Научная статья на тему 'КИНЕТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ РЕАКЦИИ ОКИСЛЕНИЯ D-ГЛЮКОЗЫ В ПРИСУТСТВИИ АРАБИНОЗЫ'

КИНЕТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ РЕАКЦИИ ОКИСЛЕНИЯ D-ГЛЮКОЗЫ В ПРИСУТСТВИИ АРАБИНОЗЫ Текст научной статьи по специальности «Химические науки»

CC BY
170
39
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
фермент глюкозооксиадаза / глюкоза / арабиноза / ингибирование / ферментативная кинетика / glucose oxidase enzyme / glucose / arabinose / enzyme inhibition / kinetics

Аннотация научной статьи по химическим наукам, автор научной работы — Юдина Наталья Юрьевна, Козлова Татьяна Николаевна, Харькова Анна Сергеевна

Проведена оценка кинетических параметров окисления глюкозы ферментом глюкозооксидазой в присутствии и отсутствии арабинозы. Показано, что в области низких концентраций арабинозы до 70 мМ проявляется конкурентный тип ингибирования, при более высоких концентрациях преобладает смешанный тип ингибирования ферментативной активности

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по химическим наукам , автор научной работы — Юдина Наталья Юрьевна, Козлова Татьяна Николаевна, Харькова Анна Сергеевна

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

KINETIC PARAMETERS OF THE OXIDATION REACTION D-GLUCOSE IN THE PRESENCE OF ARABINOSE

The paper assessed the kinetic parameters of the oxidation of the enzyme glucose oxidase in the detection and absence of arabinose. It was shown that at low concentrations of arabinose up to 70 mM, it manifests itself as a competitive type of inhibition; at higher concentrations, a mixed type of inhibition of enzymatic activity predominates.

Текст научной работы на тему «КИНЕТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ РЕАКЦИИ ОКИСЛЕНИЯ D-ГЛЮКОЗЫ В ПРИСУТСТВИИ АРАБИНОЗЫ»

УДК 544.47 DOI: 10.24412/2071-6176-2022-3-42-52

КИНЕТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ РЕАКЦИИ ОКИСЛЕНИЯ D-ГЛЮКОЗЫ В ПРИСУТСТВИИ АРАБИНОЗЫ

Н.Ю. Юдина, Т.Н. Козлова, А.С.Харькова

Проведена оценка кинетических параметров окисления глюкозы ферментом глюкозооксидазой в присутствии и отсутствии арабинозы. Показано, что в области низких концентраций арабинозы до 70 мМ проявляется конкурентный тип ингибиро-вания, при более высоких концентрациях преобладает смешанный тип ингибирования ферментативной активности.

Ключевые слова: фермент глюкозооксиадаза, глюкоза, арабиноза, ингибирова-ние, ферментативная кинетика.

Введение

Фермент глюкозооксидаза (GOx) КФ 1.1.3.4 представляет собой эндогенную оксидоредуктазу, широко распространенную в живых организмах. Впервые наличие фермента, катализирующего окисление глюкозы за счет кислорода воздуха, не сопровождающееся выделением СО2, было обнаружено в 1904 году Максимовым в отпрессованной жидкости Aspergillus niger [1]. Фермент незаменим в медицине для диагностики ряда заболеваний, как ключевой индикатор углеводного обмена у больных. Это уникальный аналитический реагент, применяемый для определения содержания глюкозы в биологических жидкостях с помощью биохимических фотометров, автоматических анализаторов глюкозы, биосенсоров и тест-полосок [2]. Кроме того, этот фермент применяют для определения содержания глюкозы в пищевых продуктах, для мониторинга биотехнологических процессов а также в текстильной промышленности [3].

В последние годы фермент глюкозооксидаза вызывает повышенный интерес в области биомедицины из-за присущей ему биосовместимости, нетоксичности и уникального катализа ß-D- глюкозы.GOx эффективно катализирует окисление глюкозы до глюконовой кислоты и перекиси водорода (H2O2), которые могут использоваться различными биосенсорами для обнаружения биомаркеров рака [4].

