CC BY
16© А.А. Селифонов, В.В. Тучин, 2021 https://doi.org/10.29296/24999490-2021-03-07
КИНЕТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ ИЗМЕНЕНИЯ ОПТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ТКАНИ СЛИЗИСТОЙ ДЕСНЫ ПРИ ИММЕРСИИ В ГЛИЦЕРИНЕ: ИССЛЕДОВАНИЯ EX VIVO
А.А. Селифонов1' 2, В.В. Тучин1' 3-5
ФГБОУВО «Саратовский национальный исследовательский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского», Российская Федерация, 410012, Саратов, Астраханская ул., д. 83; 2ФГБОУВО «Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского»,
Российская Федерация, 410012, Саратов, Большая Казачья ул., д. 112; 3Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН(ИНБИРАН) ФГУ «Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии Российской академии наук», Российская Федерация, 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, стр. 2; 4ФГАОУ ВО «Национальный исследовательский Томский государственный университет»,
Российская Федерация, 634050, Томск, пр. Ленина, д. 36; 5ФГБУН «Институт проблем точной механики и управления Российской академии наук», Российская Федерация, 410028, Саратов, Рабочая ул., д. 24 E-mail: selif-ei@yandex.ru
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ
Селифонов Алексей Андреевич — аспирант кафедры оптики и биофотоники СГУ. ФГБОУВО «Саратовский национальный исследовательский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского». Тел.: +7(987) 356-40-30. E-mail.: Selif-ei@yandex. ru. ORCID: 0000-0002-6270-9395.
Тучин Валерий Викторович — зав. Кафедрой оптики и биофотоники СГУ. ФГБОУВО «Саратовский национальный исследовательский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского». Институт биохимии им. А.Н. Баха, ФИЦбиотехнологии РАН. Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Национальный исследовательский Томский государственный университет». Институт проблем точной механики и управления РАН. Профессор, доктор физико-математических наук, член-корреспондент РАН. Тел.: +7(904) 241-97-10. E-mail: tuchinvv@mail.ru. ORCID: 0000-00017479-2694.
Введение. Ротовая полость является началом пищеварительной системы человека и наличие в ней патологических изменений (сдвиг динамического равновесия, состава и видов микроорганизмов, населяющих ротовую полость; изменение цвета; появление болезненных ощущений, дискомфорта и др.) может свидетельствовать о патологических изменениях в других системах организма. Точность и безопасность неинвазивной диагностики на клеточном и субклеточных уровнях обеспечивается современными оптическими системами. Однако у оптического излучения имеется сложность в транспорте зондирующего излучения вглубь биологических тканей из-за значительного рассеяния излучения в видимом и ближнем инфракрасном (ИК) спектральных диапазонах. Увеличить проникновение излучения, возможно применяя метод иммерсионного просветления.
Цель исследования. Оценить эффективность оптического просветления тканей прикрепленной десны свиньи, после полной иммерсии в 87,5% глицерине, а также определить его коэффициент диффузии и степень извилистости (пористости) ткани десны свиньи.
Методы. Регистрация спектров диффузного отражения и полного пропускания проводили на спектрофотометре Shimadzu UV-2550 с интегрирующей сферой. Завершение процесса иммерсии оценивали по прекращению изменения спектров диффузного отражения. Для оценки кинетики процесса оптического просветления рассчитывали коэффициент диффузии глицерина в ткань десны, используя модель свободной диффузии. Эффективность «оптического просветления» оценивали, используя экспериментальные данные по спектрам полного пропускания.
Результаты. В среднем значение эффективного коэффициента диффузии глицерина в ткани десны свиньи ex vivo составило (3,2±0,7)'10-6 см2/с. Извилистость (пористость) для слоя собственной пластины десны оценена как S&3,4. Наибольшая эффективность просветления достигается на длине волны 200 нм и составляет 1860% при достаточно малых абсолютных значениях пропускания.
Заключение. При иммерсии десны в 87,5% глицерине выявлено три динамических окна прозрачности в УФ-диапазоне спектра, что может быть использовано при разработке неинвазивных оптических методов диагностики и терапии и нуждается в дальнейшем изучении.
