CC BY
65
Биомедицина • № 3, 2013, С. 6-17
е НОВЫЕ БИОМЕДИЦИНСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
Кинезогидродинамическая оценка скоростных характеристик физической работоспособности животных в фармакологических исследованиях
Н.Н. Каркищенко, В.Н. Каркищенко, Е.Б. Шустов, Н.В. Касинская
ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России», Московская обл. Контактная информация: дм.н, проф. Шустов Евгений Борисович, shustov-msk@mail.ru
Представлены статистические характеристики кинезогидродинамической модели исследования скоростных характеристик физической работоспособности мелких лабораторных животных - белых крыс. Показана возможность использования данной модели в доклинических исследованиях для оценки влияния лекарственных средств на работоспособность животных.
Ключевые слова: работоспособность, кинезогидродинамическая модель, фармакологическая коррекция работоспособности.
К числу самых современных методов исследования физической работоспособности на биологических моделях (крысах) относится кинезогидродинамическая оценка. Основным принтти-пом кинезогидродинамической модели является создание гидроканала с изменяющимся встречным потоком жидкости, который должно преодолевать лабораторное животное. Гидроканал из прозрачного пластика прямоугольной и равнобокой трапециевидной формы, длиной 200 см в поперечном сечении, оснащается с торцевых сторон водосборниками, обеспечивающими ламинарность потоков воды, циркуляционным насосом с регулируемой мощ-
ностью прокачки, теплообменниками для нагрева или охлаждения прокачиваемой жидкости. После включения циркуляционного насоса система стабилизируется на скорости квазиламинарного потока воды не ниже 5-ти м/мин и температуре воды +24°С. Установленные на борту гидроканала градуированная шкала, датчики перемещения животного, видеокамера сопровождения обеспечивают корректную регистрацию ки-незодинамики, скорость перемещения и длительность плавания животного. Несомненным преимуществом модели является возможность плавного изменения нагрузки, в т.ч. имитация финишного рывка животного.
Компьютерная обработка результатов исследования позволяет сопоставлять режимы нагрузок, этапы энергопродукции, признаки утомления животных, что дает возможность получать информацию для всестороннего анализа влияния изучаемых фармакологических средств на физическую работоспособность животных [1, 4].
На рис. 1 представлена принципиальная схема кинезогидродинамической модели. Для исследования кинезогидроди-намических характеристик подопытных
составляла в процессе разработки от 100 до 200 см. Высота уровня жидкости равна 0,2 м.
Преимущество разработанной модели (внешний вид устройства представлен на рис. 2) заключается, прежде всего, в объективизации и визуализации регистрируемых эффектов, получении дополнительной информации, сравнении и корреляции с биохимическими параметрами, исключении субъективных и неточных показателей измерений, имеющихся в других методах.
Рис. 1. Принципиальная схема кинезогидродинамической модели.
Обозначения: 1 - чаша; 2, 3, 4, 5 - торцевые и боковые стенки чаши, соответственно;
6 и 7 - сообщающиеся с атмосферой водосборники; 8 и 9 - входные и сливные отверстия, соответственно; 10 и 11 - трубопроводы; 12 - циркуляционный насос; 13 - регулятор скорости вращения; 14 - домик-приманка; 15 - емкостной датчик отключения системы прокачки;
16 - калибровочная шкала; 17 - датчики перемещения; 18 - видеокамера сопровождения; 19 - датчик температуры; 20 - узел подогрева или охлаждения прокачиваемой жидкости; 21 - компьютер.
животных (лабораторные крысы линии WAG/GY) используют гидроканал (физические размеры чаши гидроканала в виде параллелепипеда прямоугольной формы в поперечном сечении составляют 0,4х0,2х0,4 м). Длина гидроканала
Важной и практически значимой для спортивной медицины характеристикой физической работоспособности являются скоростные параметры (средняя скорость, стартовый и финишный рывок) выполняемой работы. Однако традици-
Рис. 2. Устройство для кинезогидродинамического моделирования физической работоспособности.
