Кислородтранспортная функция крови и прооксидантно-антиоксидантное состояние организма в условиях коррекции L-аргинин-NO системы при введении липополисахарида Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 612.127.2:612.014.464:616.152.21

КИСЛОРОДТРАНСПОРТНАЯ ФУНКЦИЯ КРОВИ И ПРООКСИДАНТНО-АНТИОКСИДАНТНОЕ СОСТОЯНИЕ ОРГАНИЗМА В УСЛОВИЯХ КОРРЕКЦИИ L-АРГИНИН-NO СИСТЕМЫ ПРИ ВВЕДЕНИИ ЛИПОПОЛИСАХАРИДА

Е.В. пульги

УО «Гродненский государственный медицинский университет»

В исследовании на кроликах было показано, что селективная коррекция L-аргинин^О системы аминогуаниди-ном через NO-зависимый механизм улучшает показатели кислородтранспортной функции крови, повышает СГК и участвует в поддержании прооксидантно-антиоксидантного баланса организма через 12 часов после инъекции липополисахарида.

Ключевые слова: аминогуанидин, липополисахарид, кислород, оксид азота, антиоксидант.

In investigation on rabbits it has been shown that selective correction of the L-arginine-NO system by aminoguanidine through the NO-dependent mechanism improves parameters of oxygen transportfunction of blood, increases hemoglobin - oxygen affinity and participates in the maintenance ofprooxidant-antioxidant balance of the organism 12 hours later after lipopolysaccharide injection.

Key words: aminoguanidine, lipopolysaccharide, oxygen, nitric oxide, antioxidant.

Введение

Липополисахарид (ЛПС) повышает выработку провоспалительных цитокинов, таких как фактор некроза опухоли-а, активирует ядерный фактор-kappaB, увеличивает продукцию свободных радикалов [12], при этом также происходит повышение в плазме крови уровня оксида азота (NO) за счет активации индуцибельной изоформы NO-синтазы, увеличение циклоокигеназы-2 в печени, легких, аорте и лимфоцитах [8]. Есть данные о том, что аминогуанидин (АГ) обратимо инактивирует ин-дуцибельную изоформу NO-синтазы, изменяя кон-формацию белка и ковалентно связываясь с геном, но без изменения его структуры [1]. Он полностью блокирует ЛПС-индуцированную активацию синтеза индуцибельных белков теплового шока HSP70 во всех типах макрофагов и защищает от ЛПС-ин-дуцированного апоптоза [5]. АГ уменьшает нарушения функции почек через NO-зависимый механизм при эндотоксемии у кроликов [17], снижает активность миелопероксидазы, уровень малонового диальдегида (МДА) в крови и тканях, экспрессию индуцибельной изоформы NO-синтазы [16]. Целью данного исследования было изучение параметров кислородтранспортной функции крови и прооксидантно-антиоксидантного состояния у кроликов в условиях коррекции L-аргинин-NO системы индуцибельной селективным ингибитором изо-формы NO-синтазы АГ через 12 часов после введения ЛПС.

Материалы и методы

Эксперименты проводили на кроликах-самцах (n=17) массой 2.5-3.5 кг, которые содержались в стандартных условиях вивария. ЛПС от E.coli (Serotype O111:B4, «Sigma» L-2630) в дозе 500 мкг/ кг вводили в краевую вену уха животным первой группы (n=8). АГ разводили в 0.9 % NaCl и доводили раствор с помощью 0.1 Н NaOH до pH=7.4, а затем вводили кроликам второй группы (n=9) под-

кожно в дозе 300 мг/кг за 1 час до ЛПС. Забор смешанной венозной крови из правого предсердия и образцов тканей (аорта, сердце, легкие, печень и почки) осуществляли в условиях адекватной анальгезии (30 мг/кг тиопентала натрия внутривенно) через 12 часов после введения ЛПС. Исследования проводили в соответствии с рекомендациями, подготовленными Европейской комиссией по защите используемых в экспериментах животных, и с разрешения этической комиссии Гродненского государственного медицинского университета.

На микрогазоанализаторе Syntesis-15 «Instrumentation Laboratory» оценивали напряжение кислорода (рО2), содержание кислорода (CVO2), степень оксигенации (SO2), рН крови, напряжение углекислого газа (рСО2), концентрацию общей углекислоты плазмы (ТСО2) и бикарбоната (НСО3-), реальный и стандартный недостаток/избыток буферных оснований (ABE/SBE), стандартный бикарбонат плазмы (SBC) при температуре 37°С. Сродство гемоглобина к кислороду (СГК) определяли по показателю р50 (рО2 крови при 50% насыщении ее кислородом). При стандартных условиях (T=37°Q рН=7.4, рСО2=40 мм рт.ст.) оценивали p50 [13], а затем рассчитывали p50 для ре-

Г станд L Г Г реал Г

альных значений этих факторов по формулам Severinghaus J. W. [14]. Продукцию NO определяли по уровню общих нитритов (NO3-/NO2-) в плазме крови с помощью реактива Грисса на спектрофотометре «Solar» PV1251C при длине волны 540 нм [7].

