Классификация флуоресцентных органических соединений Текст научной статьи по специальности «Нанотехнологии»

BIOLOGICAL SCIENCES

Classification of fluorescent organic compounds Medvedev E. (Russian Federation) Классификация флуоресцентных органических соединений Медведев Е. А. (Российская Федерация)

Медведев Евгений Анатольевич /Medvedev Evgeny - бакалавр, кафедра биомедицинских систем, факультет компьютерных технологий, Национальный исследовательский университет, Московский институт электронной техники, г. Москва

Аннотация: в статье рассматриваются различные семейства флуоресцентных органических красителей, описываются их спектральные характеристики и области применения.

Abstract: the article considers the varions families of fluorescent organic dyes, described their spectral characteristics and applications.

Ключевые слова: органические красители, флуоресцентые белки, спектры флуоресценции, флуоресценция, визуализация, квантовый выход, флуорофоры.

Keywords: organic dyes, fluorescent proteins, fluorescence spectra, fluorescence imaging, quantum yield, fluorophores.

Флуоресценция - это испускание света веществом, которое поглотило свет или другое электромагнитное излучение. В этом процессе излучаемый свет имеет большую длину волны, и соответственно, меньшую энергию излучения, чем поглощённый.

При поглощении фотонов энергии в молекуле флуорофора наблюдается переход электронов из основного состояния на один из подуровней возбуждённого. В возбуждённом состоянии происходит процесс релаксации, при котором молекула теряет часть своей энергии и опускается до самого низкого подуровня возбуждённого состояния. После чего с низшего подуровня происходит переход в основное состояние, что сопровождается флуоресценцией. Из-за потерь энергии во время перехода от более высоких уровней, возбуждённого состояния на самый нижний колебательный подуровень, испускаемое излучение имеет меньшую энергию, а значит большую длину волны, по сравнению со светом, поглощённым в начале. Эндоргенные флуорофоры.

Большой вклад во флуоресценцию биоткани вносят эндогенные флуорофоры, в их состав входят ароматические аминокислоты: фенилаланин, тирозин и триптофан.

Эти три молекулы возбуждаются в УФ-диапазоне. Наиболее выраженными люминесцентными свойствами обладает триптофан. Его максимум поглощения приходится на длину волны 275 нм, а максимум излучения находится в пределах 350 нм. Фотофизические данные трёх флуорофоров приведены в таблице 1.

Таблица 1. Люминесцентные данные флуоресцентных аминокислот

Название Поглощение, нм Излучение, нм Коэффициент экстинкции М-1см-1 Квантовый выход

Фенилаланин 260 282 200 0,024

Тирозин 275 303 1500 0,2

Триптофан 287 350 6000 0,14

Раствор фенилаланина имеет слабую флуоресценцию по сравнению с растворами тирозина и триптофана, что сказывается на его квантовом выходе и молярной экстинкции.

Спектры излучения тирозина сильно зависят от таких факторов как температура, присутствие акцепторов и самой среды. Его квантовый выход является самым высоким из трёх аминокислот, но значение уменьшается на 40-90% при связывании с белком.

Флуоресценция триптофана позволяет исследовать структуру клеток и организма. Он обладает самой высокой яркостью и имеет наибольшую дину волны излучения по сравнению с другими флуоресцентными аминокислотами [1].

Цианиновые красители.

Цианиновые красители представляют собой молекулы, содержащие цепь из нечётного числа метиновых групп между 2-мя атомами азота. Благодаря особенностям своей структуры цианины обладают очень большим коэффициентом экстинкции, достигающим 2 х 1 0 5 М" 1см"1. С помощью различных заместителей можно контролировать различные свойства цианиновых красителей, например, длину волны возбуждения, фотостабильность. Выбирая различные полимерные цепочки, можно также регулировать длину волны поглощения и излучения: длинноцепочечные цианины поглощают излучение в более длинноволновой области, вплоть до ближнего ИК [2].

Многочисленные цианины и связанные полиметиновые структуры могут использоваться в качестве метки для белков и ДНК. Но наиболее распространённое применение флуорофоры имеют в научных исследованиях.

Среди циановых красителей выделяют два вида: сульфированные и несульфированные цианины. Их спектральные свойства примерно одинаковые и оба типа можно использовать для мечения биомолекул. Различие заключается в способности растворяться в воде: первые растворимы, и не требуют добавления органических растворителей при мечении. Что качается несульфированных, то эти цианины должны быть растворены в органическом растворителе и в таком виде добавлены к раствору молекулы-мишени.

Флуоресцеин.

Флуоресцеин представляет собой синтетическое органическое соединение в виде тёмно-оранжевого порошка, слабо растворим в воде, лучше в водных растворах щелочей и этаноле. Химическая формула С20Н12О5. Раствор флуоресцеина хорошо светится в ультрафиолетовых лучах и обладает жёлто-зелёной люминесценцией. Спектральные характеристики флуоресцеина имеют максимум поглощения при 490 нм и эмиссию в 514 нм, что делает его отличным средством для визуализации процессов в организме.