онно используемые методы исследования физической нагрузки (тесты вынужденного плавания или бега на тредбане) ориентированы преимущественно на анализ выносливости и не учитывают скоростных характеристик работоспособности.
Наиболее корректно скоростные характеристики работоспособности могут быть оценены только в кинезогидроди-намическом исследовании. При этом в каждый момент времени і собственная скорость перемещения животного в гидроканале должна суммироваться со скоростью встречного потока воды. Для гидроканала со стабильным ламинарным потоком это уравнение имеет следующий вид:
где V. - скорость плавания; У0 - скорость потока воды; У1 - скорость перемещения животного по гидроканалу, равная отношению длины мерного участка к времени его проплыва. Таким образом, для определения скоростных характеристик работо-
способности необходимо знать скорость ламинарного потока в момент тестирования и время прохождения животным мерного участка. Для определения средней скорости учитывается время проплыва всей длины рабочей зоны гидроканала, стартовой и финишной скорости - первых и последних 50 см дистанции.
Для фармакологических исследований основное значение имеет средняя скорость плавания животных. Для обеспечения лучшей сопоставимости результатов скорость потока воды должна быть одинаковой на всем протяжении исследования, так как в случае ее повышения или понижения в силу изменения гидродинамического сопротивления будет меняться и величина нагрузки на животное, и степень его утомления (как правило, нелинейно). При константных значениях скорости потока воды динамика скоростных характеристик работоспособности может быть оценена по первично измеряемому показателю -времени проплыва животного (с учетом обратной пропорциональности величин).
Для отработки статистических параметров модели было выполнено несколько серий исследований с крысами линии WAG/GY, самками массой 200±12,2 г. Скорость встречного потока воды была установлена равной 14 м/мин (0,233 м/с). Такой встречный поток оказывает крысам ощутимое сопротивление и без активного плавания быстро сносит их к торцевой стенке гидроканала.
В первой серии исследований оценивались статистические параметры плавания необученных крыс. Затем на протяжении 3-х дней крыс обучали плаванию в заданном направлении в гидроканале, на меньшей скорости встречного потока воды. Повторное тестирование осуществлялось через сутки после завершения обучения. Результаты статистического описания полученного массива данных представлены в табл. 1 и на рис. 3.
Полученные данные показывают, что без предварительного обучения пла-
ванию параметры выборки животных существенно отличаются от таковых нормального статистического распределения (большая разница между средним значением, модой и медианой, высокие значения асимметрии и коэффициента вариации, размаха вариативности). Обучение плаванию приблизило величины к нормальному распределению, уменьшило размах вариативности за счет сокращения доли медленно плавающих животных. Повысилась доля животных с высокой скоростью плавания. Следовательно, данные, полученные после обучения животных, могут быть распространены на генеральную совокупность, и в исследования должны включаться только животные, прошедшие предварительное обучение плаванию в гидроканале.
Дисперсионный факторный анализ различий между двумя выборками по фактору «Предварительное обучение животных» показал, что они различают-
Таблица1
Описательная статистика продолжительности плавания крыс в гидроканале без и после трехдневного
предварительного обучения
Статистический параметр До обучения После обучения
Среднее 22,93548 15,03774
Стандартная ошибка 1,150015 0,380776
Медиана 20 14,5
Мода 12 15
Стандартное отклонение 11,09035 5,544178
Дисперсия выборки 122,9958 30,73791
Эксцесс 0,493946 0,195039
Асимметричность 1,046279 0,719111
Размах вариативности 45 25
Минимум 10 5
Максимум 55 30
Счет 93 212
Коэффициент вариации 0,48 0,37
а?
и
О
а
Необученные После обучения
Секунды
Рис. 3. Частотный анализ времени проплыва крысами мерного участка кинезогидродинамического устройства.
ся с уровнем значимости р=6*10-13, и 21% вариативности признака (продолжительность проплыва мерного участка) связаны с проведенным их предварительным обучением плаванию в гидроканале.