Содержание диеновых коньюгатов измеряли спектрофотометрически по интенсивности УФ-поглощения после экстракции липидов смесью гептана в изопропиловом спирте в области 232-234 нм [2]. Уровень МДА оценивали с помощью 2'-тио-барбитуровой кислоты по интенсивности развивающейся окраски на «Solar» PV1251C при длине волны 535 нм [11]. Содержание а-токоферола оп-

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Журнал ГрГМУ 2009 № 2

ределяли в верхнем гексановом слое на спектро-флуориметре «Hitachi F-4010» при X возб=295 и Хисп=326 нм [4]. Активность каталазы оценивали спекгрофогометрически по количеству Н2О2, израсходованной в реакции с молибденовокислым аммонием, при длине волны 410 нм [6]. Данные результаты представлены в виде x ± S x , где X -среднее значение, Sx - ошибка среднего значения. С учетом малых размеров выборки и отсутствия нормального распределения в группах, статистическую значимость оценивали методом непараметрической статистики для независимых выборок (Mann-Whitney U test). За достоверный принимали уровень статистической значимости р<0.05.

Результаты и обсуждение

В наших исследованиях коррекция L-аргинин-NO системы в условиях введения ЛПС приводит к изменению показателей кислородтранспортной функции крови (табл.1). Наблюдается повышение рН c 7.228 ± 0.02 до 7.333 ± 0.002 ед. (p<0,05), а также увеличение значений ABE на 35.3% (p<0,05), рС02 на 23.8%. (p<0,05), в сравнении с группой животных, получавших только ЛПС. При окислительном стрессе наблюдается ухудшение кислород-транспортной функции крови, в то время как использование АГ и ЛПС приводит к увеличению показателей CVO2, SO2 р02 и гемоглобина на 22.2% (p<0,05), 12.6% (p<0,05), 12.0% (p<0,05) и 9.7% (p<0,05), соответственно.

В условиях направленной коррекции L-аргинин-NO системы при введении эндотоксина отмечается снижение показателя p50 при реальных значениях рН, рСО2 и температуры на 6.2% (p<0,05) в сравнении с группой животных, получавших только ЛПС, повышение СГК, что соответствует отклонению кривой диссоциации оксигемоглобина при реальных условиях циркуляции влево (рис. 1). В то же время, показатель p50 остается без измене-

г ' г станд

ний.

Применение АГ перед ЛПС приводит к умень-

100 -г

SO2,% 80 -

0

0 20 40 60 80 100

р°2, мм рт. ст.

Рисунок 1 - Кривые диссоциации оксигемоглобина у

кроликов при реальных значениях рН, рСО2 и температуры в контроле (0,9% ^С1) (щ), 12 часов после введения липополисахарида (4), аминогуанидин + липополисахарид (•)

шению NO-продуцирующей активности организма: уровень общих нитритов в плазме крови снижается на 71.5% (р<0,05) по отношению к группе животных, получавших только ЛПС (табл. 1).

При окислительном стрессе, индуцированном ЛПС, отмечается нарушение прооксидантно-анти-оксидантного баланса в сторону активации свобод-норадикальных процессов. В условиях коррекции L-аргинин-NO системы наблюдается снижение прироста уровня диеновых коньюгатов (табл. 2) на 16.1% в аорте (р<0,05), на 14.8% в сердце (р<0,05), на 20.6% в печени (р<0,05) и на 16.7% в почках (р<0,05), а также уменьшение содержания МДА на 23.1% в аорте (р<0,05), на 20.3% в сердце (р<0,05), на 28.1% в легких (р<0,05), на 16.3% в печени (р<0,05) и на 32.6% в почках (р<0,05), по отношению к группе животных, получавших только ЛПС. Одновременно со снижением активности свобод-норадикальных процессов отмечается повышение уровня а-токоферола (рис. 2) с 8.0±0.22 до 9.2±0.16 мкмоль/г в аорте (р<0,05), с 4.8±0.25 до 7.6±0.21 мкмоль/г в сердце (р<0,05), с 7.1±0.24 до 7.9±0.18 мкмоль/г в легких (р<0,05), с 5.1±0.36 до 6.6±0.21 мкмоль/г в печени (р<0,05), с 6.7±0.25 до 7.8±0.18 мкмоль/г в почках (р<0,05) и активности каталазы (рис. 3) с 1.6±0.15 до 3.5±0.21 ммольН2О2/мин/г белка в аорте (р<0,05), с 2.3±0.33 до 3.0±0.16 ммольН2О2/мин/г белка в сердце (р<0,05), с 1.2±0.23 до 2.7±0.17 ммольН2О2/мин/г белка в легких (р<0,05), с 1.9±0.25 до 2.8!±0.19 ммольН2О2/ мин/г белка в печени (р<0,05), с 3.0±0.19 до 3.9±0.13 ммольН2О2/мин/г белка в почках (р<0,05), в сравнении с группой ЛПС.

