CC BY
113
УДК 665.58.002.39 (088.8)
КИНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ОКИСЛЕНИЯ ФЕНОЛА И ПИРОКАТЕХИНА СВОБОДНОЙ И ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ТИРОЗИНАЗОЙ
Ю.А. Шестеренко Физико-химический институт им. А. В. Богатского
О. В. Севастьянов НАН Украины, Одесса
И. И. Романовская
E-mail: romairina@gmail.com
Получено 13.07.2011
Из грибов Agaricus bisporus выделен частично очищенный препарат тирозиназы. С использованием электрофореза в нативных условиях обнаружено 17 протеиновых фракций, 12 из которых обладают выраженной фенолоксидазной активностью и составляют 92,5% общего протеина. Методом SDS-электрофореза в ПААГ выявлено 9 протеиновых фракций, основными из которых являются фракции с молекулярной массой 12 и 41-48 кДа.
Изучены кинетические параметры окисления фенола и пирокатехина, катализируемого свободной и им мо би ли зо ван ной ти ро зи на зой. По ка за но, что вклю че ние эн зи ма в мат ри цу су ще ст вен но не влияет на Кm и ^макс окисления пирокатехина, однако при биоконверсии фенола Кm увеличивается в 6,3 раза при заметном снижении ^макс. Установлено ингибирование субстратом при изучении окисления пирокатехина, катализируемого свободной и иммобилизованной тирозиназой, а также фенола в при су т ствии сво бод но го эн зи ма.
Ключевые слова: тирозиназа, электрофорез, окисление фенолов, кинетические параметры, иммобилизация.
Проблема очистки производственных стоков от растворенных в воде органических веществ, в частности фенолов, является одной из наиболее важных и одновременно труднорешаемых.
В связи с этим значительный интерес представляют альтернативные технологии удаления фенолов с использованием окисли -тельно-восстановительных энзимов благодаря их се лек тив нос ти, вы со кой сте пе ни очистки, образованию малотоксичных продуктов, возможности применения в широком интервале рН, температуры и концентрации поллютантов [1].
Тирозиназа (монофенол, дигидрок-си^-фенилаланин: кислород оксидоредукта-за КФ 1.14.18.1) — медьсодержащий энзим, катализирующий о-гидроксилирование мо-нофенольных субстратов до о-дифенолов и окисление о-дифенольных поллютантов до о-хинонов с последующим образованием малотоксичных олигомерных продуктов [2]. Является широко распространенным энзимом, отвечающим за биосинтез меланина и других полифенольных соединений в грибах, животных и растительных организмах [2, 3]. Наиболее активно изучаются тирозиназа грибов Agaricus bisporus и микробные энзимы.
Один из основных недостатков применения тирозиназы — высокая стоимость, в связи с чем актуальным является получение частично очищенных ее препаратов. Поскольку про те и но во-фрак ци он ный сос тав пре па ра -тов энзима в значительной степени зависит от метода выделения, изучение особенностей сос та ва вы де лен но го час тич но очи щен -ного препарата методом электрофореза вызывает большой интерес.
Для стабилизации и многократного ис-поль зо ва ния ти ро зи на зы перс пек тив но зак -реп ле ние ее на по ли мер ных но си те лях [3].
В про цес се им мо би ли за ции мо гут из ме -няться конформационные особенности тиро-зиназы, сродство к субстрату, а также ряд дру гих свойств, по э то му оп ре де ле ние ки -нети чес ких па ра мет ров функ ци о ни ро ва ния им мо би ли зо ван ных пре па ра тов мож но рассмат ри вать как весь ма ак ту аль ную за -дачу [2].
Цель данной работы — выделение час-тич но очи щен но го пре па ра та ти ро зи на зы грибов Agaricus bisporus, исследование его про те и но во-фрак ци он но го сос та ва и ки не ти -чес ких осо бен нос тей окис ле ния фе но ла, а также пирокатехина, катализируемого свободным и иммобилизованным энзимом.
Материалы и методы
Частично очищенный препарат тирозиназы из грибов Agaricus bisporus выделяли согласно модифицированному нами методу [4]. В полученном препарате определяли содержание протеина методом Лоури в модификации Хартри [5], содержание меди согласно [6], фенолоксидазную активность — по ти ро зи ну [7].
Протеиново-фракционный состав препарата тирозиназы исследовали методом SDS-электрофореза в 10% -м полиакриламидном геле (ПААГ) в системе Лэммли на приборе Helicon (Россия). Окрашивание осуществляли с использованием Кумасси R-250 [8]. Препараты анализировали в пяти повторениях.
Молекулярную массу исследуемых протеинов рассчитывали по калибровочной кривой «относительная электрофоретическая подвижность/lg молекулярной массы (кДа)», пост-ро ен ной с ис поль зо ва ни ем сле ду ю щих мар -керных протеинов: лизоцим (14,4 кДа), папаин (21 кДа), панкреатическая липаза (35 кДа), овальбумин (40 кДа), бычий сыво-ро точ ный аль бу мин (67 кДа).
Нативный электрофорез осуществляли в 10%-м ПААГ по методу Орнстейн и Дэвис [8].
Кинетику реакции окисления фенола и пирокатехина, катализируемую тирозиназой, определяли по начальной скорости на-коп ле ния про ме жу точ но го про дук та ре ак -ции (о-хинона) спектрофотометрически с по мощью 3-ме тил-2-бен зо ти а зо лон гид ра -зон-гидрохлорида (МБТГ) [9].
Иммобилизацию выделенного препарата тирозиназы проводили, добавляя 4% -й раствор альгината натрия, содержащий энзим, к 5% -му раствору хлорида кальция [10].
