CC BY
66
УДК: 616.152.21:616.89-008.441.13-036.11/ 12-092.9
КИСЛОРОДТРAНСПОРТНAЯ Функция КРОВИ И ПРООКСИДAНТНО-AНТИОКСИДAНТНЫЙ СТAТУС ЭРИТРОЦИТОВ ПРИ ОСТРОЙ И ХРОНИЧЕСКОЙ AЛКОГОЛЬНОЙ ИНТОКСИКAЦИИ КРЫС
А.В. Лелевич, ассистент
УО «Гродненский государственный медицинский университет»
В работе проведено изучение влияния острой (2,5 г/кг этанола) и хронической 8-месячной алкоголизации крыс на кислородтранспортную функцию крови и прооксидантно-антиоксидантный статус эритроцитов. Показано увеличение сродства гемоглобина к кислороду, развитие окислительного стресса при острой алкогольной интоксикации, увеличение сродства гемоглобина к кислороду, сдвиг кислотно-основного состояния крови в сторону алкалоза, развитие окислительного стресса в период отмены этанола при хронической алкоголизации животных.
Ключевые слова: кислородтранспортная функция, кровь, прооксидантно-антиоксидантный статус, эритроциты, алкоголь.
The influence of acute (2,5g/kg ethanol) and chronic 8-months alcohol intoxication in rats upon blood oxygen-transport function andprooxidant-antioxidant state of erythrocytes has been studied. In this study the increase of hemoglobin oxygen affinity, the development of oxidative stress under acute alcohol intoxication; the increase of hemoglobin oxygen affinity, the shift of acid-base condition of the blood to the alkalinity and the oxidative stress development during ethanol abolition under chronic alcohol intoxication of animals have been established.
Key words: oxygen transport function, blood, prooxidant-antioxidant state, erythrocytes, ethanol.
Введение
Эритроциты способны адсорбировать большую часть поступающего в кровь этанола [7]. Связывание молекул этанола с мембранами клеток и внедрение между полярными головками фосфолипидов уменьшает плотность упаковки последних и приводит к увеличению текучести мембран клеток интактных животных [12]. Используя метод флуоресцентных зондов, было обнаружено флюидизи-рующее действие этанола in vivo и in vitro на мембраны клеток [9, 17].
У больных алкоголизмом выявлено увеличение количества холестерина, мононенасыщенных жирных кислот и снижение полиненасыщенных, уменьшение текучести липидного бислоя мембран эритроцитов [8, 17], что снижает чувствительность мембран к разжижающему действию этанола [8, 16]. Увеличение жесткости мембран эритроцитов способствует уменьшению их деформируемости, потере механической прочности [4]. От деформируемости эритроцитов зависит поток кислорода в ткани, а его ухудшение способствует перераспределению использования кислорода с оксидазного пути на оксигеназный [3]. Из-за увеличения количества холестерина изменяется трансмембранный транспорт полярной молекулы кислорода [10]. Учитывая специфические функции эритроцитов, в них возможно образование активных форм кислорода в больших объемах, чем в других клетках. Так, через их мембрану проходит большое количество кислорода, создающего угрозу окисления гемоглобина, структурных белков и ферментов, которое
может явиться индуктором процессов перекисно-го окисления липидов (ПОЛ) в эритроцитарной мембране.
В связи с этим, целью работы явилось изучение влияния острой, хронической алкогольной интоксикации и отмены этанола на параметры кислород-транспортной функции крови и прооксидантно-антиоксидантного статуса эритроцитов крыс.
Материалы и методы
Эксперименты выполнены на 50 белых беспородных крысах-самцах. Острую алкогольную интоксикацию (ОАИ) моделировали однократным внутрибрюшинным введением 25% раствора этанола в дозе 2,5 г/кг массы тела. Контрольной группе животных вводили эквивалентные объемы изотонического раствора №С1.