Очень широкое применение нашли производные флуоресцеина в иммуноцитохимии. Для этого используют реакции флуоресцентных маяков с белками-антителами и затем по люминесценции маяка судят о путях распространения антитела по организму. Наличие флуоресценина в клетке можно регистрировать с помощью люминесцентного микроскопа или спектрофлуориметра [3].

Родамины.

Родамины - это семейство флуороновых красителей, широко используемых в качестве флуорофоров. Ключевые характеристики этого класса это: низкая рН чувствительность и настраиваемые спектральные свойства. Различные замещения М-алкильных радикалов могут привести к коррекции спектральных характеристик родамина. Простейший член этого класса - родамин 110 , с молекулярной формулой С20Н15М2ОзС1 и спектральными характеристиками в зелёной области.

Другими представителями этого класса являются: родамин 6в и родамин В. В возбуждённом состоянии их длина волны находится в жёлто-красной области спектра. Люминесценцию родаминов легко обнаружить с помощью флуориметра. Они проникают в клетки легче, чем производные флуоресцеина. Находят своё применение родамины во флуоресцентной микроскопии, проточной цитометрии и иммуноферментном анализе [4].

Существуют гибридные конструкции между флуоресцеином и родамином, которые демонстрируют отличные люминесцентные свойства. В зависимости от выбора заместителей, максимумы поглощения варьируется от 490 до 550 нм с коэффициентом экстинкции более 50000 М" 1см~1, а максимумы излучения составляют 520-580 нм.

Некоторые примеры показывают возможность поглощения в приделах 515 нм, что является полезным для многоцветной флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии. Флуоресцентные белки.

Флуоресцентные белки (ФБ) являются наиболее распространёнными флуоресцентными метками в молекулярной и клеточной биологии. Благодаря сочетанию технологий мечения, высокой высокоточной микроскопии и компьютерному анализу изображений, стало возможно единовременное изучение локализации и функции сотен различных белков [5, 6].

Органические красители, класс ФБ, имеют высококонсервативную пространственную структуру и наделены способностью к формированию хромофоров - групп атомов, обуславливающего цвет химического соединения.

Хромофор формируется из аминокислотных остатков, это делает возможным поглощение и испускание видимого света. Сам белок представляет собой типичную бета-складчатую структуру, формирующую «бочонок», внутри которого находится хромофор. Оболочка цилиндра защищает хромофор от тушения его флуоресценции компонентами микроокружения. Кроме этого, внутренняя структура молекулы вызывает специфические реакции, что приводит к образованию хромофора. Этот процесс называется созреванием и включает несколько этапов, каждый из которых формирует промежуточный или конечный продукты с различными спектральными свойствами [7].

Первым представителем этого класса является ЗФБ - зелёный флуоресцентный белок с очень яркой флуоресценцией. Его спектры возбуждения лежат в пределах 395 и 475 нм, а максимум флуоресценции составляет 508 нм. Белок совершенно не токсичен и устойчив к фотообесцвечиванию, что позволяет проводить длительные исследования клеточной динамики.

Излучения полученных на сегодняшний день флуоресцентных белков покрывают почти весь видимый диапазон, начиная от голубого и расширяясь в ближний инфракрасный. Также, такой белок может синтезироваться внутри живой клетки, что позволяет обнаружить и визуализировать различные белки, образованные им [8].

Литература

1. Vishwanath K., Ramanujam N. Fluorescence spectroscopy in vivo // Encyclopedia of analytical chemistry, 2006.

2. Yan D. et al. Near-infrared absorption and polarized luminescent ultrathin films based on sulfonated cyanines and layered double hydroxide // The Journal of Physical Chemistry C., 2011. Vol. 115. № 16. P. 7939-7946.

3. Urano Y. et al. Evolution of fluorescein as a platform for finely tunable fluorescence probes // Journal of the American Chemical Society, 2005. Vol. 127. № 13. P. 4888-4894.

4. Zehentbauer F. M. et al. Fluorescence spectroscopy of Rhodamine 6G: Concentration and solvent effects //Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 2014. Vol. 121. P. 147-151.

5. Dean K. M., Palmer A. E. Advances in fluorescence labeling strategies for dynamic cellular imaging //Nature chemical biology, 2014. Vol. 10. № 7. P. 512-523.

6. Sauer M., Hofkens J., Enderlein J. Basic principles of fluorescence spectroscopy // Handbook of Fluorescence Spectroscopy and Imaging: From Single Molecules to Ensembles, 2011. P. 1-30.

7. Campbell R. E. et al. A monomeric red fluorescent protein // Proceedings of the National Academy of Sciences, 2002. Vol. 99. № 12. P. 7877-7882.

8. Chudakov D. M. et al. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues //Physiological reviews, 2010. Vol. 90.№ 3. P. 1106-1121.