CC BY
69
УДК 543.544 Кубанский научный медицинский вестник № 3 (108) 2009
Г. Б. ГОЛУБИЦКИЙ
КИНЕТИКО-ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ 2-АМИНОЭТИЛСЕРНОЙ КИСЛОТЫ В РЕАКЦИОННОЙ СМЕСИ ПРИ СИНТЕЗЕ ТАУФОНА
ОАО «Фармстандарт-Лексредства» Россия, 305909, г. Курск, ул. 2-я Агрегатная, 1а/18, тел.: (47122) 6-01-65, 8-903-877-26-32. E-mail: iirogirg@narod.ru
Предложена оригинальная кинетико-хроматографическая методика определения промежуточного продукта синтеза тауфона - 2-аминоэтилсерной кислоты. Для повышения чувствительности определения и оптимизации удерживания определяемого вещества проводили предколоночную дериватизацию п-диметиламино-бензальдегидом. В связи с длительным протеканием реакции дериватизации использован кинетический подход на основе метода тангенсов. Определены метрологические характеристики методики, подтверждены достоверность и воспроизводимость получаемых результатов. Разработанная методика может быть использована для контроля технологического процесса, в комплексе работ по усовершенствованию технологии, а также для аналитического контроля готового продукта.
Ключевые слова: тауфон, 2-аминоэтилсерная кислота, предколоночная дериватизация, кинетико-хроматографическое определение, метод тангенсов.
G. B. GOLUBITCKII
KINETIC-CHROMATOGRAPHIC DETERMINATION OF 2-AMINOETHYLSULPHURIC ACID
IN TAURIN REACTION MIXTURE
JSC «Pharmstandard-Lecsredstva», Russia, 305909, Kursk, 2-d Agregatnaya str, 1a/18, tel.: (47122) 6-01-65, 903-877-26-32. E-mail: iirogirg@narod.ru
An original kinetic-chromatographic method was proposed for determination of 2-aminoethylsulphuric acid, an intermediate product of taurin synthesis. To increase the determination sensitivity and optimize the analyte retention the pre-column derivatization with p-dimethylamino-benzaldehyd was carried. In connection with the long derivatization reaction a kinetic approach based on tangent method was used. The metrological characteristics were determined, the accuracy and precision were substantiated. The method developed may be used for chemical process control and for quality control of taurin.
Key words: taurin, 2-aminoethylsulphuric acid, pre-column derivatization, kinetic-chromatographic determination, the tangent method.
Тауфон (ТФ) - ценное лекарственное средство, широко применяемое в офтальмологической практике. Промежуточным продуктом при синтезе ТФ является 2-аминоэтилсерная кислота (АЭСК). В связи с этим для контроля технологического процесса необходима достоверная и точная методика определения АЭСК. Данная задача непроста, поскольку это вещество имеет высокую полярность и практически не удерживается на обращенно-фазовых хроматографических сорбентах. Нормально-фазовая система для поставленной цели также неприемлема, поскольку АЭСК практически не растворима в органических растворителях. Дополнительную проблему создают оптические свойства АЭСК: как показали наши предварительные эксперименты, к этому веществу малочувствительны спектрофотометрический и рефрактометрический детекторы. В литературе мы не нашли методик определения АЭСК, но ознакомились с подходами к модификации свойств аналогичных соединений для хроматографического анализа. Речь идет о предколоночной дериватизации. Такой прием использовали перед хроматографированием при анализе энантиомеров аминокислот (модифицирующие реагенты о-фталевый альдегид и ^аце-
тил-1_-цистеин) [3, 4], изониазида (дериватизация с 5-метилфуран-2-карбоксиальдегидом) [7], тироидных гормонов (дериватизация с 9-антроилнитрилом) [8]. Предколоночную дериватизацию с целью введения в молекулу определяемого вещества хромофоров с последующим спектрофотометрическим детектированием использовали при анализе смеси ацетилцис-теина и каптоприла (модифицирующий реагент бромид 1-бензил-2-хлорпиридина) [5].
Этот прием можно использовать и для улучшения параметров удерживания модифицированных сорба-тов. Так, превращение сульфаниламидов в азокрасители улучшает разделение компонентов [6]. Вся эта информация позволила предположить, что предколо-ночная дериватизация может оказаться эффективной и при хроматографическом определении АЭСК. Описание проведенного исследования и изложение полученных результатов - цель предлагаемой статьи.