Хроническую алкогольную интоксикацию (ХАИ) моделировали методом неполной водной депривации [2]. Воду заменяли на 15% раствор этанола в качестве единственного источника питья в течение 8-ми месяцев. Потребление этанола в перерасчете на абсолютный спирт в конце алкоголизации составило 12,4 г/кг массы тела в сутки. Животные контрольной группы содержались в аналогичных условиях и потребляли воду. Масса крыс в начале эксперимента составляла 160-170 г, перед забоем - 200-230 г. Животные были разделены на несколько групп: 1-я - контрольная группа животных, потреблявших воду; 2-я - алкоголизирован-ные животные на фоне потребления этанола; 3-я и 4-я - алкоголизированные животные на 1-е и 3-и
сутки отмены этанола, соответственно. Смешанную венозную кровь у крыс забирали из правого предсердия под эфирным наркозом. Значения рО2, рСО2, рН в исследуемых пробах крови измеряли на микрогазоанализаторе ABL-330 «Radiometr» (Дания). Показатели кислотно-основного баланса: реальный дефицит или избыток буферных оснований (АВЕ), стандартный дефицит или избыток буферных оснований (SBE), концентрация гидрокарбоната (НСО3-), концентрация общей углекислоты (ТСО2), концентрация стандартного бикарбоната (SBC) рассчитывались автоматически по номограммам Siggaard-Andersen с помощью компьютера микрогазоанализатора. Сродство гемоглобина к кислороду (СГК) определяли по показателю р50 методом смешивания [1]. р50ст измерялся в стандартных условиях: рН = 7,4; рСО2 = 4о мм рт. ст.; t = 37оС, а р50 еальн рассчитывался для реальных значений рН, рСО2, t°C, определяемых в ходе эксперимента. Метгемоглобин определяли спектрофотометрическим методом. Активность ПОЛ оценивали по уровню соединений, реагирующих с тио-барбитуровой кислотой (ТБКРС) [14], активность антиоксидантной системы - по уровню восстановленного глутатиона (GSH) [11] и активности глу-татионпероксидазы (ГП) [13].
Статистическую обработку данных осуществляли с применением пакета STATISTICA 6.0. Результаты экспериментов выражали в виде медианы и рассеяния (25, 75 процентилей). Сравнение групп производили непараметрическим методом Манна-Уитни, различия считались значимыми при р<0,05.
Результаты и обсуждение
Исследование показало, что ОАИ приводит к повышению СГК относительно контрольной группы, р50 еальн равны 40,55 (38,63; 41,73) и 43,31 (41,71; 47,06) мм рт. ст. (р=0,034), соответственно (таблица 1, рисунок 1). Также при ОАИ происходит снижение рО2 на 21,0 % (р=0,035). При иссле-
Таблица 1 - Показатели кислородтранспортной функции крови и прооксидантно-антиоксидантного статуса эритроцитов при острой алкогольной интоксикации крыс, Ме (25 %; 75 %)
Показатель Группа
Контроль (n=10) Опыт (n=12)
р50реальн, мм рт. ст. 43,31 (41,71; 47,06) 40,55 (38,63; 41,73)*
р50сганп, мм рт. ст. 37,12 (35,24; 39,27) 36,28 (34,31; 37,25)
НЬ, г/л 10,35 (9,2; 12,2) 9,35 (8,55; 11,15)
рО2, мм рт. ст. 31,30 (26,10; 34,80) 24,60 (20,10; 29,30)
О4 О Сfl 27,65 (13,29; 45,70) 21,11 (16,84; 29,43)
MetHb, % 0,00 (0,00; 0,52) 0,00 (0,00; 0,41)
SHb, % 0,00 (0,00; 0,00) 0,00 (0,00; 0,00)
РН, ед. 7,29 (7,22; 7,31) 7,27 (7,26; 7,34)
РСО2, мм рт. ст. 55,75 (47,50; 62,10) 55,45 (47,30; 60,10)
НСО3", ммоль/л 24,80 (23,60; 26,10) 24,25 (23,30; 25,95)
ТСО2, ммоль/л 26,30 (25,00; 27,70) 25,90 (25,05; 27,65)
ABE, ммоль/л -2,05 (-2,70; -0,50) -1,80 (-3,05; -0,60)
SBE, ммоль/л -,165 (-2,30; 0,30) -,45 (-2,80; -0,05)
SBC, ммоль/л 22,20 (21,60; 23,20) 21,90 (21,10; 22,95)
ТБКРС, нмоль/мл 5,39 (4,05; 6,06) 5,33 (3,94; 5,72)
GSH, ммоль/л 1,65 (1,59; 1,74) 1,49 (1,33; 1,53) *
ГП,ммольGSH/минхмл 0,51 (0,47;0,56) 0,47 (0,45; 0,48) *
4
Рисунок 1 - Кривые диссоциации оксигемоглобина при реальных значениях рСО2, рН и температуры у крыс при острой алкогольной интоксикации
довании прооксидантно-антиоксидантного статуса (ПАС) было обнаружено снижение уровня GSH на 9,7% (р=0,019) и активности гП на 7,8% (р=0,042).
