним обусловили цель настоящей работы, заключающуюся в изучении классов и субклассов антител к HLDF и гапонину, которые могут являться регуляторами биологических эффектов этих белков при злокачественных новообразованиях.
Материалы и методы. Материалом исследования служила сыворотка крови и резецированные опухоли 20 больных с аденокарциномами толстой кишки и сыворотка крови 16 здоровых лиц без злокачественных новообразований в анамнезе и без обострения хронических инфекционно-воспалительных заболеваний.
Уровень аутоантител классов A, M, G и субклассов Gj, G2, G3, G4 к HLDF (молекулярная масса 8,2 кД) и пептидам гапонина (а-пептид и Р-пептид: а-пептид - молекулярная масса 2,7
кДа соответствует последовательности 29-52 а-гапонина, а р-пептид - молекулярная масса 1,6 кДа соответствует последовательности 51-64 Р-гапонина), полученным твердофазным пептидным синтезом в лаборатории химии белка Учреждения филиал Института биоорганической химии (ФИБХ) им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН, определяли в сыворотке крови с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). Концентрация HLDF, а- и р-пептидов гапонина составила 40 мкг/мл в забуференном изотоническом растворе хлорида натрия. Иммобилизацию HLDF, а- и р-пептидов осуществляли пассивной сорбцией в лунки планшета для ИФА. После иммобилизации для предотвращения неспецифической сорбции лунки планшета обрабатывали 1,5% раствором бычьего сывороточного альбумина (фракция V), затем вносили образцы сывороток указанных выше пациентов. Использовали вторичные моноклональные антитела к иммуноглобулинам человека, меченные пероксидазой хрена (ООО “Полигность”, Санкт-Петербург). Уровень антител к пептидам во всех образцах сыворотки определяли на одном планшете для каждого из пептидов, уровень антител представлен в единицах оптической плотности.
Таблица 1
Уровень антител к пептидам гапонина у больных и здоровых лиц
Классы и субклассы антител Уровень антител (единицы оптической плотности) Ме (L; H) Р
аденокарциномы толстой кишки (п = 20) условно здоровые лица(п =16)
IgG к 0,198 0,082 0,014
а-пептиду (0,124; 0,244) (0,067; 0,155)
igG1 к 0,098 0,136 0,002
а-пептиду (0,088; 0,109) (0,111; 0,172)
ig<G к 0,138 0,100 0,017
а-пептиду (0,105; 0,179) (0,084; 0,130)
igG к 0,348 0,348 0,011
Р-пептиду (0,276; 0,499) (0,182; 0,319)
Патогистологическую картину опухоли характеризовали в баллах по следующим параметрам: количеству опухолевых клеток в сосудах, выраженности инфильтрации опухоли лимфоцитами, макрофагами и гранулоцитами, количеству митозов и патологических митозов в поле зрения, относительному содержанию (в %) в опухоли высокодифференцированных, умереннодифференцированных и низкодифференцированных клеток, варианту гистологической дифференцировки опухоли (высоко-, умеренно- или низкодифференцированная аденокарцинома), глубине инвазии, степени васкуляризации, количеству метастазов в регионарные лимфоузлы, наличию отдаленных метастазов [1]. Высчитывали процент Ki-67-позитивных клеток, который являлся показателем их пролиферативной активности [10].
Статистическую обработку данных проводили с использованием методов непараметрического анализа в связи с ненормальным распределением значений изученных показателей. Результаты в табл. 1-3 представлены в виде Ме (L, H), где Ме - медиана, L - нижний квартиль, H - верхний
Таблица 2
Корреляционные связи между патогистологическими параметрами опухолей и уровнем антител к HLDF и пептидам гапонина у больных с аденокарциномами толстой кишки
Уровень антител
параметры к HLDF к а-пептиду к р-пептиду
IgG2 IgG2 IgG2 IgM IgG2 IgG2 IgA
% Ki-67-позитивных клеток:
r -0,512 -0,584 -0,489
Р 0,025 0,009 0,033
Инфильтрация опухоли гранулоцитами:
r 0,454 -0,530
Р 0,044 0,016
Количество митозов:
r 0,45
Р 0,049
Содержание в опухоли высокодифференцированных клеток:
r 0,529 0,690 0,573
Р 0,024 0,002 0,013
Степень васкуляризации:
r -0,563 0,526
Р 0,010 0,017
- 93 -
ИММУНОЛОГИЯ № 2, 2012
квартиль. Для выявления взаимосвязи переменных проводили расчет коэффициента ранговой корреляции по Спирмену (г). Для статистической обработки результатов применяли программу Statistica 6.0. В табл. 1-3 представлены данные, имеющие статистически значимые различия.