Ключевые слова: оптическое просветление, десна, коэффициент диффузии, глицерин, спектроскопия диффузного отражения
KINETIC PARAMETERS OF THE CHANGE OF OPTICAL PROPERTIES OF THE GINGIVA UNDER IMMERSION IN GLYCEROL: EX VIVO RESEARCH A.A. Selifonov1'2, V.V. Tuchin1'3-5
1Saratov State University, Astrakhanskaya str., 83, Saratov, 410012, Russian Federation;
2Saratov State Medical University, Kazachaya str., 112 B, Saratov, 410012, Russian Federation;
3Bach Institute of Biochemistry, Research Center of Biotechnology of the RAS, Leninsky prospect, 33, build. 2, Moscow, 119071, Russian Federation;
4Tomsk State University, Lenin Avenu, 36, Tomsk, 634050, Russian Federation;
5Institute of Precision Mechanics and Control of the RAS, Rabochaya str., 24, Saratov, 410028, Russian Federation
E-mail: selif-ei@yandex.ru
INFORMATION ABOUT THE AUTHORS
Selifonov Alexey Andreevich — Post-graduate student of the Department of Optics and Biophotonics, SSU. Saratov State University. Тел.: +7(987) 356-40-30. E-mail.: Selif-eiC@yandex.ru. ORCID: 0000-0002-6270-9395.
Tuchin Valery Viktorovich — Head Department of Optics and Biophotonics, SSU. Saratov State University. Institute of Biochemistry named after A.N. Bach, FIS Biotechnology RAS. National Research Tomsk State University. Institute of Precision Mechanics and Control of the Russian Academy of Sciences. Professor, Doctor of Philosophy of sciences, Corr. RAS. Тел.: +7 (904) 241-97-10. E-mail: tuchinvv@ mail.ru. ORCID: 0000-0001-7479-2694.
Introduction. The oral cavity is the beginning of the human digestive system and the presence of pathological changes in it: a shift in the dynamic balance, composition, and types of microorganisms inhabiting the oral cavity; color change; the appearance of pain and discomfort; etc., all this may indicate pathological changes in other body systems. The accuracy and safety of non-invasive diagnostics at the cellular and subcellular levels is ensured by modern optical systems. However, optical radiation has difficulty in transporting probe radiation deep into biological tissues due to significant scattering of radiation in the visible and near-infrared spectral ranges. It is possible to increase the penetration of radiation using the method of optical clearing.
The aim of the study. To evaluate the effectiveness of optical enlightenment of tissues of attached pig gingiva after full immersion in 87.5% glycerol, and also to determine its diffusion coefficient and degree of tortuosity (porosity) of pig gingival tissue.
Methods. The diffuse reflection and total transmission spectra were recorded on a Shimadzu UV-2550 spectrophotometer with an integrating sphere. The completion of the immersion process was evaluated by stopping the change in the diffuse reflection spectra. To assess the kinetics of the optical clearing process, the diffusion coefficient of glycerol into the gingival tissue was calculated using the free diffusion model. The effectiveness of«optical clearing» was evaluated using experimental data on the spectra of the complete transmission.
Results. On average, the ex-vivo diffusion coefficient of glycerol in pig gingival tissue was (3.2±0.7)'1&6 cm2/s. The tortuosity (porosity) for the layer of the own gingival plate is estimated as S&3.4. Highest efficiency optical clearing is achieved at a wavelength of200 nm and amounts to 1860%, with sufficiently small absolute transmittance values.
Conclusion. Three dynamic transparency windows have been identified in the UV range of the spectrum, with gingival immersion in 87.5% glycerol, from 200 to 250 nm, from 250 to 300 nm and from 300 to 400 nm. This can be used to develop non-invasive optical diagnostic and therapeutic methods and needs further study.