В последнее время глюкозооксидаза (GOx) вызывает все больший интерес в кормовой промышленности как альтернатива антибиотикам. Применение фермента глюкозооксидазы способствует росту продукции животноводства за счет улучшения антиоксидантной способности, поддержаниея гомеостаза кишечной микробиоты и улучшения функции кишечника. В статье [5] рассматриваются различные источники

выделенияфермента, биохимические свойства, структурные особенности и новые стратегии генной инженерии глюкозооксидазы.

Еще одним актуальным направлением применения фермента является создание биосенсорных систем. Так в статье [6] описан гибридный биотопливный элемент на основе фермента глюкозооксидазы и наночастиц золота нанесенных на хлопковое волокно. Полученные биотопливные элементы демонстрируют замечательную плотность мощности 3,7 мВт/см2, что значительно превосходит обычные биотопливные элементы.

На активность фермента глюкозооксидазы большое влияние оказывают ингибиторы, в качестве которых могут выступать катионы таких металлов, как ртуть, олово, серебро, взятые в микромолярных количествах. Миллимолярные количества гидразина, гидроксиламина и фенилгидразина частично ингибируют GOx. При концентрации реагента 10 мМ наблюдаются следующие степени ингибирования: гидрохинон (11%), NaNO3 (13%), семикарбазид (20%). Галогенид ионы ингибируют GOx при низких значениях рН. Например, при рН 3.0 GOx полностью ингибируется 0,1М КС1. Также отмечается возможность ингибирования GOx полиаминами [7].Кроме того, активность фермента падает в присутствии таких альдогексоз, как D-арабиноза, 2-дезокси-В-глюкоза, действующих как конкурентные ингибиторы.

В связи с этим целью данного исследования является выявление влияния арабинозы в различных концентрациях на каталитическую активность фермента глюкозооксидазы.

Материалы и методы

Измерительный датчик представлял собой кислородный электрод типа Кларка, модифицированный иммобилизованным ферментом глюкозооксидазой, подключенный к анализатору «Эксперт - 001» (ОАО «Эконикс-Эксперт», Москва).

Для формирования биорецепторного элемента проводили предварительное разбавление фермента глюкозооксидазы 0.001 г в 100 мкл воды (или 0,01 г/мл). 10 мкл полученной суспензии наносили на диализную мембрану D9777 (Sigma, США) и фиксировали на кислородном датчике с помощью резинового кольца.

Измерения проводились в кювете объемом 5 см3 с фосфатным буферным раствором pH=6,0 снабженной якорем магнитной мешалки. При введении глюкозы в измерительную ячейку фермент окисляет ее до глюконо-1,5-лактона (рис.1) и в приэлектродном пространстве снижается концентрация кислорода, что регистрируется с помощью датчика растворенного кислорода и передается на компьютер.

ОН ОН

D-глюкоза В-глюконо-1,5-лактон

Рис. 1. Схема окисления D-глюкозы до пероксида водорода и D-глюконо-

1,5-лактона

Обработка полученных результатов производилась с помощью программ Microsoft Exce^ SigmaPlot. Измеряемым параметром (ответом биосенсора) являлась максимальная скорость (по модулю) изменения выходного сигнала биосенсора при добавлении глюкозы.

Обсуждение результатов

Кинетические параметры ферментативной реакции. Для

определения кинетических параметров окисления D-глюкозы (максимальная скорость (Vmax) и константа Михаэлиса (^)) использовали модель Михаэлиса-Ментен. Данная модель включает обратимое образование промежуточного комплекса фермента (Б) с реагирующим веществом (субстратом, S) и превращение этого комплекса в продукт реакции (?):

к+1

Е + 5 » ££ —^ Е + Р

к 1

■_1 , в которой

Е — фермент,

S —субстрат,

ES — фермент-субстратный комплекс.

Кинетические параметры рассчитывали путем определения начальных скоростей реакции (ответа биосенсора) для различных концентраций глюкозы. Для определения Vmax и ^ были построены кинетические кривые зависимости скорости реакции от концентрации субстрата (рис. 2).