Результаты и обсуждение. При изучении уровня антител в сыворотке крови у больных и здоровых лиц установили, что у больных с аденокарциномами только уровень антител класса G к а- и р-пептидам и субкласса G3 к а-пептиду статистически значимо превышал соответствующую величину у здоровых лиц, а уровень антител субкласса G1 к а-пептиду был более низкий по сравнению с таковым в контрольной группе (табл. 1). В результате изучения взаимосвязи между уровнем антител к HLDF, а- и р-пептидам в сыворотке крови и патогистологическими параметрами аденокарцином толстой кишки отметили разнонаправленность корреляционных связей между классами и субклассами антител к этим пептидам (табл. 2). Так, если уровень антител класса М к а-пептиду находился в прямой корреляционной связи с пато-гистологическаими параметрами опухоли, характеризующими большую злокачественность новообразования: выраженностью инфильтрации опухоли гранулоцитами, способствующей ее прогрессии [12, 14], митотической активностью опухолевых клеток и степенью васкуляризации, то уровень антител класса А к р-пептиду был в обратной корреляционной связи с показателем, отражающим пролиферативную активность опухолевых клеток (относительное содержание Ki-67-клеток), и выраженностью инфильтрации опухоли гранулоцитами. Что же касается субклассов антител к HLDF и пептидам гапонина, то уровень антител субкласса G2 к HLDF и р-пептиду находился в прямой корреляционной связи только с одним показателем -с относительным содержанием высокодифференцированных клеток в опухоли, что свидетельствует о более высоком уровне антител субкласса G2 к этим пептидам при меньшей степени злокачественности, которая определяется соотношением в опухоли клеток с той или иной степенью дифференцировки [8]. Антитела субкласса G3 к HLDF и пептидам гапонина были в обратной корреляционной связи с патогистологическими параметрами, характеризующими большую злокачественность опухоли: пролиферативной активностью опухолевых клеток и степенью васкуляризации, и в прямой - с параметром, который показывает меньшую злокачественность опухоли, - содержанием высокодифференцированных клеток.
В связи с тем что большая или меньшая степень злокачественности новообразования определяется соотношением в опухоли клеток с той или иной степенью дифференцировки, а также на основании установленных корреляционных связей всех больных колоректальным раком разделили на группы в зависимости от содержания в опухоли высокодифференцированных клеток. В одну группу вошли пациенты, в опухолях которых содержание высокодифференцированных клеток не превышало 19%, а в другую - те, у кого в опухолях концентрация высокодифференцированных клеток составила 20% и более (табл. 3). Оказалось, что только уровень антител к HLDF и пептидам га-понина субкласса G2 был более высоким при содержании высокодифференцированных клеток в опухоли 20% и более.
Таким образом, при опухолевой прогрессии аутоантител к HLDF и пептидам гапонина могут играть роль регуляторов их биологических эффектов, которая связана с классовой и субклассовой принадлежностью антител.
Авторы выражают благодарность И. Л. Родионову и Л. К. Байдаковой (лаборатория химии белка ФИБХ РАН) за синтез HLDF, а- и р-пептидов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Аутеншлюс А. И., Соснина А. В., Михайлова Е. С. и др. Провоспалительные цитокины и регуляторы их активности у
больных раком желудочно-кишечного тракта // Цитокины и
воспаление. - 2009. - Т. 8, № 4. - С. 18-22.