Key words: optical clearing, gingiva, diffusion coefficient, glycerin, diffuse reflection spectroscopy
ВВЕДЕНИЕ
Традиционно постановка диагноза и определение тактики лечения в стоматологии основывается на визуальном осмотре и клиническом опыте врача стоматолога и пародонтолога. Стоматологические патологии часто являются начальным проявлением заболеваний внутренних систем организма — желудочно-кишечного тракта, гормональных нарушений, ЛОР-патологий, аллергических реакций, онкологической настроенности и др., поэтому важна постановка правильного диагноза и своевременно начатое лечение [1]. Несмотря на доступность для визуализации тканей полости рта, диагностика и раннее выявление патологических изменений в стоматологии остается актуальной проблемой, которую можно решать с применением современных оптических методов. Совершенствование оптических систем, открытие лазерных и светодиодных источников, широкое использование компьютеров, микропроцессоров и разработка новых технологий получения трехмерных изображений позволили сделать значительные изменения в техноло-
гии визуализации тканей и диагностики [2]. Обзор новых методов оптической визуализации, гауссовой оптики, рассеяния света, нелинейной оптики и оптической томографии тканей и клеток представлен в обзоре [3]. Например, оптическая визуализация глубоких слоев тканей используется для идентификации злокачественных новообразований на ранних стадиях, включая оптическую когерентную томографию, флюоресцентную и рамановскую спектроскопию, волоконно-оптические технологии для доставки излучения к патологическим участкам и обратно портативным системам визуализации и др. [4]. В рамках методов автофлюоресценции становится возможным неинвазивно количественно определять содержание эндогенных хромофоров тканей in vivo (окси- и дезок-сигемоглобин, меланин, билирубин и др.) [5]. Автоматизированный мобильный микроскоп использовался для скрининга рака полости рта с использованием упрощенных протоколов для окрашивания слизи -стой оболочки полости рта и мобильного микроскопа на основе планшета для облегчения локального сбо-
ра цифровых изображений и удаленной оценки изображений врачами, которые показали соответствие с существующими методами гистологии и цитологии [6]. Анализ спектров, зарегистрированных in vivo при возбуждении спектра на 325 нм непрерывным He-Cd-лазером, позволил различить качественно нормаль -ные, потенциально злокачественные и злокачественные участки слизистой оболочки полости рта. При сборе оптимального объема данных и составлении соответствующей базы данных данный метод возможно в перспективе использовать в клинической диагностике [7]. Использование прямой автофлюоресцентной визуализации ткани и микроскопии биопсийного материала применялись в алгоритме обследования для более точной идентификации патологического процесса в слизистой оболочке полости рта [8]. Используя метод автофлюоресцентной визуализации слизистой оболочки полости рта (автофлюоресцентная стоматология с использованием светодиодного осветителя AFS-400 с длиной волны излучения 400+10 нм и специальных очков), авторам удалось обнаружить веррукозную лейкоплакию, плоский лишай и плоскоклеточный рак [9]. Прижизненная не-инвазивная визуализация с высоким разрешением структуры тканей полости рта с помощью оптической когерентной томографии в различных ее вариантах демонстрирует отличную способность выявлять и диагностировать предраковые, ранние формы рака, дисплазию и злокачественные новообразования эпителия слизистой оболочки рта [10, 11]. Разработанная методика гибридной рамановской спектроскопии и оптической когерентной томографии способна одновременно получать как морфологическую, так и биохимическую информацию о ткани ротовой полости in vivo, облегчая диагностику и определение характеристик тканей в реальном времени и естественных условиях [12]. При использовании в качестве оптического просветляющего агента прозрачного винилполиси-локсанового слепочного материала (VPS), который применяется in vivo, была улучшена видимость подповерхностных окклюзионных повреждений и соединений дентина-эмали в очагах деминерализации с использованием отражательной спектроскопии. Наличие патологических поражений было подтверждено с помощью поляризованной световой микроскопии и микрорадиографии [13].
Однако у оптического излучения имеется сложность в транспорте зондирующего излучения вглубь биологических тканей. С оптической точки зрения почти все биологические ткани являются оптически мутными, поэтому из-за значительного рассеяния излучения в видимом и ближнем ИК спектральных диапазонах пространственное разрешение и глубина зондирования сильно ограничены [14]. Увеличить проникновение излучения путем снижения светорассеяния возможно применяя метод иммерсионного просветления (optical clearing). Для иммерсионного просветления биологических тканей применяются как гиперосмотические агенты: глюкоза, сорбитол,
глицерин, полиэтиленгликоль, пропиленгликоль, диметил сульфоксид, так и растворы, имеющие нормальную осмолярность, такие как рентгеноконтраст-ное вещество йогексол и др. [14].
Целью данной работы было определение эффективного коэффициента диффузии фармацевтического препарата глицерин в ткани прикрепленной десны свиньи и оценка эффективности оптического просветления после полной иммерсии в оптическом диапазоне от 200—800 нм.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Материалом для исследования ex vivo послужили срезы прикрепленной десны свиньи (всего 5 образцов), взятой с верхней и нижней челюстей передней части центральных зубов. Образцы срезов десны препарировались непосредственно перед экспериментом. Толщина образцов биоткани измерялась микрометром, ткань срезов десны помещали между двух предметных стекол (толщину которых затем вычитали), измерения проводились в нескольких точках образца и усреднялись. Точность каждого измерения ±10 мкм. В среднем толщина образцов срезов слизистой десны составила 0,39±0,11 см.