о

ж

0,012

0,010

§ 0,008 -

й Л О о К

о о к ю

н

(и «

н

о

0,006 -

0,004 -

0,002 -

0,000

160

Концентрация глюкозы, мМ

Рис. 2. Зависимость ответа биосенсора от концентрации глюкозы

Зависимость ответа биосенсора от концентрации глюкозы имеет гиперболический вид и хорошо описывается уравнением типа Михаэлиса-Ментен:

V,,» [ ^ ]

V =

км +[5 ]

где

потребления кислорода все молекулы фермента

V - скорость ферментативной реакции, [Б] - концентрация субстрата, Vmax - максимальная скорость иммобилизованным ферментом, при которой участвуют в образовании фермент-субстратного комплекса. Достигается при

Км - эффективная константа Михаэлиса численно равна концентрации субстрата, при которой скорость ферментативной реакции достигает половины максимального значения (V=Vmax/2).Константа Михаэлисахарактеризует специфичность фермента по отношению к субстрату(чем меньше константа, тем больше специфичность).

В программе SigmaPlot была произведена аппроксимация зависимости ответа биосенсора от концентрации субстрата с помощью

уравнения гиперболы (аналогично уравнению Михаэлиса - Ментен) и рассчитаны кинетические параметры окисления глюкозы ферментом глюкозооксидазой. Так, максимальная скорость составила Vmax= 0,018±0,003 мг/л*с, а константа Михаэлиса Km=81±4 ммоль/л.

Существуют различные способы линеаризации зависимости начальной скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата. Наиболее распространенным способом является линеаризация экспериментальных данных в координатах (l/V, 1/[S]o), называемых координатами Лайнуивера-Берка или координатами «двойных обратных величин».

Как следует из выражения

1 1 K 1

_ ___|__m__

V V V [S ]0

max max L J0

график зависимости ответа биосенсора от концентрации субстратав координатах Лайнуивера-Берка имеет вид прямой линии, пересекающей ось абсцисс и ординат в точках —1/Km, и 1/Vmax соответственно. На рис. 3 представлена зависимость ответа биосенсора от концентрации субстрата в координатах Лайнуивера-Берка.

300

-20

y = 4,72x + 56,7 R2 = 0,9867

40

50

1/S

Рис.3. График в двойных обратных координатах по методу

Лайнуивера-Берка

Данная зависимость описывается линейной функцией с уравнением

у= 4,72х + 56,7. Максимальная скорость (Ушах) ферментативной реакции соответствует обратной величине свободного члена уравнения (коэффициент Ь):Ушах=1/56,7 =0,0176 мг/л*с. Константа Михаэлиса может быть найдена как графически (-1/отсекаемый отрезок на оси х), так и

аналитически как произведение тангенса угла наклона прямой (коэффициент а в уравнении) на Ушах. Кт— 4,72 • 0,0176 — 0,083 моль/л.

Недостатком метода линеаризации Лайнуивера-Бэрка является то, что наклон прямой определяется в области малых значений переменных, а это значительно снижает точность определения параметров.

Довольно часто для обработки кинетических данных ферментативных реакций используют так называемое уравнение Иди-Хофсти, которое также легко получить преобразованием уравнения Михаэлиса-Ментэн:

V

V = V -К( )-

шах т(каж) г

I.^ ]0

При графическом построении экспериментальных данных в координатах Иди-Хофсти (рис. 4) полученная прямая линия пересекает ось ординат в точке Ушах и имеет тангенс угла наклона, равный — Кт.

У/8

Рис.4. График в обратных координатах по методу Иди-Хофсти

Зависимость, представленная на рисунке 4 описывается линейным уравнением у— -0,093х+0,02, в котором свободный член уравнения соответствует максимальной скорости (Ушах), следовательно, Ушах—

0,020±0,002 мг/л*с, константа Михаэлиса (Кш) равна тангенсу угла наклона, следовательно,Кш—0,093±0,003 моль/л.

В табл. 1 представлены константы ферментативной реакции окисления глюкозы по методу Иди-Хофсти и Лайнуивера-Берка.

Таблица 1

Кинетические параметры ферментативной реакции.

Методы Vmax, мг/л*с Km, ммоль/л R, коэффициент корреляции

Обработка гиперболической функцией в программе SigmaPlot 0,018±0,003 81±4 0,9989

Лайнуивера-Берка 0,0176 83± 4 0,9933

Иди-Хофсти 0,020±0,005 93±3 0,9090

Из полученных данных можно сделать вывод, что Vmax и ^ определенные, с применением трех методов отличаются незначительно, однако наибольшей точность в определении констант обладает метод обработки гиперболической функцией, т.к. коэффициент корреляции является максимальным ^=0,9989), а доверительные интервалы минимальными.