Таблица 3
Уровень антител субкласса G2 к пептидам гапонина у больных с аденокарциномами толстой кишки в зависимости от содержания высокодифференцированных клеток в опухоли
Содержание высокодифференцированных клеток в опухоли
Антитела 1-19% (n = 10) 20% и более (n = 10) p
уровень антител (единицы оптической плотности) Ме (L; H)
IgG2 к HLDF 0,103 (0,093; 0,174) 0,184 (0,165; 0,223) 0,033
IgG2 к 0,077 0,115 0,008
а-пептиду (0,074; 0,090) (0,104; 0,124)
igG2 к Р-пептиду 0,105 (0,090; 0,121) 0,197 (0,162; 0,211) 0,003
2. Вонаршенко А. В., Радченко В. В., Гапон М. В. и др. Идентификация и экспрессия нового белка гапонина из клеток линии HL-60 // Биоорган. химия. - 2007. - Т 33, № 6. - С. 653-656.
3. Драницына С. М., Костанян И. А., Андреева С. Г. и др. Эндогенный фактор дифференцировки клеток линии HL-60 обладает нуклеазной активностью // Биоорган. химия. - 2000. - Т. 26, № 5. - С. 340-351.
4. Ковязин В. А., Щелокова Е. Е., Костанян И. А. и др. Проапоп-тотический фактор HLDF в нормальном, гиперпластическом и опухолевом эндометрии // Арх. пат. - 2007. - № 3. - С. 23-26.
5. Костанян И. А., Астапова М. В., Старовойтова Е. В. и др. Новый фактор дифференцировки из культуральной среды клеток линии HL-60, обработанных ретиноевой кислотой. Выделение и определение первичной структуры // Биоорган. химия. - 1995. - Т. 21, № 4. - С. 243-248.
6. Костанян И. А., АстаповаМ. В., Наволоцкая Е. В. и др. Биологически активный фрагмент фактора дифференцировки клеток линии HL-60. Идентификация и свойства // Биоорган. химия. - 2000. - Т. 26, № 7. - С. 505-511.
7. Ракитина Т. В., Богатова О. В., Смирнова Е. В. и др. Га-понин (eIF1AD) взаимодействует с глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой в клетках линии CHO-K1 // Биоорган. химия. - 2010. - Т. 36, № 3. - С. 312-318.
8. Струков А. И., Серов В. В. Патологическая анатомия. - М., 1985.
9. Шерстнев В. В., Скворцова В. И., Грудень М. А. и др. Белок HLDF и антитела к нему как молекулярные патогенетические факторы и новые маркеры острых нарушений мозгового кровообращения // Инсульт. - 2004. - № 12. - С. 53-59.
10. Evans C., Morrison I., Heriot A. G. et al. The correlation between colorectal cancer rates of proliferation and apoptosis and systemic cytokine levels; plus their influence upon survival // Br. J. Cancer. - 2006. - Vol. 94, N 10. - P. 1412-1419.
11. Hara M. R., Snyder S. H. Nitric oxide-GAPDH-Siah: a novel cell death cascade // Cell Mol. Neurobiol. - 2006. - Vol. 26, N 4-6. - P. 527-538.
12. Mantovani A. The yin-yang of tumor-associated neutrophils // Cancer Cell. - 2009. - Vol. 16, N 3. - P. 173-174.
13. Sirover M. A. New insights into an old protein: the functional diversity of mammalian glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase // Biochim. Biophys. Acta. - 1999. - Vol. 1432, N 2. - P. 159-184.
14. Sun Z., Yang P. Role of imbalance between neutrophil elastase and alpha 1-antitrypsin in cancer development and progression // Lancet Oncol. - 2004. - Vol. 5, N 3. - P. 182-190.
15. YegoE. C., MohrS. Siah-1 protein is necessary for high glucose-induced glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase nuclear accumulation and cell death in Muller cells // J. Biol. Chem. -2010. - Vol. 285, N 5. - P. 3181-3190.
Поступила 08.07.11
- 94 -