В фармакологических исследованиях достаточно часто возникают ситуации повторного тестирования животных, при этом сам факт тестирования может оказывать тренировочное значение. В связи с
Таблица 2
Результаты дисперсионного анализа фактора «Тренировка»
Группы Счет Сумма Среднее Дисперсия
Т1 48 739 15,39583 30,92509
Т2 42 652 15,52381 43,08479
Т3 42 659 15,69048 37,14576
Т4 30 390 13 15,7931
Т5 30 449 14,96667 31,75747
Т6 20 299 14,95 10,78684
Дисперсионный анализ
Источник вариации 55 & Мв F Р-значение Fкритическое
Между группами 158,8499 5 31,76998 1,03442 0,398412 2,257909
Внутри групп 6326,848 206 30,71286
Итого 6485,698 211
этим была выполнена серия исследований по оценке дополнительного тренировочного воздействия повторных тестовых исследований. С этой целью предварительно обученные плаванию в гидроканале животные повторно, до 7 раз включительно, с интервалом в 1-2 дня, тестировались на кинезогидродинамической установке. Полученный массив данных был обработан методом однофакторного дисперсионного анализа (фактор «Тренировка»). Было установлено (табл. 2), что центроиды рассеивания подгрупп, сформированных по кратности тренировок от 1 до 6, находятся достаточно тесно, и с уровнем значимости 0,61 составляют общую, не дифференцированную группу. В то же время, 7-кратная тренировка выводит животных на новый уровень устойчивости, сопровождающийся увеличением скорости плавания практически на 30%, и эти отличия от массива тренировок с кратностью от 1 до 6 имеют значимость статистических тенденций (р=0,07).
Следовательно, если планом фармакологического исследования предусмотрено не более 6-ти повторных тестирований работоспособности в кинезогидродина-мической установке, то эффект тренировки при этом еще не развивается, и исследование можно выполнять с единой контрольной группой. Но исследования с большим количеством повторных тестирований уже будут чувствительны к фактору тренировки.
При выбранной нами скорости встречного потока воды (14 м/мин, или 0,234 м/с) у предварительно обученных крыс параметр средней скорости плавания имеет нормальное статистическое распределение (рис. 4), что позволяет использовать эти данные как приближенные к популяционному контролю (табл. 3).
Так как для фармакологических исследований зачастую важны не абсолютные значения скорости плавания животных, а их относительные изменения, то для исследователей может быть
Рис. 4. Частотный анализ распределения скорости плавания крыс в гидродинамическом канале при встречном потоке воды 14 м/мин.
11
Вюте&сше № 3, 2013
Таблица 3
Статистическое описание среднего времени плавания крыс в гидроканале
Статистический параметр Скорость плавания, м/с Скорость плавания, м/мин
Среднее 0,317961 19,07765
Стандартная ошибка 0,002259 0,135543
Медиана 0,309952 18,59714
Мода 0,307333 18,44
Стандартное отклонение 0,032892 1,973535
Дисперсия выборки 0,001082 3,894841
Эксцесс 1,430279 1,430279
Асимметричность 1,124173 1,124173
Интервал 0,183333 11
Минимум 0,270667 16,24
Максимум 0,454 27,24
Счет 212 212
Таблица 4
Шкала стеновых (нормированных баллов) для оценки скорости плавания крыс в гидроканале при встречном потоке воды 14 м/мин
Показа- тель Стены (нормированные баллы)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
сек 30 и более 27-29 22-26 18-21 13-17 11-12 9-10 8 7-6 5 и менее
м/с 0,27 и 0,272- 0,276- 0,285- 0,297- 0,320- 0,335- 0,357- 0,373- 0,430 и
менее 0,275 0,284 0,296 0,319 0,334 0,356 0,372 0,429 более
м/мин 16,2 и 16,3- 16,6- 17,1- 17,8- 19,2- 20,1- 21,5- 22,4- 25,1 и
менее 16,5 17,0 17,7 19,1 20,0 21,4 22,3 25,0 более
предложена шкала стенов (10-бальная нормированная шкала, соотнесенная с генеральной совокупностью). При этом среднее значение для контрольной группы животных равно 5, а сдвиг более чем на 2 стена является статистически значимым с уровнем значимости р=0,05; более чем на 4 стена - с уровнем значимости р=0,01 (табл. 4).