Константа Михаэлиса, характеризующая сродство фермента к субстрату, полученная в данной работе ^=81±4 мМ сопоставима со значением константы Михаэлиса полученной для нативной формы фермента в работе [8].

Влияние ингибитора. В общем случае влияние обратимо действующих ингибиторов на двухстадийную ферментативную реакцию может быть передано схемой (рис. 5). В этой схеме предусмотрено взаимодействие ингибиторов (I) как со свободной формой фермента так и с фермент-субстратным комплексом (ЕБ).

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Е

ES

Е

+

+

м

м

EI

ESI

EI

Рис. 5. Общая схема ингибирования, где:Е - фермент^-субстрат; ES-фермент-субстратный комплекс;Е1 - комплекс фермента с ингибитором; ESI - комплекс фермента с ингибитором и субстратом;

P-продукт

Для выявления типа ингибирования L-арабинозы были построены зависимости ответа биосенсора от концентрации глюкозы в присутствии L-арабинозы с концентрацией 70 и 130 мМ (рис. 6).

Концентраия глюкозы, мМ

Рис.6. График зависимости ответа биосенсора от концентрации глюкозы в присутствии Ь-арабинозы и без нее

Зависимости, представленные на рис. 6 также описываются гиперболической функцией и подчиняются уравнению Михаэлиса-Ментен. В программе SigmaPlot были рассчитаны кинетические параметры окисления глюкозы ферментом глюкозооксидазой в присутствии ингибитора L-арабинозы в различных концентрациях (табл. 2).

Таблица 2

Кинетические параметры окисления глюкозы в присутствии

ингибитора Ь-арабинозы

Кинетические параметры Vmax, мг/л*с ммоль/л

Без ингибитора 0,018±0,003 81±4

В присутствии L-арабинозы 70мМ 0,017±0,004 123±7

В присутствии L-арабинозы 130мМ 0,013±0,003 210±10

На основании данных таблицы 2 можно заключить, что при концентрации L-арабинозы 70 мМ наблюдается конкурентный тип ингибирования, так как в этом случае повышается константа Михаэлиса (Кт=123±7 мМ),ингибитор уменьшает сродство фермента к субстрату,а максимальная скорость реакции ^тах) остается при этом неизменной (0,017 и 0,018 мг/л*с, соответственно).

В случае двухсубстратных реакций (арабиноза и глюкоза), при определенной концентрации ингибитора, часто можно наблюдать ингибирование смешанного типа. При смешанном ингибировании изменяются как константа Михаэлиса, так и максимальная скорость, но не в одинаковой степени. Различают смешанное конкурентное-неконкурентное ингибирование, при котором сродство фермента к субстрату в присутствии ингибитора данного типа увеличивается, а максимальная скорость ферментативной реакции снижается. А также смешанное неконкурентное-бесконкурентное ингибирование, при котором ингибитор снижает и константу Михаэлиса и максимальную скорость реакции.

Поскольку фермент глюкозооксидаза обладает абсолютной субстратной специфичностью, т.е. способен окислять только Б-глюкозу, при смешенном ингибировании возможен только второй тип ингибирования неконкурентное-бесконкурентное. Арабиноза является так называемым аналогом субстрата (глюкозы) и имеет подобные свойства. Возможно, она обратимо блокируют часть молекул фермента, но не может далее превратиться в продукт, поэтому для достижения половины максимальной скорости реакции необходимы более высокие концентрации субстрата и в присутствии такого ингибитора константа Михаэлиса Кт растет (Кт=210±10 мМ), а максимальная скорость ферментативной реакции уменьшается до 0,013±0,003 мг/л*с.

Таким образом, показано, что при различных концентрациях ингибитора может меняться тип ингибирования [9-10]. На основании констант Михаэлиса и максимальной скорости ферментативной реакции определен тип ингибирования (при концентрации . L-арабинозы 70мМ-конкурентный, а при концентрации 130 мМ - смешанный).

Заключение

В работе определены кинетические параметры окисления Б-глюкозы ферментом глюкозооксидазой, закрепленным на кислородном электроде Кларка с помощью диализной мембраны. Показано, что максимальная скорость ^тах) и константа Михаэлиса (Кт), рассчитанные различными методами (метод Лайнуивера-Берка и метод Иди-Хофсти), различаются незначимо и совпадают с литературными значениями. В присутствии арабинозы в концентрациях до 70 мМ (меньше константы

Михаэлиса) наблюдается конкурентный тип ингибирования, при повышении концентрации преобладает смешанный тип ингибирования.