Повышение СГК может быть следствием метаболических сдвигов в тканях под влиянием введения этанола. Известно, что ОАИ приводит к снижению активности НАД-зависимых дегидрогеназ в митохондриях и нарушает способность клеток использовать кислород [16]. В этих условиях усиливается образование активных форм кислорода. Повышение СГК при ОАИ может иметь компенсаторно-приспособительное значение вследствие сдвига ПАС в сторону радикалообразования, что препятствует отдаче кислорода в ткани и способствует снижению кислородзависимой активации процессов ПОЛ.
При ХАИ на первые сутки отмены наблюдается повышение СГК относительно группы с продолжающейся алкоголизацией, р50 равны 38,20 (33,45; 40,21) и 42,33 (39,03; 45,45)Тсоответствен-но, р=0,004. На 3 сутки отмены СГК становится выше, чем в контрольной группе, р50 равны 36,66 (33,14; 37,74) и 39,91 (36,99; 43,5Т)Гсоответ-ственно, р=0,028 и чем в группе с продолжающейся алкоголизацией, р=0,006, (таблица 2, рисунок 2). На первые сутки отмены было выявлено повышение уровня метгемоглобина, по сравнению с контрольной группой (р=0,005) и группой с продолжающейся алкоголизацией (р=0,043): 0,20 (0,10; 0,25),
0,00 (0,0; 0,00) и 0,00 (0,0; 0,00) %, соответственно. На третьи сутки отмены уровень метгемогло-бина понижался относительно группы с отменой этанола на одни сутки до 0,00 (0,00; 0,00), р=0,007.
При отмене этанола на первые (р=0,003) и на третьи сутки (р=0,025) происходило увеличение рН относительно группы животных с продолжающейся алкоголизацией: 7,33 (7,31; 7,36), 7,32 (7,27; 7,35) и 7,25 (7,22; 7,28), соответственно. На первые сутки отмены падало рСО2 относительно контрольной группы на 24,0% (р=0,043) и на 25,7 % относительно группы с продолжающейся алкоголизацией
7 —
Таблица 2 - Показатели кислородтранспортной функции крови и прооксидантно-антиоксидантного статуса эритроцитов при хронической алкогольной интоксикации крыс, Ме (25 %; 75 %)
Показатель Группа
Контроль (n=7) Без отмены (n=7) 1 сутки отмены (n=7) 3 суток отмены (n=7)
р50реальн, мм рт. ст. 39,91 (36,99; 43,51) 42,33 (39,03; 45,45) 38,20 * (33,45; 40,21) 36,66 * т (33,14; 37,74)
р50станд, мм рт. ст. 33,36 (29,69; 34,68) 35,92 (32,62; 38,42) 34,72 (32,90; 37,32) 34,25 (32,87; 35,94)
НЬ, г/л 12,30 (11,25; 12,95) 12,50 (9,70; 12,90) 11,95 (10,85; 12,30) 11,20 (8,90; 12,10)
рО2, мм рт. ст. 16,70 (10,50; 22,50) 19,00 (14,00; 25,00) 21,50 (16,50; 25,50) 17,00 (12,00; 19,00)
о4 о Сfl 18,60 (10,70; 22,25) 16,60 (12,10; 28,50) 26,55 (15,80; 37,20) 17,60 (15,80; 27,40)
MetHb, % 0,00 (0,0; 0,00) 0,00 (0,00; 0,00) 0,20 1 (0,10; 0,25) 0,00 # (0,00; 0,00)
SHb, % 0,00 (0,00; 0,00) 0,00 (0,00; 0,00) 0,00 (0,00; 0,00) 0,00 (0,00; 0,00)
РН, ед. 7,27 (7,20; 7,34) 7,25 (7,22; 7,28) 7,33 * (7,31; 7,36) 7,32 * (7,27; 7,35)
РСО2, мм рт. ст. 73,95 (59,85; 81,90) 75,60 (73,60; 78,90) 56,20 * т (54,10; 60,00) 69,65 * # (64,90; 72,00)