В качестве иммерсионного агента в данной работе использовался фармпрепарат глицерин (Россия) с плотностью раствора, указанной изготовителем, 1,20—1,23, что соответствует массовой доле глицерина в растворе 85—90% соответственно (считаем 87,5% раствор) [15]. Исследование кинетики иммерсии срезов десны свиньи было выполнено в спектральном диапазоне 200—800 нм на двухлучевом спектрофотометре Shimadzu UV-2550 (Япония) с интегрирующей сферой. Источником излучения служила галогено-вая лампа с фильтрацией излучения в исследуемом спектральном диапазоне. Нормировка спектров перед началом измерений проводилась на сигнал от эталонного отражателя BaSO4. Для проведения измерений, каждый образец биологического материала фиксировался в специальном зажиме в виде рамки с окном 0,5^0,5 см, погруженной в кювету и прижатую к стенке кварцевой кюветы. С открытой стороны рамки с образцом в кювету добавляли иммерсионный агент. Для измерения спектров полного пропускания рамка, с фиксированным на ней образцом биоткани, помещалась непосредственно перед интегрирующей сферой собирающей все излучение, прошедшее через образец биоткани. При измерении спектров диффузного отражения (СДО) образец биоткани помещался за интегрирующей сферой, которая собирала все обратно рассеянное образцом излучение.
Определение коэффициента диффузии фармпрепарата глицерина в биоткани основано на измерении кинетики оптических СДО до полного прекращения изменений, используя модель свободной диффузии, приближения которой подробно описаны в [16]. Все эксперименты проводились при комнатной температуре (~25°С) и нормальном атмосферном давлении. Используя второй закон Фика и модифицированный
закон Бугера—Ламберта—Бера, получаем выражение для разности между эффективной оптической плотностью в текущий момент времени A(t, X) и в начальный момент времени A(t = 0, X)
AA(t, X) = A(t, X) - A(t = 0, X) = A^ejr(t, X)L ~ C0{1 - exp(-n2D/4l2)}L, (1)
I = L^p^fh ' AцeíГ(t, X) = = ^ (йа + й',) - f X), где эффективная оптическая плотность определяется как
A = -logRd. (2)
t — время в секундах, в течение которого происходит процесс диффузии МС, X — длина волны, нм, A (t, X) — разность между эффективным коэффициентом ослабления света в биоткани в текущий момент времени и в начальный момент времени, 1/см, L — средняя длина пробега фотонов, которая в режиме обратного рассеяния равна L = 2ld, ld-1 = ^eff, й', = й,(1 — g), см-1, g — фактор анизотропии рассеяния (изменяется в пределах от 0 до 1, для дентина g = 0,93 [2]), а для пропускания L = l, l — толщина образца, см, D — коэффициент диффузии молекул глицерина, см2/с, С0 — начальная концентрация глицерина, %.
Анализ кинетики для разности эффективной оптической плотности (АА) с использованием уравнения (1) и учетом коэффициентов для аппроксимации экспериментальных данных, позволил рассчитать коэффициент диффузии глицерина (D). Для количественной оценки достигаемого просветления ткани определяли эффективность просветления, используя выражение [14]:
T (t) — T (t = 0)
Q (T) = ——-—-— x 100,
T (t = 0)
где Т (t=0) — коэффициент пропускания в начальный момент времени, T(t) — коэффициент пропускания в момент времени t.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Исследовались срезы прикрепленной десны свиньи. Слизистая оболочка десны состоит из двух слоев: эпителия (ЕР) и собственной пластинки (LP). В десне нет подслизистого слоя. LP, на которой находится ЕР, состоит из соединительной ткани, представленной волокнистыми структурами — коллагеновыми и ретикулярными волокнами и клеточными элементами [1]. Оптическая толщина слоев десны человека, измеренная с помощью оптической когерентной томографии с зондом для измерений in vivo (женщина-волонтер, Азия, 30 лет), составила ~ 237 мкм для EP и 830 мкм для LP (для прикрепленной десны) [17]. Геометрические толщины слоев ткани могут быть оценены с использованием среднего показателя преломления n=1,4 при 1310 нм [2], что равно 169 мкм для EP и 593 мкм — для LP, всего 762 мкм. В этом исследовании средняя толщина 5 образцов слизистой оболочки десны равна 390+110 мкм, таким образом,
образцы включали эпителиальный слой (ЕР) и часть слоя собственной пластины (ЕР).
Глицерин является эффективным средством для оптического просветления биотканей, при взаимодействии которого происходит диффузия в образец десны иммерсионной жидкости и осмотический отток воды из биоткани, вследствие чего происходит согласование показателей преломления рассеивателей и внутритканевой жидкости, что приводит к уменьшению коэффициента рассеяния биоткани [14].
