CC BY
17
УДК 544.032.65; 544.4; 577.344; 519.65
КИНЕТИКА СВЕТОКИСЛОРОДНОГО ЭФФЕКТА В ВОДНЫХ РАСТВОРАХ БЕЛКОВ
А. В. Шкирин1'2, Н.В. Суязов1, С.Н. Чириков2, В.Е. Иванов3, С. В. Гудков1'4
Рассмотрены молекулярные механизмы участия белков в генерации активных форм кислорода (АФК) в результате синглет-кислородного эффекта, возникающего под действием лазерного излучения в растворах различных белков. Выведены кинетические уравнения, описывающие генерацию АФК, и найдено их приближенное общее решение в аналитическом виде. Путем сопоставления найденных кинетических зависимостей с данными эксперимента определены порядки и константы скорости соответствующих химических реакций. Анализ результатов позволяет считать, что фундаментальные механизмы реакций образования АФК в растворах различных белков одинаковы.
Ключевые слова: белковые растворы, активные формы кислорода, пероксид водорода, светокислородный эффект, кинетические уравнения.
1. Введение. Активные формы кислорода (АФК) постоянно образуются в аэробных клетках в результате нормального метаболизма [1] и при воздействии внешних факторов среды [2]. Световое воздействие (обычно при использовании лазеров) на биохимические системы, приводящие к образованию АФК, называется в литературе светокис-лородным эффектом [3]. Актуальность данной темы связана, в частности, с тем, что увеличение внутриклеточной концентрации АФК свыше уровня антиоксидантной защиты вызывает "окислительный стресс", который сопровождается повреждениями биологических жизненно важных структур, приводя к перекисному окислению липидов,
1 ИОФ РАН, 119991 Россия, Москва, ул. Вавилова, 38; e-mail: avshkirin@mephi.ru.
2 НИЯУ "МИФИ", 115409 Россия, Москва, Каширское ш., 31.
3 Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290 Россия, г. Пущино, Московская обл., ул. Институтская, 3.
4 МФТИ, 141701 Россия, Московская область, г. Долгопрудный, Институтский переулок, 9.
окислительной модификации нуклеиновых кислот и белков и нарушению процессов, необходимых для жизнедеятельности клеток. Однако установлено, что АФК оказывают не только повреждающее воздействие, но выполняют в организме еще и сигнально-регуляторную роль, связанную с нарушением окислительно-восстановительного гомео-стаза. Это приводит к активации адаптационных и защитных процессов в клетках путем экспрессии генов антиоксидантной защиты, репарации ДНК и др. [4]. Например, в организме млекопитающих небольшое изменение содержания пероксида водорода, вызванное различными физическими воздействиями, может быть основой терапевтических процедур [5].
Целью данной работы было построение кинетической модели образования АФК в водных растворах белков при облучении гелий-неоновым лазером на длине волны 632.8 нм и нахождение значений порядков и констант скоростей соответствующих химических реакций по экспериментально измеренным зависимостям концентрации перекиси водорода от времени и концентрации растворенного белка в водных растворах бычьего гамма-глобулина (БГГ) и бычьего сывороточного альбумина (БСА). Концентрация Н2О2 определялась по интенсивности хемолюминесценции на приборе "Биотокс-7А" [6].
