CC BY
48
Л. Н. Баранова, В. Е. Холмогоров
КИНЕТИКА ГЕМОЛИЗА ЭРИТРОЦИТОВ В ФИЗРАСТВОРЕ В ТОНКОМ СЛОЕ ПРИ ОБЛУЧЕНИИ УФ-СВЕТОМ
Введение. Облучение суспензии эритроцитов УФ-светом приводит их к коллоидноосмотическому гемолизу [1-3]. Последовательность событий при этом полагают следующей: 1) переход эритроцитов в сфероциты; 2) выход из эритроцитов ионов К+, вследствие чего клетки сжимаются; 3) вход в клетку ионов Ка+, сопровождающийся набуханием эритроцитов; 4) лизис клеток.
В данной работе исследовался процесс прямого гемолиза эритроцитов после УФ-облучения и так называемого задержанного гемолиза в тонком слое суспензии эритроцитов после действия полного света кварцевой лампы ДРТ-375. С этой целью, как было предложено М. А. Османовым и др. [4], гемоглобин эритроцитов рассматривался как внутренний спектральный зонд, по интенсивности и форме полосы Соре которого можно было судить о его локализации в или вне эритроцитов.
Задача проводимого исследования - изучить, используя спектры поглощения, закономерности изменения величины пика полосы Соре с максимумом в районе 400-430 нм, поскольку полоса Соре наблюдается у всех ближайших производных гемоглобина в этом интервале длин волн. В работе прослеживали изменения в спектрах поглощения и величины пиков полосы Соре после однократного облучения суспензии и во время развития темновых реакций, а также после облучения от возрастающей дозы облучения.
Экспериментальная часть. Обьектом анализа служила стабилизированная гепарином (25 ед./мл) кровь здоровых доноров в возрасте 25-40 лет. Эритроцитарную массу и плазму получали центрифугированием цельной крови при 80(^ в течение 30 мин при 20 °С. Осадок клеток промывали дважды физраствором с центрифугированием при 400g в течение 15 мин. Исследовали эритроциты в физиологическом растворе в концентрации (3,6-4,0)-108кл/мл. Суспензии облучали светом ртутной лампы ДРТ-375 в тонком слое толщиной 80 мкм между кварцевыми пластинками в горизонтальном положении с термостатированием. Использовали диапазон физиологических доз облучения (до 756 Дж/м2).
Спектры поглощения регистрировали на спектрофотометре Бресогс! иУ-УГЭ в диапазоне 200-800 нм со скоростью записи 2,2 мин. Значение пика полосы Соре определялось величиной той части перпендикуляра, опущенного на ось абсцисс, которая отсекалась базисной линией, соединяющей точки основания полосы Соре.
Кривая прямого гемолиза эритроцитов строилась как зависимость от дозы значений полосы Соре, получаемых из записей спектров суспензии эритроцитов, снятых сразу же после однократного облучения суспензии. При изучении задержанного гемолиза эритроцитов следили за изменениями в спектрах поглощения суспензии эритроцитов в физрастворе после однократного облучения разными дозами при повторяющейся записи в течение 10-15 мин.
Результаты и их обсуждение. Исследование задержанного гемолиза эритроцитов выявило различное поведение спектральных характеристик суспензии эритроцитов со временем после однократного облучения в зависимости от дозы. При очень малых дозах облучения (2-34 Дж/м2) практически не происходило какого-либо достоверного изменения спектра со временем. Из литературы известно, что при малых дозах УФ-света имеют место уменьшение радиуса сфер и конформационные перестройки мембран эритроцитов, которые приводят к уменьшению их проницаемости [5, 6]. Большие же дозы должны производить деструкцию мембран, вызывающую гемолиз эритроци-
© Л. Н. Баранова, В. Е. Холмогоров, 2006
24
Рис. 1. Изменения спектра суспензии эритроцитов в физрастворе (С =
3.8-108 кл/мл) со временем после однократного облучения полным светом ртутной лампы ДРТ-375.
1 - сразу после облучения; 2 - через 2,5 мин; 3 - через 12,5 мин.
тов. В условиях проводимого эксперимента начиная с однократного облучения в дозе 63 Дж/м2 (только через 5 мин после начала последовательной записи спектров поглощения) наблюдалось постепенное увеличение величины пика Соре со сдвигом ее максимума в сторону коротких длин волн. Одновременно резко возрастало поглощение в области 200-220 нм, становилось заметным увеличение полос поглощения в области 280 и 350 нм, появлялись пики гемоглобина в районе 550-600 нм (рис. 1).