Таблица 2 - Изменение содержания диеновых коньюгатов и малонового диальдегида в тканях у кроликов после введения аминогуанидина и липополисахарида (х ± Б-)

Таблица 1 - Показатели кислородтранспортной функции крови у кроликов после введения аминогуанидина и липополисахарида (х ± Б-)

Показатель Липополисахарид Аминогуанидин и липополисахарид

n 8 9

Р50реал, мм рт.ст. 39.2±0.93 36.7±0.38*

р50СГанд, мм рт.ст. 29.5±0.45 30.1±0.41

T,0C 39.3±0.12 38.9±0.06*

pH, ед. 7.288±0.02 7.333±0.02*

Гемоглобин, г/л 85.4±2.65 93.7±2.61*

CvO2, % 6.64±0.45 8.10±0.39*

SO2, % 59.76±2.38 67.32±1.45*

MetHb, % 1.08±0.23 1.09±0.06

pO2, мм рт.ст. 38.5±1.45 43.1±1.11#

pCO2, мм рт.ст. 28.2±1.30 34.9±0.67*

HCO3-, ммоль/л 13.64±0.59 16.26±1.07

TCO2, ммоль/л 14.49±0.62 17.30±1.11

ABE, ммоль/л -10.98±0.70 -7.10±0.66*

SBE, ммоль/л -13.18±0.79 -10.47±1.30

SBC, ммоль/л 15.70±0.59 15.71±1.04

NO3- /NO2-, мкмоль/л 22.28±1.32 6.34±0.51*

p<0,05 по отношению к группе введения липополисахарида.

Показатель Липополисахарид Аминогуанидин и липополисахарид

n 8 9

Диеновые конъюгаты, AD233/г Аорта 3.2±0.13 2.7 ±0.10*

Сердце 2.9±0.13 2.5 ±0.08*

Легкие 2.8±0.17 2.5 ±0.15

Печень 3.8±0.33 3.0±0.12*

Почки 3.8±0.19 3.1±0.12*

Малоновый диальдегид, мкмоль/г Аорта 4.0±0.11 3.1±0.14*

Сердце 2.6±0.11 2.3±0.15*

Легкие 4.1±0.09 2.9±0.18*

Печень 1.7±0.08 1.4±0.06*

Почки 4.1±0.07 2.8±0.18*

p<0,05 по отношению к группе введения липополисахарида

1 2 3 4 5 липополисахарид

1 2 3 4 5 липополисахарид+аминогуанидин

Рисунок 2 - Изменение содержания а-токоферола в тканях у кроликов после введения аминогуанидина и липополисахарида. По оси ординат — содержание а-токоферола, мкмоль/г; по оси абсцисс — гомогенаты тканей: 1 — аорта, 2 — сердце, 3 — легкие, 4 — печень, 5 — почки. Примечание: #р<0,05 по отношению к группе введения липополисахарида

В наших экспериментах АГ, введенный перед инъекцией ЛПС, снижает активность свободнора-дикальных процессов и повышает уровень анти-оксидантных факторов защиты. Известно, что ЛПС является индуктором индуцибельной изоформы NO-синтазы, под действием которой вырабатывается большое количество N0, обладающего цито-токсическим действием, так как при взаимодействии с супероксид анионом образуется мощный окислитель пероксинитрит [9]. Очевидно, эффекты АГ при окислительном стрессе связаны с уменьшением стабильных метаболитов N0, а также продукции свободнорадикальных молекул (О2-), и повышением активности супероксиддисмутазы [3].

По результатам наших исследований АГ через N0-зависимый механизм улучшает показатели кис-лородтранспортной функции крови, повышает СГК и участвует в поддержании прооксидантно-анти-оксидантного баланса организма через 12 часов после инъекции ЛПС. Эндотоксин уменьшает венозное рО2 в почечных сосудах и доставку кислорода к тканям [10], в то время как АГ улучшает доставку и потребление кислорода при эндотоксе-мии [15]. Введение селективного ингибитора индуцибельной изоформы N0-синтазы уменьшает избыточную продукцию N0, что видно по снижению уровня общих нитритов в наших исследованиях, влияет на СГК через образование различных N0-производных: метгемоглобин, нитрозогемогло-бин, нитрозилгемоглобин, контролируя процессы оксигенации и поддержание прооксидантно-анти-оксидантного баланса организма.