Методика исследования
В работе использовали жидкостные хроматографы Waters Alliance 2695 с диодно-матричным детектором 2996 и двухволновым спектрофотометрическим детектором 2487. «Мертвый объем» приборов
согласно паспорту не более 0,65 мл. Разделение проводили на колонке размером 250x4,6 мм с пред-колонкой размером 12,5x4,6 мм, заполненных обра-щенно-фазовым сорбентом Hypersil BDS C18 с размером частиц 5,0 мкм (Agilent Technologies, США) при температуре колонки 40±1° С и образцов 25±1° С. Использовали ацетонитрил «для хроматографии», ортофосфорную кислоту, калий фосфорнокислый однозамещенный, сульфит натрия, п-диметиламино-бензальдегид (ДМАБА), ванилин, анисовый альдегид и нингидрин фирмы «Мерк» (Германия), сверхчистую воду из установки Direct Q5 (Millipore), а также ТФ (проверен отделом контроля качества в соответствии с НД) и АЭСК (очищена в соответствии с технологическим регламентом, чистота подтверждена определением температуры плавления).
Для приготовления испытуемого раствора в мерную колбу вместимостью 50 мл помещали 0,5 г сульфита натрия, 8,0 мл раствора реакционной смеси, перемешивали до растворения сульфита, прибавляли 10 мл ацетонитрила, перемешивали, прибавляли 5,0 мл 10%-ного раствора ДМАБА в ацетонитриле, перемешивали, доводили объем раствора водой до метки и снова перемешивали. Для получения раствора реакционной смеси 1,0 мл ее помещали в мерную колбу вместимостью 250 мл, доводили объем раствора водой до метки и перемешивали.
Для приготовления раствора стандартных образцов (РСО) около 0,500 г сульфита натрия помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляли 10,0 мл раствора ТФ с концентрацией 2,0 мг/мл и перемешивали до растворения соли. Прибавляли 1,0 мл раствора АЭСК, перемешивали, прибавляли 10 мл ацетонитрила, перемешивали, прибавляли 5,0 мл 10%-ного рас-
твора ДМАБА, перемешивали, доводили объем раствора водой до метки и перемешивали. Для получения раствора АЭСК около 0,080 г вещества растворяли в воде в мерной колбе вместимостью 100 мл.
Полученные растворы фильтровали через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм и тотчас анализировали на жидкостном хроматографе в градиентном режиме с использованием элюентов А: ацетонитрил; Б: (1:1) ацетонитрил - 0,025 М калия фосфат однозамещенный рН 3,0 (добавление ортофосфорной кислоты); В: 0,025 М калия фосфат однозамещенный рН 3,0 (добавление ортофосфорной кислоты) с изменением состава подвижной фазы в течение анализа согласно программе:
Время, мин Элюент, %
А Б В
0 0,0 20,0 80,0
15,00 20,0 80,0 0,0
16,00 20,0 80,0 0,0
17,00 0,0 20,0 80,0
20,00 0,0 20,0 80,0
Расход подвижной фазы составил 1,0 мл/мин, объем проб 10,0 мкл.
Содержание АЭСК в реакционной смеси в мг/мл рассчитывали по формуле:
ДБ1*а0* 1 * 250 * 50 ДБ/ а0 *5
Х =---------------------=-----------------,
ДБ0* 100 * 50 * 1 * 8 ДБ0* 16
Таблица 1
Воспроизводимость площадей параллельных инжекций и разностей между площадями последовательных инжекций для пика продукта взаимодействия АЭСК с ДМАБА
Образец Прибор Раствор S1, мкВ*с sr, % S2mkB*c sr, % ASmkB*c sr, %
1 1 1 75 384 58,47 359 701 24,89 284 317 18,26
2 74 636 354 682 280 046
3 72 851 361 175 288 324
2 1 22 885 225 619 202 734
2 26 152 228 919 202 767
3 19 074 222 960 203 886
2 1 1 37 864 43,66 309 670 14,66 271 806 11,48
2 68 045 316 004 247 959
3 53 556 314 775 261 219
2 1 34 109 247 676 213 567
2 24 096 235 262 211 166
3 23 390 236 888 213 498
3 1 1 60 541 58,85 314 894 19,34 254 353 11,45
2 75 496 321 273 245 777
3 82 808 324 007 241 199
2 1 20 782 225 372 204 590
2 24 663 222 722 198 059
3 23 846 224 395 200 549
Кубанский научный медицинский вестник № 3 (108) 2009
Кубанский научный медицинский вестник № 3 (108) 2009
Таблица 2
Результаты определения 2-аминоэтилсерной кислоты в образцах реакционной смеси
Образец Содержание 2-аминоэтилсерной кислоты, мг/мл (n=6, Р=0,95)
хср s ^ср р х° с £, %
1 27,60 2,36 0,96 2,48 8,97
2 26,95 0,86 0,35 0,90 3,35
3 25,53 0,63 0,26 0,66 2,59