СДО образца десны свиньи представлены на рис. 1а. В ультрафиолетовой области они имеют ярковыраженные спады, характерные для полос поглощения белков соединительной ткани в виде коллагеновых и ретикулярных волокон, а также гемоглобина. В области около 415—420 и 540—580 нм наблюдаются провалы на СДО, что соответствует полосам поглощения оксигемоглобина (415, 542 и 576 нм). Глицерин не имеет полос поглощения в исследуемом диапазоне и поглощение воды в диапазоне 200—800 нм пренебрежимо мало, поэтому снижение СДО не сопровождается изменением формы [2].
После иммерсии образцов ткани десны в глицерине полосы поглощения эндогенных хромофоров десны (оксигемоглобина) на СДО становятся менее выраженными, что связано с более низкой вероятностью эффективного поглощения фотонов при их прохождении через просветленный (менее рассеивающий) образец биоткани. При этом форма спектров практически не меняется. Значения коэффициентов диффузного отражения снижаются (рис. 1а) по отношению к исходному образцу, что говорит об уменьшении рассеяния образца слизистой десны. Наибольшие значения полного пропускания наблюдаются в диапазоне длин волн от 625 до 800 нм, поскольку излучение в этом интервале проникает в биологические ткани на большую глубину (это так называемое первое «терапевтическое/диагностическое окно прозрачности», между 625 и 975 нм), поскольку ни эндогенные хромофоры (макромолекулы), ни вода не поглощают сильно в этом диапазоне [2].
На рис. 1б показана типичная усредненная кинетическая кривая для изменения оптической плотности АЛ образца десны человека, при его иммерсии в глицерине, в интервале длин волн от 200—800 нм. Хорошо видно, что значительные изменения оптической плотности образца десны, наблюдаются в течение примерно 30 мин с момента начала его взаимодействия с просветляющим агентом, после чего зависимость насыщается и перестает зависеть от времени, что говорит о завершении процесса диффузии молекул воды из ткани и молекул глицерина в ткань. Эффективный коэффициент диффузии глицерина определяли методом наименьших квадратов из анализа участка экспериментальной кривой, соответствующего значительному изменению оптической плотности. Вычисления для каждого образца выполнялись для десяти длин волн в спектральной области 200—800 нм, а полученные значения усред-
нялись. В среднем значение коэффициента диффузии глицерина в ткани десны свиньи ex vivo составило (3,2±0,7)«10-6 см2/с. Полученные результаты хорошо соотносятся с литературными данными для других мягких тканей, учитывая структурную организацию слизистой десны. Так, коэффициенты диффузии такого оптического просветляющего агента как водный раствор глюкозы в твердой мозговой оболочке, оказались равными (1,1±0,1)«10-6 и (2,0±0,2)«10-6 см2/с для водных 1,5 и 3 моль/г растворов глюкозы соответственно [18]. Диффузия глицерина в воде составляет Dw=3'10-5 см2/с [19]. Исследуемый процесс диффузии приближенно можно представить как диффузию молекул воды через две полупроницаемые биологические мембраны толщиной lt=169 мкм (EP) и l2=593 мкм (LP) и коэффициентами диффузии Dj и D2 соответственно. Общий коэффициент диффузии можно рассчитать следующим образом:
D=(l,+ у2/^)2 /D, + (I2)2 /D (4)
Для оценки Dj может быть подходящим коэффициент диффузии воды в липидной мембране Dj = Dlipid и 3,0'10-7 см2/с [19]. Для оценки D2 в менее плотном и более проницаемом слое LP может использоваться концепция затрудненной подвижности молекул в тканях относительно диффузии воды в воде Dw, которая количественно определяется таким параметром, как извилистость (пористость) ткани S [20]:
S = ld/L = VD„/D2 (5)
которое представляет собой отношение длины пути молекулярного потока между двумя точками ld к прямому расстоянию между этими точками L. Здесь D2 — эффективный коэффициент диффузии, учитывающий удлинение пути диффузии молекул воды. Извилистость тканей находится в диапазоне от 1,2 для мозга и до 3—3,5 для дермы кожи [21]. Извилистость (пористость) для собственной пластины дес-невого слоя LP можно предположить как S«3,4 соответствующим структурной организации для десны, поэтому для Dw=3'10-5 см2/с [20] по формуле (5) D2«0,37'10"5 см2/с. Из уравнения (4) общий коэффициент диффузии рассчитывается как D«3,0«10~6 см2/с, что соответствует экспериментальному значению D=(3,2±0,7)'10"6 см2/с.