Работа выполнена в рамках гранта Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых -кандидатов наук, номер гранта №МК-4815.2022.1.4.

Список литературы

1. Гулый М. Ф. и др. Фермент глюкозооксидаза и его применение Киев: Наукова думка. 1964. Т. 145.

2. Mano N. Engineering glucose oxidase for bioelectrochemical applications //Bioelectrochemistry. 2019. Т. 128. С. 218-240.

3. Mojsov K. et al. Production and application of glucose oxidase enzyme in textile technology //Tekstilna industrija.2021. Т. 69. №. 1. С. 21-27.

4. Catalytic chemistry of glucose oxidase in cancer diagnosis and treatment / Fu L. H., Qi C., Lin J. [et al]. //Chemical Society Reviews. 2018. V. 47. №. 17. P. 6454-6472. https://doi.org/10.1039/C7CS00891K

5. Review of glucose oxidase as a feed additive: production, engineering, applications, growth-promoting mechanisms, and outlook / Z. Liang, Y. Yan, W. Zhang [et al] // Critical Reviews in Biotechnology. 2022. P. 1-18. https://doi.org/10.1080/07388551.2022.2057275

6. High-power hybrid biofuel cells using layer-by-layer assembled glucose oxidase-coated metallic cotton fibers / C. H. Kwon, Y. Ko, D. Shin [et al] //Nature communications. 2018. V. 9. №. 1. P. 1-11. https://doi.org/10.1038/s41467-018-06994-5

7. Dirkx J.M.H. The Oxidation of Glucose with Platinum on Carbon as Catalyst // J. Catal. 1981. V. 67. P. 1-13.

8. Гребенникова О. В., Сульман А. М., Шиманская Е. И. Кинетические параметры реакции окисления D-глюкозы в присутствии биокатализаторов//Вестник Тверского государственного университета. Серия: Химия. 2021. №. 4. С. 16-21.

9. Шульгин К. К. Регуляция активности глутатионпероксидазы при токсическом поражении печени крыс и действии веществ-протекторов: дис. - спец. 03.00. 04 «Биохимия». Минск. 2008.

10. Фермент-полиэлектролитный комплекс. Влияние солей на взаимодействие уреазы с полиаллиламином / С. А. Тихоненко, Е. А. Сабурова, Е. Н. Дурденко [и др.] // Журнал физической химии. 2009. Т. 83. №. 10. С. 1966-1974.

Юдина Наталья Юрьевна, канд. хим. .наук, доц., ст. науч. сотр. лаборатории «Экологической и медицинской биотехнологии», TSUnewIT@gmail.com, Россия, Тула, Тульский государственный университет,

Козлова Татьяна Николаевна,мл. науч. сотр. лаборатории «Экологической и медицинской биотехнологии», kozlovatatyana_1993@,mail.ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет,

Харькова Анна Сергеевна, канд. хим. .наук, доц., Anyuta_Zaytseva@mail.ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет.

KINETIC PARAMETERS OF THE OXIDATION REACTION D-GLUCOSE IN THE PRESENCE OF ARABINOSE

N.Yu. Yudina, T.N. Kozlova, A.S. КИагкоуа

The paper assessed the kinetic parameters of the oxidation of the enzyme glucose oxidase in the detection and absence of arabinose. It was shown that at low concentrations of arabinose up to 70 mM, it manifests itself as a competitive type of inhibition; at higher concentrations, a mixed type of inhibition of enzymatic activity predominates.

Key words: glucose oxidase enzyme, glucose, arabinose, enzyme inhibition, kinetics.

Yudina Natalya Yurievna, candidate of ^emistry science, docent,research associatelaboratory of "Environmental and Medical Biotechnology", TSUnewIT@gmail.com, Russia, Tula, Tula State University,

Kozlova Tatyana Nikolaevna, junior research scientistlaboratory of "Environmental and Medical Biotechnology", kozlovatatyana_1993@,mail.ru, Russia, Tula, Tula State University,

Kharkova Anna Sergeevna, candidate of ^emistry science, docent, Anyuta_Zaytseva@mail.ru, Tula, Russia, Tula State University.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.