2. Синглет-кислородные реакции в водных растворах белков. Переходы в столкно-вительных комплексах (димолях) растворенного в воде кислорода в триплетном состоянии 3^-(3^- + ^ 1Дд + 1Дд) с поглощением света на длине волны ~630 нм (ширина полосы 18 нм) позволяют использовать излучение гелий-неонового лазера с длиной волны 632.8 нм для генерации кислорода в синглетном состоянии 1Дд [3]. При взаимодействии синглетного кислорода с ионами гидроксила и водорода образуются гидроксил, гидроперекисный радикал и пероксид водорода [6]
он - +1 о 2 + ^ •он + но2 ^ Н2О3 ^ Н2 О2 +102, (1)
НО\ + НО2 ^ Н2О2 + 1О2, (2)
•он + •ОН ^ Н2О2. (3)
Реакция •ОН с атомом водорода при а-углеродном атоме полипептидной цепи в молекуле белка Р приводит к отрыву атома водорода и образованию а-углеродного радикала
[7]:
р + •ОН ^ РСа + Н•. (4)
В результате реакции а-углеродного радикала с синглетным кислородом образуется пероксильный радикал белка [8]:
РСа + 102 ^ РсаОО•. (5)
Далее происходит элиминация гидропероксида из пероксирадикала белка
2РсаО(Г + Н• ^ 2Ре + НО\ (6)
и дополнительное образование пероксида водорода за счет дисмутации гидроперекис-ных радикалов по реакции (2). Наряду с этим при взаимодействии с синглетным кислородом происходит также модификация ряда боковых аминокислотных остатков [9]. Если суммировать реакции (4) и (5), то получим образование пероксирадикала белка
Р + •ОН + 102 ^ РсаОО• + Н (7)
в результате совместного действия на белок гидроксильных радикалов и синглетно-го кислорода. Пероксирадикал белка является долгоживущей активной формой белка (ДАФБ). Дальнейшее превращение ДАФБ сопровождается выделением гидропероксида, дисмутация двух молекул которого приводит к образованию пероксида водорода:
2РсаОО' + Р ^ 2Ре + Н2О2 + 1О2, (8)
где Ре - конечный продукт превращения ДАФБ из исходного белка. Однако для немонотонной зависимости концентрации пероксида водорода от времени с участием ДАФБ, дополнительно необходима ещё одна реакция разложения его белком:
2Н2О2 + Р ^ 2Н2О + 1О2. (9)
Описанная ниже кинетическая модель предсказывает существование реакции (9), которая является некаталитической формой каталазной активности всех белков, как это представлено в работе [10].
3. Упрощенная модель химической кинетики. Как следует из раздела 2, кинетика генерации пероксида водорода в эксперименте может быть описана упрощенной минимальной системой химических уравнений:
Р + 1О2 Ре + НО^ (10)
НО2 + НО%
к2
Н2О2 + О 2
11)
2Н2О2 + 2Р 2Н2О + 1О2 + 2Р, (12)
2Н2О2 А 2Н2О + О2. (13)
Реакция (10) описывает процесс образования радикала НО2, который, в свою очередь, приводит к образованию перекиси Н2О2 в соответствии с (11). В предложенной модели рассматриваются два канала распада перекиси: (12) - распад вследствие каталазной активности белка и (13) - самораспад. Для реакций распада характерно несовпадение экспериментально определяемых порядков этих реакций с формальными стехиометри-ческими коэффициентами; эти порядки могут быть как целыми, так и дробными [23]. Поэтому кинетические уравнения для концентраций АФК (НО^ и Н2О2), соответствующие приведенной выше системе химических реакций, запишем в общем виде:
(¡НОЦсИ = [Р] ■ С1 О2] - 2к2 ■ [НО1 ]2, (14)
йН2О21йЬ = к2 ■ [НО2Ч2 - 2к3 ■ [Р]7 ■ [Н2О/ - 2к4 ■ [Н2О2]а, (15)
где к (г = 1... 4) - константы скоростей соответствующих реакций и а, в, 7 - порядки реакций распада перекиси водорода. Значения а, в, 7 подлежат определению, исходя из данных эксперимента.
4. Зависимости концентрации перекиси водорода от концентрации белка в водных растворах БСА и БГГ. Применяя условие стационарности промежуточных продуктов к системе (10)—(13), то есть условие равенства прихода и убыли для Н2О2 и НО^, получаем
к1[Р] ■ [1О2] = 2к2 ■ [НО2Ч2, (16)
к2 ■ [НО2Ч2 = 2 ■ к3 ■ [Р]7 ■ [Н2О2]в + 2 ■ к4 ■ [Н2О2]а (17) после подстановки (16) в (17) имеем:
к1[Р] ■ [1О2] = 4 ■ к3 ■ [Р]7 ■ [Н2О2]в + 4 ■ к4 ■ [Н2О2]а. (18)
Известно [11, 12], что реакция самораспада перекиси водорода (13) имеет порядок 1 < а < 2. Разумно предположить, что реакция разложения перекиси белком (12) описывается, аналогично самораспаду, порядком по перекиси 1 < в < 2. Порядок реакции
Рис. 1: Концентрация Н202 в зависимости от концентрации белка при воздействии излучения Не-Ые лазера (3 мВт) в течение 30 минут на водный раствор: (а) БГГ; (б) БСА. Кружки - экспериментальные значения концентрации Н2 02. Сплошные линии - теоретические кривые, полученные аппроксимацией экспериментальных точек методом Левенберга-Марквардта.