НСО3’, ммоль/л 33,00 (30,70; 35,10) 33,40 (32,50; 34,80) 31,50 * (29,50; 32,40) 36,15 # (33,20; 36,60)
ТСО2, ммоль/л 35,20 (32,65; 37,15) 35,80 (33,90; 37,20) 33,20 * (31,10; 34,20) 38,05 # (35,40; 38,70)
ABE, ммоль/л 5,50 (3,00; 7,30) 5,10 (4,60; 6,00) 5,45 (3,80; 6,40) 8,90 * # (5,70; 9,50)
SBE, ммоль/л 6,55 (3,55; 9,25) 7,10 (5,10; 7,50) 5,90 (3,95; 7,10) 10,25 # (6,10; 11,10)
SBC, ммоль/л 27,20 (25,65; 28,50) 27,30 (26,80; 27,90) 27,60 (26,40; 28,35) 29,05 (27,20; 30,70)
ТБКРС, нмоль/мл 3,91 (3,10; 4,75) 4,17 (3,20; 5,10) 4,82 (2,80; 5,95) 5,80 * т (5,35; 6,30)
GSH, ммоль/л 1,70 (1,55; 1,76) 1,80 т (1,77; 2,03) 1,56 (1,49; 2,13) 1,18 * т # (1,06; 1,23)
ГП, моль GSH/минхмл 0,65 (0,59; 0,65) 0,53 (0,41; 0,62) 0,51 (0,50; 0,51) 0,37 * 1 # (0,32; 0,44)
Примечание: * - статистически значимые различия со 2 группой, р<0,05; # - статистически значимые различия с 3 группой, У
р<0,05; - статистически значимые различия с контрольной группой, р<0,05
(р=0,003). На третьи сутки отмены этанола рСО2 оставалось пониженным относительно группы с продолжающейся алкоголизацией на 7,9 % (р=0,037), однако возрастало на 23,9% по сравнению с группой на одни сутки отмены этанола (р=0,01). На первые сутки отмены происходило падение [НСО3-] относительно группы животных с продолжающейся алкоголизацией на 5,7 % (р=0,025), а на третьи сутки данный показатель возрастал на 14,8 % по сравнению с группой на
Рисунок 2 - Кривые диссоциации оксигемоглобина при реальных значениях рСО2, рН и температуры у крыс при хронической алкогольной интоксикации
4 8
одни сутки отмены этанола (р=0,008). Также на первые сутки отмены происходило падение ТСО2 относительно группы животных с продолжающейся алкоголизацией на 7,3 % (р=0,015), а на третьи сутки ТСО2 возрастал на 14,6 % по сравнению с группой на одни сутки отмены этанола (р=0,007). На третьи сутки отмены увеличивался ABE относительно групп с продолжающейся алкоголизацией и группой животных на одни сутки отмены этанола на 74,5 % (р=0,045) и 63,3 % (р=0,05), соответственно. На третьи сутки отмены происходило повышение уровня SBE на 73,7 % относительно группы животных с отменой этанола на одни сутки (р=0,039). Таким образом, на первые сутки отмены этанола КОС сдвигается в щелочную сторону. Повышение некоторых показателей (рСО2, НСО3-, ТСО2, ABE, SBE) на третьи сутки отмены может свидетельствовать о возможном вовлечении почек в компенсацию нарушений КОС путем сбережения оснований. Изменения параметров КОС при отмене этанола могут приводить к левостороннему сдвигу кривой диссоциации оксигемоглобина. Повышение концентрации метгемоглобина на первые сутки отмены этанола также может увеличивать СГК и может быть связано с увеличением продукции оксида азота [17]. Известно, что у больных алкоголизмом повышена активность индуцированной NO-синтазы, увеличено содержание продуктов деградации оксида азота - нитратов и нитритов [3].