Таблица 3
Метрологические характеристики методики определения 2-аминоэтилсерной кислоты в реакционной смеси (п=17; Р=0,95)
Smax S2 max ^ % er ср, % r ср7 Aer, % e , % r max к корр
1,98 *10-3 3,92*10-6 42,57 -0,128 2,76 8,09 0,995
Хроматограмма раствора РСО для определения 2-аминоэтилсерной кислоты в реакционной смеси тауфона: 1 - продукт взаимодействия тауфона с ДМАБА, 2 - продукт взаимодействия 2-аминоэтилсерной кислоты с ДМАБА, 3 - ДМАБА
где ДБ1 и ДБ0 - разности площадей пиков продукта взаимодействия АЭСК с ДМАБА между второй S2 и первой S1 хроматограммами для испытуемого раствора и раствора РСО соответственно;
а0 - масса навески АЭСК, взятой для приготовления раствора РСО, в миллиграммах.
Результаты и их обсуждение
В качестве возможных дериватизирующих реагентов были изучены анисовый альдегид, ванилин, нингидрин и ДМАБА. Известно, что карбонильные соединения вступают в реакцию конденсации с веществами, имеющими первичную аминогруппу, причем для этих реакций обычно требуется кислая среда. Вместе с тем отмечается, что зависимость скорости этой реакции от рН имеет максимум, положение которого зависит от свойств каждого из реагирующих веществ [2]. В связи с этим оптимальной для проведения дериватизации может оказаться не кис-
лая, а слабощелочная среда. Так, при дериватизации аминокислот при помощи о-фталевого альдегида и -аце-mn-L-цистеина в реакционную смесь добавляли раствор тетрабората натрия с рН 9,6 [3, 4].
Наши эксперименты показали, что ТФ и АЭСК в интервале рН 1,0-10,0 не реагируют с изученными реагентами, кроме ДМАБА. Анализ соответствующих растворов методом ВЭЖХ при описанных выше условиях показал наличие в растворах только чистых веществ. В то же время на хроматограммах смесей ТФ, АЭСК и ДМАБА, приготовленных по описанной выше методике, регистрируются два дополнительных пика, которые идентифицированы нами как продукты взаимодействия ТФ и АЭСК с ДМАБА (рисунок). Спектры поглощения этих веществ, полученные с помощью диодно-матричного детектора в режиме on line, идентичны. Однако их удерживание в использованной хроматографической системе различно.
В нашей работе экспериментально установлено, что максимальный выход продуктов реакции наблюдается не в кислой, а в слабощелочной среде в присутствии сульфита натрия - именно при этих условиях наблюдается максимум в соответствии с условиями [2]. Однако для получения методики, обеспечивающей достоверность и точность определения АЭСК, следовало решить еще одну проблему: выяснилось, что используемая реакция дериватизации не достигала равновесия даже в течение суток. Приемлемые способы ускорения процесса (изменение рН, повышение температуры) положительного результата не дали. В связи с этим было принято решение использовать кинетический подход. При этом принимали возможность использования как метода фиксированного времени (определение концентрации по площади пика продукта реакции в определенный момент времени), так и метода тангенсов (по скорости изменения площади пика продукта реакции в начальном периоде реакции) [1]. Для выбора оптимального варианта провели анализ трех образцов реакционной смеси в одинаковых условиях, с использованием одной и той же хроматографической колонки, но в разных лабораториях на разных приборах. Для каждого образца готовили по три испытуемых раствора, для каждого раствора получали по две хромато-грам-мы. Полученные результаты представлены в табл. 1. Площади пика продукта реакции АЭСК с ДМАБА на приборе 2 получились меньше, несмотря на равенство анализируемых концентраций. В связи с этим воспроизводимость площадей вторых инжекций лучше, чем первых, а для разности площадей еще выше. По этой причине было принято решение использовать метод тангенсов как обеспечивающий более высокую меж-лабораторную воспроизводимость результатов. Такой подход в нашем случае приемлем, так как было установлено, что как минимум первые 35 мин реакции площадь пика АЭСК - ДМАБА возрастает линейно.