(12) по белку заранее нам не известен, однако он не может существенно превышать порядок по перекиси, поэтому имеет смысл искать его в диапазоне 1 < 7 < 3.
Результаты измерений зависимости концентрации Н2О2 от концентрации БГГ и БСА показаны на рис. 1. Численная оптимизация решения уравнения (18) в соответствии с экспериментальными данными (рис. 1), проведенная на множестве целочисленных значений а, в, 7, дает значения 7 = 2, а = 1, в =1, при которых зависимость концентрации перекиси от концентрации белка имеет вид:
ШО 1=1 к1 • [р] ■ [1°2]
[Я2°2] = 4 ' кз[Р]2 + к4 • Эту зависимость можно представить в виде функции
х 4 ■ к3 4 ■ к4
у(х)
Ь
:19)
(20)
ах2 + Ь' ~ к1 ■ [1О2^ к1 ■ [Ю2Г Коэффициенты (а,Ь) искались нами путем минимизации функционала отклонений функции (20) от экспериментальных данных методом Левенберга-Марквардта [13-15]; найденные значения (а, Ь) приведены в табл. 1.
Таблица 1
Параметры модельной функции у(х) (20)
Белок 2 —2 а, л -мкмоль 2 Ь
БГГ 54.629 287.657
БСА 16.835 259.394
5. Динамика образования перекиси водорода в водных растворах БСА и БГГ. Учитывая найденные в разделе 4 значения порядков реакций 7 = 2, а = 1, в = 1, запишем систему кинетических уравнений (14)—(15) в следующем функциональном виде (г(¿) = [НО£], у(£) = [Н202]) со свободными коэффициентами (А, В, С):
Н Н
-*(*) = А - 2Вг(¿)2, -у(*) = Вг(*)2 - Су(*), у(0) = уо, г(0) = *,.
Зависимость от времени у(£) будет иметь максимум при выполнении условия г0 > В этом случае решение системы (21) имеет вид
*(*) = coth ( + агееоЛ ( ^^
(21) "X
2В' (22)
= Ае-С*/ ( + агееоЛ (ъ^Щ}] е°Т Нт +
Уое
(23)
Поиск свободных коэффициентов значительно упрощается, если представить (23) через
известные функции. Если заменить функцию еоЛ (ж)2 при ж > 0 приближенным выра-11 х
жением —- + 1--е3/2х — _е53/б0х (относительная ошибка не более 1.3 • 10-2), интеграл
в (23) сводится к табличным интегралам.
Экспериментальные зависимости концентрации пероксида водорода от времени в растворах БГГ и БСА с концентрациями 2 ^М и 10 ^М, соответствующими приблизительно максимумам графиков на рис. 1(а) и рис. 1(б), при воздействии лазерного излучения, а также результаты их аппроксимации методом Левенберга-Марквардта на основе решения (23) показаны на рис. 2.
Найденные значения параметров функций (22) и (23) в единицах, указанных на графиках (рис. 2), приведены в табл. 2. Здесь £ = л/2АВ, п0 = агееоЛ 2В/А).
Рис. 2: Динамика образования пероксида водорода при воздействии излучением Не-Ые лазера мощностью 3 мВт (15 мин) на растворы белков в фосфатном буфере (10 тМ Ыа2НРО4 и 150 тМ ЫаС1, рН 7.4): (а) БГГ (2 ^М); (б) БСА (10 ц,М). Кружки -экспериментальные значения концентрации Н2О2. Сплошные .линии - теоретические кривые, полученные аппроксимацией экспериментальных точек методом Левенберга-Марквардта.
6. Химические константы. Константы скоростей реакций (10)-(13) связаны с параметрами функций (20) и (23), описывающих процесс генерации пероксида водорода, соотношениями:
2(^4 + кз[Р]2) = с; кз = к2 = В = |1; к^ = к1 • [102] = ^.
Ь 2А Ь
(24)
Оценки констант скоростей реакций к1 ,к2,к3,к4, сделанные согласно (27) при известных заданных концентрациях БГГ и БСА в кинетических экспериментах ([Р] = 2 и 10 мкмоль/л, соответственно), приведены в табл. 3.