При исследовании ПАС эритроцитов при ХАИ на третьи сутки отмены было обнаружено снижение ТБКРС относительно контрольной группы и группы с продолжающейся алкоголизацией на 48,3 % (р=0,009) и 40,1 % (р=0,033), соответственно. Также в этот период наблюдалось снижение уровня GSH относительно контрольной группы, группы с продолжающейся алкоголизацией и группы с отменой этанола на трое суток на 30,6 % (р=0,005), 34,4 % (р=0,008) и 24,3 % (р=0,008), соответственно. На третьи сутки происходило и снижение активности ГП относительно контрольной группы на 43,1 % (р=0,033), группы с продолжающейся алко-
голизацией на 30,2 % (р=0,038) и группы с отменой этанола на трое суток на 27,4 % (р=0,019), соответственно. Избыточная активация процессов ПОЛ может возникать вследствие измененного соотношения доноров и акцепторов электронов в тканях, возникающего при нарушении их кислородного обеспечения при отмене этанола. Возможно, что повышение СГК и, следовательно, снижение отдачи кислорода в ткани является приспособительной реакцией на сдвиг прооксидантно-антиок-сидантного состояния в сторону кислородзависи-мого образования радикалов и конечного продукта перекисного окисления липидов - малонового диальдегида. Нельзя исключить и прямого влияния этанола и его метаболита - ацетальдегида на молекулу гемоглобина. Известно, что инкубация эритроцитов с ацетальдегидом приводит к образованию модифицированных форм гемоглобина и повышает сродство гемоглобина к кислороду [15].
В группе алкоголизированных животных без отмены этанола не было выявлено статистически значимых отличий исследуемых параметров КТФК, ПАС от контрольной группы, что свидетельствует об адаптивных изменениях к длительному действию этанола.
Выводы
1. При острой алкогольной интоксикации происходит повышение сродства гемоглобина, что может быть компенсаторной реакцией на сдвиг прооксидантно-антиоксидантного состояния в сторону радикалообразования.
2. Отсутствие существенных изменений кисло-родтранспортной функции крови и прооксидант-но-антиоксидантного статуса эритроцитов при продолжающейся хронической алкоголизации у крыс свидетельствует об адаптивных изменениях к длительному действию этанола.
3. Отмена этанола при хронической алкогольной интоксикации крыс приводит к повышению сродства гемоглобина к кислороду, что может являться следствием смещения кислотно-основного состояния в сторону алкалоза, сдвига прооксидан-тно-антиоксидантного состояния в сторону ради-калообразования, повышения уровня метгемогло-бина.
4. При хронической алкогольной интоксикации крыс в период отмены этанола прооксидантно-ан-тиоксидантный статус смещается в сторону усиления процессов перекисного окисления липидов и снижения активности антиоксидантной системы мембран эритроцитов, что может являться следствием нарушения утилизации кислорода тканями. Данные изменения наиболее выражены на 3 сутки отмены этанола.
Литература
1. Борисюк, М. В. Сродство гемоглобина к кислороду / М. В. Борисюк [и др.] // Методы исследования массопереноса в системе микроциркуляции. - Новисибирск: Наука. Сибирское отделение, 1991.
- С. 156-162.
2. Буров, Ю. В. Биологические модели хронического алкоголизма / Ю. В. Буров, В. Н. Жуков // Итоги науки и техники. ВИНИТИ. Токсикология. - 1984. - Т. 13. - С. 57-92.