Спектры полного пропускания (СПП) образца десны представлены на рис. 2а, б. СПП имеют провалы на характерных длинах волн соответствующим пикам поглощения оксигемоглобина (415, 542 и 576 нм). После иммерсии образцов ткани десны в глицерине полосы поглощения эндогенных хромофоров десны (оксигемоглобина) на СПП становятся менее выраженными, значения коэффициентов полно -го пропускания возрастают во всем диапазоне длин волн (рис. 2) по отношению к исходному состоянию образцов (до иммерсии в глицерине), что говорит об уменьшении рассеяния света образцами.
Значения коэффициентов полного пропускания возрастают во всем диапазоне длин волн (рис. 2) по
отношению к исходному состоянию образцов (до иммерсии в глицерине), что говорит об уменьшении рассеяния света образцами в результате их иммерсии в глицерине.
Основным источником рассеяния света в биотканях является неоднородность показателя преломления за счет различия его значений для компонентов биотканей внутритканевой жидкости и структурных элементов соединительной (фиброзной) ткани (кол-лагеновых и эластиновых волокон). При введении в биоткань иммерсионной жидкости, имеющей пока-
а (а)
25
0
200 300 400 500 600 700 800 X, нм
б (b)
3,5
0
0 20 40 60 80 100
t, мин
Рис. 1. а — Спектры диффузионного отражения десны свиньи в процессе иммерсии в глицерине для разного времени от 0 до 100 мин; б — кинетика разностной эффективной оптической плотности ткани десны свиньи в процессе воздействия глицерина. Символы соответствуют экспериментальным данным, сплошная кривая представляет аппроксимацию экспериментальных данных в рамках предложенной модели свободной диффузии Fig. 1. а — Spectra of diffusion reflection of the gingival samples of a pig during immersion in glycerol for different immersion times from 0 to 100 min; b — the kinetics of the differential effective optical density ofpig gingival tissue during glycerol action. Symbols correspond to experimental data, the solid curve represents an approximation of the experimental data in the framework of the proposed model of free diffusion
затель преломления больший, чем у внутритканевой жидкости, происходит частичное замещение внутритканевой жидкости иммерсионным агентом, что
а (а)
80
70 -
60
50
Ж 40 -
К
30 20 10 0 200
300
0,7
0,6 -
0,5
^ 0,4 ■ К 0,3
0,2 0,1 0 200
400 500 600 700 800 X, нм
80 мин
250
300 350
X, нм
400
Рис. 2. Спектры полного пропускания образцов десны свиньи ex vivo перед и после иммерсии в глицерине: а — в диапазоне 200—800 нм, б — в ультрафиолетовом диапазоне 200—400 нм
Fig. 2. Total transmission spectra of ex vivo pig gingival samples before and after immersion with glycerol; a — in the range of 200—800 nm, b — in the ultraviolet range of200—400 nm
Рис. 3. Гистограмма эффективности оптического просветления на разных длинах волн десны свиньи после иммерсии в растворе глицерина Fig. 3. A histogram of the effectiveness of optical clearing at different wavelengths of the gingiva of a pig after immersion in a solution of glycerol
вызывает выравнивание показателей преломления рассеивателей (например, коллагеновых волокон) ткани и окружающей их среды, и, как следствие, значительное снижение светорассеяния [2]. Глицерин способствует обезвоживанию биоткани, что также снижает рассеяние. Результаты расчета эффективности просветления ткани десны свиньи, произведенных по формуле (3) при определенных длинах волн представлены на рис. 3.
Из результатов расчета по экспериментальным данным значений для эффективности просветления для ткани десны свиньи за 80 мин действия глицерина видно выявление трех динамических окон прозрачности в УФ-диапазонах 200—250, 250—300 и 300—400 нм. Наибольшая эффективность достигается на длине волны 200 нм и составляет 1860%. Хотя абсолютное значение пропускания на этих длинах волн невелико из-за сильного поглощения и составляет всего 0,008%, прирост числа прошедших фотонов оказывается значительным для успешной регистрации УФ сигналов с больших глубин ткани. Второе окно образуется в интервале 250—300 нм с максимальным значением 1360% при 275 нм (абсолютное пропускание, также невелико и составляет 0,05%). Третье динамическое окно прозрачности образуется от 300—400 нм с максимальным значением при 320 нм 1564% (абсолютное значение 0,037%). В ближней ИК области в пределах так называемого «первого терапевтического окна прозрачности» [2], эффективность просветления существенно ниже и составляет 463% при 600 нм; 225% при 700 нм; 180% при 800 нм, однако из-за отсутствия сильных полос поглощения эндогенных хромофоров в этой области спектра абсолютные значения пропускания достаточно большие и составляют соответственно 6,35; 20,67 и 24,68%.