Для фармаколога важным является определить ключевые точки воздействия на анализируемый параметр работоспо-
собности. Очевидно, что скоростные характеристики любой физической работы зависят от активности медиаторных систем мозга, а также от метаболического (энергетического) обеспечения мышечной деятельности. В связи с этим было выполнено исследование скоростных характеристик плавания животных в гидроканале со встречным потоком воды при измененном «медиаторном пейзаже» мозга.
Системное накопление в мозге нейромедиаторов [3] достигалось с помощью
трехдневного приема фармакологических препаратов.
1. Ацетилхолин накапливался за счет применения галантамина (препарат «Ни-валин», в дозе 1 мг/кг, перорально). Это селективный, конкурентный и обратимый ингибитор ацетилхолинэстеразы, который стимулирует преимущественно никотиновые рецепторы и повышает чувствительность постсинаптической мембраны к ацетилхолину. Облегчает проведение возбуждения в нервно-мышечном синапсе и восстанавливает нервномышечную проводимость. Повышая активность холинергической системы, галантамин улучшает когнитивные функции у животных и человека.
2. Гамма-аминомасляная кислота накапливалась в тканях мозга за счет приема экзогенной ГАМК (препарат «Аминалон», в дозе 60 мг/кг, перорально) - ноотропного средства, принимающего участие в нейромедиаторных и метаболических процессах в мозге. ГАМК является основным тормозным нейромедиатором, ГАМК-рецепторы широко распространены в ЦНС человека и млекопитающих и выявляется примерно в 50% нервных окончаний мозга.
3. Серотонин накапливался за счет применения сертралина (препарат «Ци-пралекс», в дозе 1 мг/кг, перорально) -антидепрессанта, селективного ингибитора обратного захвата преимущественно серотонина, не взаимодействующего с м- холино-, серотониновыми, допамино-выми, гистаминовыми, адрено-, ГАМК- и бензодиазепиновыми рецепторами.
4. Дофамин накапливался в тканях мозга за счет применения накома (препарат «Наком», в дозе 180 мг/кг, перорально)
- противопаркинсонического средства, устраняющего или уменьшающего напряженность мышц, скованность движе-
ний, затем уменьшающего дрожание рук, головы, признаки паркинсонизма и модулирующего поведение и двигательную активность животных. Наком содержит L-ДОФА (предшественник дофамина) и карбидопу (периферический ингибитор фермента ДОФА-декарбоксилазы, разрушающего L-ДОФА в крови и периферических тканях). В результате действия Накома происходит накопление L-ДОФА в крови до уровня проницаемости гемато-энцефалического барьера и ее эффективное накопление в тканях мозга.
5. Норадреналин накапливался за счет применения атомоксетина (препарат «Страттера», в дозе 1 мг/кг, перорально)
- высокоселективного мощного ингибитора пресинаптических переносчиков но-радреналина с минимальным сродством к другим норадренергическим рецепторам. Атомоксетин не относится к психостимуляторам, нормализует дефицит внимания и гиперактивность животных и человека.
Тестирование физической работоспособности лабораторных животных осуществлялось в описанной выше кине-зогидродинамической установке на предварительно обученных крысах ежедневно, через 1-1,5 ч после введения препарата. Достоверность различий с контролем оценивалась методом однофакторного дисперсионного анализа (факторы «Прием препарата» и, если фактор приема препаратов был значимым, то дополнительно проводился анализ по фактору «Длительность приема препарата»).
Результаты влияния изменения «меди-аторного пейзажа» на скорость плавания животных в гидроканале представлены в табл. 5 и на рис. 5.