3. Зинчук, В. В. Деформируемость эритроцитов: физиологические аспекты / В. В. Зинчук // Успехи физиологических наук. - 2001. -Т. 32. - № 3. - С. 66-78.
4. Лелевич, А. В. Механическая прочность эритроцитов больных алкоголизмом в ультразвуковом поле / А. В. Лелевич // Сборник тезисов докладов научно-практической конф. молодых ученых и студентов, посв. памяти акад. Ю.М. 0стровского.10-11 апр., 2003. - С. 130-131.
5. Степуро, Т. Л. Влияние доноров оксида азота на сродство гемоглобина к кислороду in vitro в условиях различной оксигенирован-ности крови / Т. Л. Степуро, В.В. Зинчук // Труды V международной научно-практической конференции «Дисфункция эндотелия: экспериментальные клинические исследования» - Витебск, 2008. - С. 99102.
6. Чарный, А. М. Патофизиология гипоксических состояний / Под общей ред. Горизонтова П. Д. - Москва, 1961. - 290с.
7. Baraona, E. Red blood cells: a new major modality for acetaldehyde transport from liver to other tissues / E. Baraona [et. al.] // Basic life sciences. - 1987. - Vol. 40. - N 3. - P. 253-258.
8. Benedetti, A. Effect of chronic ethanol abuse on the physicochemical properties of erythrocyte membranes in man / A. Benedetti [et. al.] // Pharmacological research communications. - 1986. - Vol. 18. -N11. - P. 1003-1014.
9. Chin, J. H. Drug tolerance in biomembranes: A spin label study of the effect of ethanol / J.H. Chin, D.B. Goldstein // Science. - 1977. -Vol. 196. - P. 684-685.
10. Dumas, D. Membrane fluidity and oxygen diffusion in cholesterol-enriched erythrocyte membrane / D. Dumas [et. al.] // Archives of biochemistry and biophysics. - 1997. - Vol. 34. - N1. - P. 34-39.
11. Ellman, G. L. Tissue sulfhydryl groups / G. L. Ellman // Archives of biochemistry and biophysics. - 1959. - Vol. 82. - N1. - P. 70-77.
12. Klemm, W. R. Membrane glycoconjugates as potential mediators of alcohol effects / W. R. Klemm // Progress in neuro-psychopharmacology & biological psychiatry. - 1987. - Vol. 1. - N6. - P. 633-658.
13. Martinez, J. I. A sensitive fluorimetric microassay for the determination of glutathione peroxidase activity. Application to human blood platelets / J. I. Martinez, J. M. Launay, C. Dreux // Analytical biochemistry. - 1979. - Vol. 98. - N1. - P. 154-159.
14. Stocks, J. The autoxidation of human red cell lipids induced by hydrogen peroxide / J. Stocks, T. L. Dormandy // British journal of haematology. - 1971. - Vol. 20. - N1. - P. 95-111.
15. Tsuboi Kenneth, K. Acetaldegyde-dependent changes in hemoglobin and oxygen affinity of human erythrocytes / K. Tsuboi Kenneth, J. Thompson Diana, M. Rush Elizabeth // Hemoglobin. - 1981. - Vol. 5. -N 3. - P. 241-250.
16. Vanderkooi, J. Fluorescent probe analysis of the lipid architecture of natural and experimental cholesterol-rich membranes / J. Vanderkooi // Biochemistry. - 1974. - Vol. 13. - N 8. - P. 1589-1595.
17. Zerouga, M. Rat synaptic membrane fluidity parameters after intermittent exposures to ethanol in vivo / M. Zerouga, F. Beauge // Alcohol.
- 1992. - Vol. 9. - N4. - P. 311-315.
18. Zima, T. Oxidative stress, metabolism of ethanol and alcohol-related diseases / T. Zima [et. al.] // J Biomed Sci. - 2001. - Vol. 8. - N1.
- P. 59-70.
Поступила 30.06.08