Аналогичные результаты были получены авторами [14], которые использовали высококонцентрированный глицерин для оптического просветления колоректальных тканей с выявлением двух динамических окон прозрачности в УФ-диапазонах 200—260 и 260—418 нм. Подбирая кинетику эффективности при 200 нм, авторам удалось различить нормальную и патологическую слизистую оболочку, что дает перспективы разработки не-инвазивных оптических методов для диагностики патологических онкологических изменений с использованием УФ излучения.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
После иммерсии образцов ткани десны в глицерине полосы поглощения эндогенных хромофоров десны (оксигемоглобина) на СПП становятся менее выраженными, что связано с более низкой вероятностью эффективного поглощения фотонов при их прохождении через просветленный (менее рассеивающий) образец биоткани.
Сочетая методику оптического просветления (optical clearing) в тканях десны свиньи с УФ-спектроскопией, проверен и изучен один из механизмов оптического просветления и выявлено, что наибольшая эффективность оптического просветления наблюдается в местах наименьшего значения показателей полного пропускания. Это доказывает, что несоответствие показателей преломления рассеивателей биологических тканей и просветляющего агента (глицерина) сильнее в УФ и видимом диапазонах спектра. Иммерсия ткани десны в высококонцентрированном глицерине приводит к образованию трех динамических окон прозрачности в УФ области, что может быть использовано для разработки неинвазивных методов диагностики и терапии и нуждается в дальнейшем изучении. Использование спектроскопии диффузного отражения позволило также оценить эффективный коэффициент диффузии фармпрепарата глицерина в тканях десны свиньи ex vivo, который в среднем составил D=(3,2±0,7) • 10-6 см2/с.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Боровский Ф.В., Машкиллейсон А.Л. 7. Хронический рецидивирующий афтозный стоматит. Заболевания слизистой оболочки полости рта и губ, М.: Медпресс, 2011; 235. (Borovskij F.V., Maskillejson A.L. Hroniceskij recidivirufisij aftoznyj stomatit. Zabolevania slizistoj obolocki polosti rta i gub. M.: Med- 8. press, 2011; 235 (in Russian)]
2. Тучин В.В. Оптика биологических тканей. Методы рассеяния света в медицинской диагностике, 2-е издание. Физматлит; 2012; 811. 9. (Tuchin V.V. Tissue Optics: Light Scattering Methods and Instruments for Medical Diagnostics. 3rd edition. Bellingham. WA: SPIE Press; 2015; 866].
3. Shi L., Alfano R. R. Deep Imaging in Tissue and Biomedical Materials: Using Linear and Nonlinear Optical Methods, Taylor & Francis Group, Pan Stanford Publishing Pte. Ltd. Singapore. 2017; 230.
4. Bolton F.J., Bernat A.S., Bar-Am K., Levitz D. Jacques S. Portable, low-cost multispectral 10. imaging system: design, development, validation, and utilization. J. Biomed. Opt. 2018; 23 (12): 121612. https://doi. org/10.1117/1.JB0.23.12.121612. 11.
5. Valdes P., Jacobs V., Wilson B., Leblond F. System and methods for wide-field quantitative fluorescence imaging during neuro-surgery. Opt. Lett. 2013; 38 (15): 2786-8. https://doi.org/10.1364/0L.38.002786.
6. Skandarajah A., Sunny S.P., Gurpur P., Reber C.D., D'Ambrosio M.V., Raghavan N., James B. L., Ramanjinappa R.D., Suresh 12. A., Kandasarma U., Birur P., Kumar V.V., Galmeanu H.C., Itu A.M., Modiga-Arsu M., Rausch S., Sramek M., Kollegal M., Paladini G., Kuriakose M., Ladic L., Koch F., Fletcher D. Mobile microscopy as a screening tool for oral cancer in India: A pilot study. PLoS 13. One. 2017; 12 (11): e0188440.
Для цитирования: Селифонов А.А., Тучин В.В. Кинетические параметры изменения оптических свойств ткани слизистой десны при иммерсии в глицерине: исследования ex vivo. Молекулярная медицина. 2021; 19 (3): 44-50. https://doi.org/10.29296/24999490-2021-03-07
Это позволяет использовать спектроскопию диффузного отражения для изучения диффузии лекарственных средств в тканях человека и определения эффективности оптического просветления.
* * *
В.В. Тучин благодарит за поддержку грант Правительства Российской Федерации №14.W03.31.0023.
Соблюдение этических стандартов
Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей в качестве объектов исследований.