По предлагаемой методике были проанализированы пробы реакционных смесей, отобранные в конце технологического процесса. Полученные результаты представлены в таблице 2. Для подтверждения достоверности результатов, получаемых с помощью предлагаемой методики, были проанализированы модельные растворы, содержащие ТФ и АЭСК. Концентрация ТФ во всех растворах была одинаковой, соответствующей его содержанию в начале технологического процесса. Концентрацию АЭСК варьировали в диапазоне от 20 до 160% от предельно допустимой. В качестве предельно допустимой концентрации приняли 25 мг/мл -
величину, близкую к найденным результатам (табл. 2). Результаты, полученные при анализе модельных растворов, представлены в таблице 3. Среднее значение относительной погрешности e меньше по абсолютной величине соответствующего доверительного интервала Aer, следовательно систематическая погрешность анализа отсутствует. В изученном интервале разность площадей пика АЭСК - ДМАБА между второй и первой инжекциями линейно зависит от концентрации определяемого вещества (Ккорр = 0,995).
Предлагаемая методика будет использована для контроля технологического процесса и научно-производственных исследований, направленных на усовершенствование технологии.
ЛИТЕРАТУРА
1. Перес-Бендито Д., Сильва М. Кинетические методы в аналитической химии. - М.: Мир, 1991. - 400 с.
2. Робертс Д., Касерио М. Основы органической химии. - М.: Мир, 1978. - Т. 1. - 848 с.
3. Чернобровкин М. Г., Ананьева И. А., Шаповалова Е. Н., Шпигун О. А. Определение энантиомеров аминокислот в фармацевтических препаратах методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии // Журн. аналит. химии. - 2004. -Т. 59. № 1. - С. 64-72.
4. Чернобровкин М. Г., Кольцова Н. В., Шепелев Б. Н. Определение аминокислот в препарате «Элтацин» // Фармация. - 2004. -Т. 53. № 5. - С. 18-20.
5. Bald E, Sypniewski S. Determination of thiol drugs in pharmaceutical formulations as their S-pyridinium derivatives by highperformance liquid chromatography with ultraviolet detection. Short communication // Fresenius’ J. Anal. Chem. - 1997. - V. 358. № 4. -P.554-555.
6. Garcia-Alvarez-Coque M. C., Simo-Alfonso E. F., Ramis-Ramos G., Esteve-Romero J. S. High-performance micellar liquid chromatography determination of sulphonamides in pharmaceuticals after azodye precolumn derivatization // J. Pharm. Biomed. Anal. -1995. - V. 13. № 3. - P. 237-245.
7. Khuhawar M. Y., Rind F. M. A., Rajper A. D. High-performance liquid chromatographic determination of izoniazid, pyrazinamide and indomethacin in pharmaceutical preparations // Acta Chromatogr. -2005. - № 15. - P. 269-275.
8. Takahashi M., Nagashima M., Shigeoka S., Kamimura H., Kamata K. Determination of thyroid hormones in pharmaceutical preparations, after derivatization with 9-anthroylnitrile, by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection. Short communication // J. Chromatogr. A. - 2002. - V. 958. № 1-2. - P. 299-303.
Поступила 26.02.2009
Г. Б. ГОЛУБИЦКИЙ1, Т. М. ПОКРОВСКАЯ2, В. С. ПАНЬЖИН3, Е. В. БУДКО3, Э. Ф. СТЕПАНОВА4
КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ КОМПЛЕКСНОГО АНАЛЬГЕТИКА
НА ОСНОВЕ ИБУПРОФЕНА ПРИ ПОМОЩИ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ КОЛОНКИ НОВОГО ТИПА
ОАО «Фармстандарт-Лексредства», Россия, 305039, г. Курск, ул. 2-я Агрегатная, 1а/18; 2кафедра фармакологии ГОУ ВПО КГМУ Росздрава, Россия, 305041, г. Курск, ул. Карла Маркса, 3; 3кафедра фармацевтической, токсикологической и аналитической химии ВПО КГМУ Росздрава,
Россия, 305041, г. Курск, ул. Карла Маркса, 3;
4кафедра технологии Пятигорской государственной фармацевтической академии
Кубанский научный медицинский вестник № 3 (108) 2009 УДК 543.544