В соответствии с теорией коллоидно-осмотического гемолиза эритроцитов на начальных стадиях УФ-гемолиза эритроцитов должны происходить выход К+ из эритроцитов и сжатие клеток. Из полученных результатов также следует, что малые дозы облучения (до 10 Дж/м2) не оказывали заметного разрушающего действия на эритроциты. Увеличивая дозы облучения, можно найти такую дозу, начиная с которой после однократного облучения суспензии эритроцитов спектрофотометрическй будет регистрироваться задержанный гемолиз эритроцитов (см. рис. 1). В условиях проводимого эксперимента такой дозой была доза 63 Дж/м2. Начиная с нее и до дозы 126 Дж/м2 выход гемоглобина наблюдали через 5 мин после облучения. Этот интервал времени мы связываем с периодом набухания эритроцитов в условиях нашего эксперимента. При облучении суспензии эритроцитов дозой более 126 Дж/м2 выход гемоглобина из эритроцитов происходил сразу после облучения.
Таким образом, на основании приведенных результатов исследований ясно, что сложные процессы разрушения эритроцитов после облучения можно успешно регистри-
25
0 100 200 300 400 500 600 ны пиков полосы Соре от дозы
р облучения (прямой гемолиз).
ровать спектрофотометрически в выбранных условиях опытов. Далее мы попытались построить зависимость величины пика полосы Соре от дозы облучения сразу после облучения. Каждая точка представленной на рис. 2 зависимости есть среднее из 4-8 независимых измерений.
Анализируя полученный результат (рис. 2), надо учитывать распределение клеток по их осмотической устойчивости. Как показано в работах [7, 8], кривая кинетики фотогемолиза эритроцитов в суспензии имеет сигмоидную форму с характерным латентным периодом, что указывает на нормальное распределение эритроцитов по осмотической устойчивости. Различия устойчивости связаны, как полагают авторы, с вариациями в возрасте индивидуальных клеток в суспензии. Из данных на рис. 2 видно, что зависимость величины пика Соре от дозы облучения и в рассматриваемом случае имеет сигмоидную форму, нарушаемую, однако, достоверными периодическими «пульсациями».
По имеющимся в литературе данным [9] гемолитические объемы эритроцитов с увеличением возраста эритроцитов уменьшаются. У кроликов они равняются 135, 130 и 125% исходного объема для макроцитов (молодых клеток), нормоцитов и микроцитов (старых клеток) соответственно. Г. Л. Ормоцадзе утверждает, что характер кинетики набухания эритроцитов человека и кроликов не отличается [9]. Учитывая все вышесказанное, первый массовый выход гемоглобина происходит из микроцитов, которые при начале процесса сфероцитоза достигают гемолитического объема первыми, что ведет к выбросу гемоглобина и соответственно к увеличению полосы Соре. Одновременно основная масса эритроцитов проходит стадию выхода К+ и частичного сжатия, что также вызывает снижение поглощения света в области пика полосы Соре. В соответст-
26
О, отн. ед. д отн. ед.
Р, Дж/м2 МИН
Рис. 3. Зависимость величины пиков полосы Соре от дозы облучения (а) и от времени (б) в ходе развития темновых процессов после однократного облучения.
Доза облучения (Дж/м2 ): 1 - 2, 2- 32, 3 - 63, 4 ~ 95, 5 - 126, 6 - 158, 7 - 189, 8 -221, 9 - 252, 10 - 284, 11 - 315, 12 - 347, 13 - 378.
вии с теорией коллоидно-осмотического гемолиза далее наступает стадия входа Ка+ в эритроциты. Размеры эритроцитов возрастают до критической величины (в среднем в 1,78 раза), что приводит к уменьшению расстояния между разбухшими эритроцитами-сфероцитами и увеличению рассеяния на них падающего света [10]. Именно поэтому, по нашему мнению, происходит уменьшение интенсивности полосы Соре до прежнего значения. Все указанные закономерности наблюдаются при облучении суспензии эритроцитов дозами до 32 Дж/м2. Два последующих выброса гемоглобина (см. рис. 2) при больших дозах облучения могут быть результатом деятельности пор, образовавшихся вначале в микроцитах, а затем и в нормо-, и в макроцитах под действием облучения после прохождения фазы сфероцитоза. Разработанная М. М. Козловым и В. С. Маркиным теория гипотонического лизиса везикул [11] утверждает, что энергетически при лизисе везикул наиболее выгодным является пульсирующий режим выхода веществ из везикул, при этом объем везикулы изменяется на 5% от исходного объема в нашем случае от объема сфероцита. Выводы, сделанные в работе [11], относительно возможного разрушения эритроцитов, совпадают с нашими данными. Так, время гемолиза эритроцитов в физрастворе оценивается в работе [11] в несколько минут, а мы получили 2 мин 45 с. Теория этих же авторов предусматривает для больших микронных везикул (к ним можно вполне отнести эритроциты, так как радиус эритроцита-сфероци-
та - 3,5-10~6М) периоды пульсаций - порядка 30 с, а в нашем эксперименте эта величина равна 60 с, что видно из рис. 2.