Анализ полученных данных показывает, что трехдневное накопление в тканях мозга ацетилхолина и норадреналина способствует достоверному (на 10%, р=0,02)
13
Віоте&сіпе № 3, 2013
Таблица 5
Влияние изменения «медиаторного пейзажа» на скорость плавания крыс в гидроканале
Медиатор Скорость плавания, м/мин, по дням приема
1 2 3
Контроль 19,1±0,1
Ацетилхолин 17,5±0,2 20,2±0,5 21,1±0,6
% от контроля 92 р=0,05 106 р=0,07 110 р=0,02
ГАМК 18,0±0,4 20,0±0,8 19,4±0,6
% от контроля 94 р=0,25 105 р=0,18 101 р=0,41
Серотонин 17,9±0,1 19,0±0,4 19,1±0,4
% от контроля 94 р=0,35 99 р=0,60 100 р=0,45
Дофамин 16,9±0,2 15,6±0,1 15,5±0,1
% от контроля 88 р=0,0001 81 р=8*10-28 80 р=3*10-30
Норадреналин 18,9±0,4 18,9±0,4 20,8±0,2
% от контроля 99 р=0,70 99 р=0,65 109 р=0,02
120
100
* 80
§
О.
І бо
X
I-
о
40
20
П 1
■ ГМ
□ 3
Галантамин Аминалон Ципралекс Наком Страгтера
Рис. 5. Влияние кратности приема препаратов на скорость плавания крыс.
повышению скорости плавания животных, причем накопление ацетилхолина в первые сутки может снизить скорость плавания (в среднем, на 8%, р=0,05), но уже при втором приеме галантамина наблюдается небольшой прирост этого показателя к уровню контрольных животных (+6%, р=0,07). Повышение концентрации в тканях мозга ГАМК и серотонина не влияло на скорость плавания животных, а дофамина - существенно
ухудшало этот показатель (однократный прием Накома снижал скорость плавания, в среднем, на 12%, последующие второй и третий приемы - на 19-20%).
Для трех препаратов, продемонстрировавших достоверное влияние на скорость плавания животных, был выполнен дисперсионный анализ фактора «Длительность приема препарата». Его результаты для Галантамина представлены в табл. 6.
Таблица 6
Результаты дисперсионного анализа фактора «Длительность приема препарата» для Галантамина
Группы Счет Сумма Среднее Дисперсия
Т1 6 105,0152 17,50254 0,343565
Т2 6 121,4067 20,23444 1,299741
Т3 6 126,4352 21,07254 1,904766
D = 0,702152
Дисперсионный анализ
Источник вариации SS df MS F Р-значение F критическое
Между группами 41,82133 2 20,91067 17,68059 0,000113 3,68232
Внутри групп 17,74036 15 1,18269
Итого 59,56169 17
Таким образом, эффект приема Га-лантамина существенно и достоверно (коэффициент детерминации D=0,70; p=0,0001) зависит от длительности его применения.
Для Норадреналина (препарат «Страт-тера») фактор длительности приема был несколько менее значим (коэффициент детерминации D=0,44; p=0.01). Особенно выраженное значение фактор длительности приема играл для дофаминового звена (препарат «Наком»): повторное применение препарата усиливало его негативное влияние на скорость плавания животных (коэффициент детерминации D=0,83; p=2*10-6).
Для проверки влияния вектора метаболического обеспечения физической работы на скорость плавания животных были проведенні испытания специализированного продукта спортивного питания «МиоАктив-Спорт» [2]. В состав продукта входят легкоусвояемые полноценные белки и полипептиды животного происхождения, среднецепочечные триглицериды, мальтодекстрин, лецитин, минералоорганические формы макро- и
микроэлементов (в т.ч. гемового железа из гемоглобина, органического йода в виде йодированных молочных сывороточных белков, биогенного кальция из яичной скорлупы), природный поливитаминный комплекс из сублимированных ягод и плодов, субстраты цикла Кребса (лимонная и янтарная кислоты), нерастворимые и растворимые пищевые волокна. Указанный пищевой комплекс вводился крысам в эквивалентных рекомендуемым для спортсменов дозах, 1 раз в день перорально, ежедневно на протяжении 21 дня. На 2-й, 7-й, 14-й, 21-й дни приема, а также спустя 7 дней после его прекращения (для выявления следовых эффектов) проводилось тестирование физической работоспособности животных на кинезогидродинамической модели. Результаты исследования представлены в табл. 7 и на рис. 6.