Выводы

1. Введение селективного ингибитора индуци-бельной изоформы N0-синтазы через 12 часов после введения липополисахарида снижает активность свободнорадикальных процессов и повышает уровень антиоксидантных факторов защиты.

2. Аминогуанидин через N0-зависимые механизмы влияет на формирование кислородтранспор-тной функции крови, сродство гемоглобина к кислороду и их участие в оксигенации тканей и поддержании прооксидантно-антиоксидантного баланса организма.

12345 12345

липополисахарид липополисахарид+аминогуанидин

Рисунок 3 - Изменение активности каталазы в тканях у кроликов после введения аминогуанидина и липополисахарида. По оси ординат — содержание каталазы, ммольН2О/мин/г белка; по оси абсцисс — гомогенаты тканей: 1 — аорта, 2 — сердце, 3 — легкие, 4 — печень, 5 — почки. Примечание: #p<0,05 по отношению к группе введения липополисахарида

Литература

1. Бонарцев А.П. и др. Влияние хронического введения аминогуанидина на реактивность легочных сосудов у крыс с монокротали-новой моделью легочной гипертензии // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. - 2004. - Т. 90, № 7. - С. 908-915.

2. Камышников В.С. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике - Минск, 2002. - Т. 2. - 463 с.

3. Орлова Е.А. Комаревцева И.А. Роль NO-синтазы в стимуляции опиатных рецепторов и устойчивости почек к оксидативному стрессу // Укр. биохим. журн. - 2004. - Т. 76, № 1. - С. 97-102.

4. Рагино Ю.И. и др. Применение новых биохимических способов для оценки окислительно-антиоксидантного потенциала липоп-ротеинов низкой плотности // Клин. лаб. диагн. - 2005. - № 4 . - С. 11-15.

5. Малышева Е.В. и др. Роль экстраклеточного и внутриклеточного окисда азота в регуляции клеточных ответов макрофагов // Бюл. эксп. биол. мед. - 2006. - Т. 141, № 4. - С. 386-388.

6. Aruoma O.I., Cuppett S.L Antioxidant Methodology: in vivo and in vitro Concepts // New York, AOCSPress, 1997. - 256 p.

7. Bryan N.S., Grisham M.B. Methods to detect nitric oxide and its metabolites in biological samples // Free Radic. Biol. Med. - 2007. - Vol. 43, № 5. - P. 645-657.

8. Shen K.P. et al. Eugenosedin-A amelioration of lipopolysaccharide-induced up-regulation of p38 MAPK, inducible nitric oxide synthase and cyclooxygenase-2 // J. Pharm. Pharmacol. - 2007. -Vol. 59, № 6. - P. 879-889.

9. Kawano T. et al. iNOS-derived NO and nox2-derived superoxide confer tolerance to excitotoxic brain injury through peroxynitrite // J. Cereb. Blood Flow Metab. - 2007. - Vol. 27, № 8. - P. 1453-1462.

10. Mik E.G., Johannes T., Ince C. Monitoring of renal venous pO2 and kidney oxygen consumption in rats by a near-infrared phosphorescence lifetime technique // Am. J. Physiol. Renal. Physiol. - 2008. - Vol. 294, № 3. - F. 676-681.

11. Rice-Evans C.A., Diplock A.T., Symons M.C.R Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology: techniques in free radical research - Elsevier, 1991. - 291 p.

12. Victor V.M. et al. Role of free radicals in sepsis: antioxidant therapy // Curr. Pharm. Des. - 2005. - Vol. 11, № 24. - P. 3141-3158.

13. S^eid P., Meyer M. Mixing technigue for study of oxygen-hemoglobin eguilibrium: a critical evaluation // J. Appl. Physiol. - 1978. -Vol. 45, № 5. - P. 616-622.

14. Severinghaus J.W. Blood gas calculator // J. appl. Physiol. - 1966. - Vol. 21, № 5. - P. 1108-1116.

15. Tang H.X., Fan X.M. Effect of dexamethasone, aminoguanidin, amrinone on oxygen utilization in endotoxin shock rabbits // Zhonghua Er. Ke. Za. Zhi. - 2003. - Vol. 41, № 4. - P. 282-285.

16. Ogetman Z. et al. The effect of aminoguanidine on blood and tissue lipid peroxidation in jaundiced rats with endotoxemia induced with LPS // J. Invest. Surg. - 2006. - Vol. 19, № 1. - P. 19-30.

17. Wang L., Fan X.M., Tang H.X. Effects of aminoguanidine in different dosages on renal function in endotoxin induced rabbits shock model // Zhonghua Er. Ke. Za. Zhi. - 2004. - Vol. 42, № 3. - P. 206-209.

Поступила 08.04.09

#

5

#

#

4

3

2

0