Процессы, проходящие в эритроцитах, при облучении дозой больше 126 Дж/м2 (рис. 3) приводят к тому, что интенсивность полосы Соре в зависимости от дозы при прямом фотогемолизе эритроцитов в начале растет (до дозы 315 Дж/м2), а затем падает. Задержанный гемолиз эритроцитов достигает своего предела при дозе 347 Дж/м2, и зависимость величины пика полосы Соре от времени вырождается в горизонтальную прямую (при дозе от 347 до 567 Дж/м2), что, по нашему мнению, свидетельствует о полном фотогемолизе эритроцитов под лучом в наших условиях (см. рис. 3). При этом в спектре поглощения наблюдается сдвиг максимума полосы Соре от 405 до 420 нм. Кривые прямого фотогемолиза при дозе 378 Дж/м2 выходят на плато за более короткое время (3 мин). Процессы, идущие в эритроцитах при облучении, вызывали фотогемолиз всей массы эритроцитов в процессе облучения, т. е. к этому времени происходит процесс прямого фотогемолиза непосредственно под лучом.
Таким образом, изучение кинетики фотогемолиза суспензии эритроцитов, наблюдаемой в физрастворе в тонком слое при облучении полным светом ртутной лампы ДРТ-375 с использованием величины полосы Соре, расширяет исследовательские возможности и позволяет наблюдать прямой гемолиз эритроцитов, пульсации пор эритроцитов, исследовать задержанный гемолиз эритроцитов после однократного облучения.
Summary
Baranova L. N., Kholmogorov V. E. The erithrocyte haemalysis in the thin layer of physiologycal solution after ultraviolet irradiation.
Direct and retard erithrocyte haemalisis in the thin layer of erythrocyte suspension after ultraviolet irradiation (complet light of the mercury lamp DRT-375) is studied. It is conceived that erythrocyte haemoglobin is an internal spectral label.The conclusion is made about location of spectral label in and outside of erythrocytes according to the intensivity and spectral line shape of Sore band in erithrocyte suspension. The progressive change in Sore band after single irradiation of suspension: at once after single irradiation and in the process of self-multiplying chain reaction and after irradiation by a variation dose is investigated. It is estimated that relationship between value of Sore band peak and dose irradiation under direct haemalysis can be represented similarly sigma. Jet haemoglobin yield from erithrosite takes place. The nature of oscillation is discussed. The method due to us allowed to study and delay erithrocytes haemalysis.
Литература
1. Cook J. S. // J. Gen. Physiol. 1965. Vol. 48. P. 719-734. 2. Cook J. S. // Pathology of cell membrane / Eds. В. H. Trump, A. U. Aratils. New York, 1975. Vol. 1. P. 199-213. 3. Pooler J. P. II Biochem. Biophys. Acta. 1985. Vol. 812. P. 193-198. 4. Османов M. A.t Башкиров А. Б., Холмогоров В. E. и др. // Тез. докл. 1-й Республ. конференции «Биологические мембраны в норме и патологии». Тбилиси, 1983. С. 62-63. 5. Крыленков В. А., Левин С. В., Самойлова К. А. // Цитология. 1979. Т. 21. С. 470^473. 6. Османов М. А. Фотомодификация клеток крови, индуцированная ультрафиолетовым светом: Автореф. канд. дис. М., 1984. 7. Cook J. S. II J. Cell. Comp. Physiol. 1956. Vol. 47. P. 55-83. 8. Anderson P. C., Lovrein R. E. II Biophys. J. 1977. Vol. 20. P. 181-182. 9. Ормоцадзе Г. Jl. // Сообщ. АН Груз.ССР. 1990. Т. 138, № 1. С. 96-97. 10. Ильина А. А., Равикович X. М., Рубинштейн Д. Л., Шполь-ский 9. В. II Докл. АН СССР. 1945. Т. 48. С. 346-349. 11. Козлов М. М., Маркин В. С. // Биол. мембраны. 1984. Т. 1. С. 74-81.
Статья поступила в редакцию 4 апреля 2006 г.