Таблица 2
Параметры модельной функции у(Ь) (23)
Белок С, час 1 По С, час 1 Уо, 1 нмоль-л 1 А, 1 нмоль-час 1
БГГ 0.096 0.148 0.939 0.00023 4.8640-4
БСА 0.044 0.295 0.396 0.00041 9.7740-4
Таблица 3
Кинетические константы (27)
Белок fcff c-1 k2, л-моль 1 ■ c 1 ks, 2 —2 —1 л2-моль • c 1 k4, c 1
БГГ 1.0 ■ 10-6 2.6 ■ 106 1.4 ■ 107 7.4 ■ 10 -5
БСА 1.1 ■ 10-7 2.8 ■ 105 4.8 ■ 105 7.3 ■ 10 -6
Отметим, что найденные значения k4 по порядку величины согласуются с интерполированными данными по температурному распаду пероксида водорода [12].
7. .Заключение. В работе была исследована кинетика образования АФК в водных растворах под действием лазерного излучения. Исходя из закономерностей фотохимических процессов, приводящих к трансформации ДАФБ, была определена минимальная система химических реакций и выведены кинетические уравнения. На основе приближенного аналитического решения кинетических уравнений и данных измерений концентрации Н2О2 в различных условиях с использованием алгоритма Левенберга-Марквардта оценены значения кинетических констант, описывающих светокислород-ный эффект в растворах БСА и БГГ. Подобие функциональных зависимостей концентрации Н2О2 от содержания белка и времени позволяет заключить, что фундаментальные механизмы химических реакций, ведущих к образованию Н2О2 в растворах белков, одинаковы. Это означает, что аналогичные подходы применимы и к другим классам физических воздействий на белковые растворы. Таким образом, представленные в работе подходы и решения могут быть использованы для исследования генерации АФК в различных белковых системах, в том числе и максимально приближенных к живым системам.
Работа выполнена при поддержке Программы повышения конкурентоспособности НИЯУ МИФИ, программы "Физические методы в сельском хозяйстве и экологии" (№ 0024-2019-0004) и гранта РФФИ № 20-34-70037.
ЛИТЕРАТУРА
[1] A. V. Snezhkina, A. V. Kudryavtseva, O. L. Kardymon, et al., Oxid. Med. Cell. Longev. 2019, 6175804 (2019); doi: 10.1155/2019/6175804.
[2] S. V. Gudkov, M. A. Grinberg, V. Sukhov, et al., J. Environ. Radioact. 202, 8 (2019); doi: 10.1016/j.jenvrad.2019.02.001.
[3] С. Д. Захаров, А. В. Иванов, Квантовая электроника 29(3), 192 (1999); doi: https://doi.org/10.1070/QE1999v029n12ABEH001629.
[4] M. G. Sharapov and V. I. Novoselov, Biochemistry (Mosc). 84(2), 79 (2019); doi: 10.1134/S0320972519020015.
[5] M. M. Borisova-Mubarakshina, D. V. Vetoshkina, and B. N. Ivanov, Physiol. Plant. 166(1), 181 (2019); doi: 10.1111/ppl.12936.
[6] V. E. Ivanov, O. E. Karp, V. I. Bruskov, et al., Indian J. Biochem. Biophys. 56, 214 (2019).
[7] M. J. Davies, Biochim. Biophys. Acta 1703, 93 (2005); doi: 10.1016/j.bbapap. 2004.08.007.
[8] С. Д. Захаров, А. В. Иванов, Е. Б. Вольф и др., Квантовая электроника 33(2), 149 (2003); doi: https://doi.org/10.1070/QE2003v033n02ABEH002376.
[9] M. J. Davies, Photochem. Photobiol. Sci. 3, 17 (2004).
[10] C. L. Hawkins and M. J. Davies, Biochim. Biophys. Acta 1504, 196 (2001); doi: 10.1016/s0005-2728(00)00252-8.
[11] Г. М. Панченков, В. Л. Лебедев, Химическая кинетика и катализ (М., "Химия", 1985).
[12] J. Takagi and K. Ishigure, Nuclear Science and Engineering 89, 177 (1985); doi: https://doi.org/10.13182/NSE85-A18191.
[13] K. Levenberg, Quart. Appl. Math. 2, 164 (1944); doi: https://doi.org/10.1090/ qam/10666.
[14] D. Marquardt, SIAM J. Appl. Math. 11, 431 (1963); doi: http://dx.doi.org/ 10.1137/0111030.
[15] J. Nocedal and S. J. Wright, Numerical Optimization (New York, Springer, 1999).
Поступила в редакцию 5 ноября 2019 г.
После доработки 10 декабря 2019 г.
Принята к публикации 3 февраля 2020 г.