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Conflict of interest
The authors declare no conflict of interest.
visibility of subsurface structures and lesions from tooth occlusal surfaces. J. Biomed. Opt. 2016; 21 (8): 081206. https://doi. org/10.1117/1.JBO.21.8.081206.
14. Oliveira L.M.C., Tuchin V.V. The Optical Clearing Method - A New Tool for Clinical Practice and biomedical Engineering, Cham, Switzerland: Springer, 2019; 456.
15. Дьяконов И.А. Глицерин. Химическая энциклопедия: в 5 т. М.: Советская энциклопедия, 1988; (1): 585-623. (D'akonov I. А. Glicerin. Himiceskaa encik-lopedia: v 5 t. M.: Sovetskaa enciklopedia, 1988; (1): 585-623 (in Russian)]
16. Selifonov A.A., Tuchin V.V. Determination of the kinetic parameters of glycerol diffusion in the gingival and dentinal tissue of a human tooth using optical method: in vitro studies. Optical and Quant. Electr. 2020; 52: 123-1-10. https://doi.org/10.1134/ S0006350918060222.
17. Li K., Yang Z., Liang W., Shang J., Liang Y., Wan S. Low-cost, ultracompact handheld optical coherence tomography probe for in vivo oral maxillofacial tissue imaging.
J. Biomed. Opt. 2020; 25 (4): 046003-1-13. https://doi.org/10.1117/1.JBO.25.4.046003.
18. Genina E.A., Bashkatov A.N., Tuchin V.V Optical clearing of human dura mater by glucose solutions. JBPE. 2017; 3 (1): 010309. https://doi.org/10.18287/JBPE17.03.010309.
19. Schwindt D.A., Wilhelm K.P., Maibach H. I. Water diffusion characteristics of human stratum corneum at different anatomical sites in vivo. J. Invest. Dermatol. 1998; 111 (3): 385-9. https://doi.org/10.1046/j.1523-1747.1998.00321.x.
20. Meriaux S., Conti A., Larrat B. Assessing Diffusion in the Extra-Cellular Space of Brain Tissue by Dynamic MRI Mapping of Contrast Agent Concentrations. Front. Phys. 2018; 6: 38-1-8. https://doi.org/10.3389/ fphy.2018.00038.
Поступила 18 июня 2020 г.
For citation: Selifonov A.A., Tuchin V.V. Kinetic parameters of the change of optical properties of the gingiva under immersion in glycerol: ex vivo research. Molekulyarnaya meditsina. 2021; 19 (3): 44-50 (in Russian). https://doi.org/10.29296/24999490-2021-03-07
Patil A., Unnikrishnan V.K., Ongole R., Pai K.M., Kartha V.B., Chidangil S. Non-invasive in vivo screening of oral malignancy using laser-induced fluorescence based system. Sovremennye tehnologii v medicine. 2018; 10 (1): 15-26. https://doi.org/10.17691/ stm2018.10.1.02.
Shkarednaya O.V., Goryacheva T.P., Chunikhin A.A., Bazikyan E.A., Gazhva S.I. Optimizing the Early Diagnosis of Oral Mucosal Pathologies CTM. 2017; 9 (3): 119-24. https://doi.org/10.17691/stm2017.9.3.16. Булгакова Н.Н., Волков Е.А., Позднякова Т.И. Аутофлюоресцентная стоматоско-пия как метод онкоскрининга заболеваний слизистой оболочки рта. Российский стоматологический журнал. 2015; 19 (1): 27-30.
[Bulgakova N.N., Volkov E.A., Pozdnyakova T.I. Autofluorescent somatoscope as a method of oncoscience diseases of the oral mucosa. Rossiyskiy stomatologicheskiy zhurnal. 2015; 19 (1): 27-30 (in Russian)] Baumann B. Polarization sensitive optical coherence tomography: a review of technology and applications. Appl. Sci. 2017; 7: 47-54. https://doi.org/10.3390/app7050474. Le N. M., Song Sh., Zhou H., Xu J., Li Y., Sung Ch., Sadr A., Chung K.-H., Subhash H.M., Kilpatrick L., Wang R.K. A noninvasive imaging and measurement using optical coherence tomography angiography for the assessment of gingiva: An in vivo study J. Biophotonics. 2018; 11: e201800242. https://doi.org/10.1002/jbio.201800242. Wang J., Zheng W., Lin K., Huang Zh. Development of a hybrid Raman spectroscopy and optical coherence tomography technique for real-time in vivo tissue measurements. Opt. Lett. 2016; 41 (13): 3045-8. https://doi.org/10.1364/OL.41.003045. Kang H., Darling C. L., Fried D. Use of an optical clearing agent to enhance the