Таким образом, специализированное спортивное питание «МиоАктив-Спорт» начинает оказывать положительное влияние на скорость плавания лабораторных животных уже со 2-го дня приема. Особенно заметным это влияние стано-
Таблица 7
Влияние приема рецептуры «МиоАктив-Спорт» на скорость плавания животных в гидроканале
Группа Скорость плавания, м/мин, по дням исследования
2 7 14 21 28
Контроль 19,1±0,1
МиоАктив-Спорт % от контроля 19,7±0,5 103 р=0,08 20,2±0,5 105 р=0,04 23,9±0,7 125 р=1*10-5 24,6±0,7 128 р=2*10-6 23,1±0,8 121 р=1*10-4
Г
«I
I-
и
101
9 /
8 ✓
7- ✓
6 ✓
5 ✓
4 ✓
3 ✓
2- 1
ґ
7 14 21
Дни исследования
28
Рис. 6. Влияние курсового приема рецептуры «МиоАктив-Спорт» на скорость плавания животных (в нормированных по популяции баллах (стенах)).
Примечание: 0 - значение для контрольной группы; 2, 7, 14, 21 - дни приема «МиоАктив-Спорт»; 28 -значения через 7 дней после его прекращения (следовой эффект).
вится к 14-му дню приема (+25% к контролю). Дальнейший прием рецептуры «МиоАктив-Спорт» не усиливает скоростные характеристики работоспособности животных, однако важным показателем является достаточно длительное сохранение (не менее 7-ми дней) полученного результата.
Выводы
1. Кинезогидродинамическая модель является адекватной для исследования скоростных характеристик физической работоспособности лабораторных животных.
2. Статистическое распределение скорости плавания животных в гидроканале
при встречном потоке воды со скоростью 14 м/мин соответствует критериям нормального распределения, а полученные статистические параметры могут быть распространены на генеральную совокупность.
3. Предложенная в статье нормированная по генеральной совокупности бальная шкала (шкала стенов) является удобным инструментом в фармакологических исследованиях.
4. Поиск фармакологических средств, повышающих скоростные качества животных при выполнении ими физической работы, целесообразно вести среди лекарственных средств, обеспечивающих накопление ацетилхолина и норадренали-
на в нервной системе, или среди средств метаболического действия, улучшающих энергетические и пластические процессы в организме.
5. Накопление дофамина в ЦНС не является желательным для повышения скоростных характеристик работоспособности.
6. Накопление ГАМК и серотонина в ЦНС не сопровождается повышением скоростных качеств физической работы.
7. Специализированный продукт спортивного питания «МиоАктив-Спорт» может быть рекомендован для приема спортсменами, тренирующими скоростно-силовые качества.
Список литературы
1. Каркищенко В.Н, Каркищенко
Н.Н. Методы доклинических исследований в спортивной фармакологии // Спортивная медицина. №2 1. 2013. С. 7-17.
2. Каркищенко В.Н, Фокин Ю.В, Ка-синская Н.В., Семенов Х.Х., Степанова О.И, Люблинский СЛ, Берзин ИА, Колышев И.Ю. Влияние рецептуры «МиоАктив-Спорт» на психофизические показатели лабораторных крыс // Биомедицина. 2012. № 4. С. 22-31.
3. Каркищенко Н.Н. Фармакология системной деятельности мозга. - Р-н.-Д.: Ростиздат. 1975. 260 с.
4. Каркищенко Н.Н., Каркищенко В.Н. Кинезогидродинамическая модель для оценки выносливости и работоспособности лабораторных животных // Биомедицина. 2012. № 4. С. 6-14.
The kinezohydrodinamic assessment of high-speed characteristics of physical efficiency of animals in pharmacological researches
N.N. Karkischenko, V.N. Karkischenko, E.B. Shustov, N.V. Kasinskaya
The statistical characteristics of kinezohydrodinamic model of research of high-speed characteristics of physical efficiency of small laboratory animals - white rats are submitted. Possibility of its use in preclinical researches for an assessment of influence of medicines on efficiency of animals is shown.
Key words: working capacity, kinezohydrodinamic model, pharmacological correction of working capacity.