Для изучения кинетических особенностей окисления фенола и пирокатехина, катализируемого иммобилизованной тирозиназой, гранулы биокатализатора растворяли с использованием 20% -го раствора ортофосфор-ной кислоты с последующим добавлением карбоната натрия (до рН 6,0-6,5) и гексаметафосфата натрия (10%). Лаг-период реакции окис ле ния фе но ла оп ре де ля ли по за ви си мос -ти ко ли че ст ва об ра зу ю щих ся про дук тов ре -акции от времени. Линейную часть кривой экстра по ли ро ва ли до пе ре се че ния с осью абсцисс; отсекаемый на оси абсцисс отрезок соответствует лаг-периоду реакции [11].
На основе полученных данных методом Хейнса [12] находили константу Михаэлиса Em и максимальную скорость реакции Умакс. Используя метод Диксона [12], определяли константу ингибирования субстратом ki, затем вы чис ля ли оп ти маль ную кон це нт ра цию
субстрата 5опт и оптимальную скорость реакции Уопт Концентрации фенола и пирокатехина составили 8,7510-5-5,610-3 и 410-59,810-2 моль/дм3, соответственно.
Статистическую обработку проводили с использованием критерия Стьюдента.
Результаты и обсуждение
Из грибов Agaricus bisporus вы де лен час -тич но очи щен ный пре па рат ти ро зи на зы с выходом по протеину 0,67 мг/г влажной массы грибов, содержанием ионов меди
0,19%, удельной активностью 500 ед/мг про те и на в 1 мин. Ме тод вы де ле ния мо ди фи -цировали добавлением поликапроамида (М.м. 30 кДа), свя зы ва ю ще го про дук ты окис ле ния по ли фе ноль ных со е ди не ний (ин -ги би то ры ти ро зи на зы), что поз во ли ло по вы -сить активность препарата в 3 раза [4].
Методом нативного электрофореза в ПААГ выявлено 17 протеиновых фракций, 12 из которых обладают выраженной фенолокси-дазной активностью и составляют 92,5% общего протеина. Количество фракций может быть обусловлено наличием изоформ энзима и образованием агрегатов с присутствующими по ли фе но ла ми или пиг мен та ми (табл. 1, рис. 1).
Таблица 1. Фракционный состав и фенолокси-дазная активность тирозиназы (нативный электрофорез в ПААГ)
№ Rf Удельная доля протеиновой фракции в спектре, %
По протеину По фенолоксидазной активности
17 0,10 1,20 -
16 0,14 2,80 -
16 0,17 1,80 -
14 0,21 11,60 10,10
13 0,24 11,60 60,13
12 0,28 30,20
11 0,30 8,20
10 0,36 9,10 8,77
9 0,40 7,20 4,23
8 0,46 2,40 3,69
7 0,48 1,70 4,31
6 0,62 1,50 -
6 0,66 9,60 1,98
4 0,61 0,80 3,12
3 0,66 0,10 3,67
2 0,71 0,10 -
1 0,78 0,10 -
А Б
Рис. 1. Электрофореграммы (нативный электро-фо рез) пре па ра та ти ро зи на зы:
А — протеиновые фракции;
Б — фе но лок си даз ная ак тив ность фрак ций
Ис сле до ва ние про те и но во-фрак ци он но го состава выделенного препарата тирозиназы методом SDS-электрофореза в ПААГ показало наличие девяти протеиновых фракций (рис. 2). Ус та нов ле но, что ос нов ны ми яв ля -ются фракции с молекулярной массой 12 ± 1,0 и 41-48 ± 4,6 кДа.
Полученные нами данные согласуются с представленными в литературе. Так, M. Schu-rink et al. [13] методом SDS-электрофореза выявили наличие легкой (L) и тяжелой (H) полипептидных цепей с М.м. 14 ± 0,6 и 49 ± 1,7 кДа, соответственно. Молекулярная масса нативной тирозиназы, определенная методом гель-фильтрации, составила 127±4 к Да, что дало основание авторам предположить ге те ро тет ра мер ную струк ту ру эн зи ма сос та -ва (HL)2.
Ря дом дру гих ав то ров по ка за но, что in vivo энзим находится в основном в латент-
kDa kDa
66 т
46 ► тт -*48 ^45 -*41
31 —4 36 33 '30 26 26
21
14 ^*12
Рис. 2. Протеиновые фракции выделенной из грибов Agaricus bisporus тирозиназы, выявленные методом SDS-электрофореза в ПААГ
ной форме. Методом SDS-электрофореза определена его молекулярная масса — 67 к Да. Латентная тирозиназа расщепляется под действием протеаз до промежуточной формы (М.м. 58 кДа) с последующим образованием активного энзима (М.м. 43 кДа) и фрагмента (15 кДа) [14].
Латентная форма тирозиназы нами не выявлена, что может объясняться способом выделения и стадией развития плодовых тел. Однако величина молекулярной массы ак тив ной фор мы и от щеп ля ю ще го ся фраг -мен та сог ла су ют ся с по лу чен ны ми на ми дан ны ми.
Также существует предположение, что L-цепь не является фрагментом тирозиназы: эта фрак ция мо жет быть предс тав ле на смесью лектина и маннаназы, соосаждаю-щихся в процессе выделения энзима [14].
Нами были обнаружены три минорные фракции с молекулярной массой 30-35 кДа; фракция с М.м. 35 кДа также описана в литературе [15]. Остальные фракции (25-26 кДа), вероятно, представлены балластными протеинами, либо продуктами деградации.
Несмотря на определенный объем известной ин фор ма ции от но си тель но ком мер чес -ких препаратов тирозиназы, определение кинетических параметров функционирования выделенных, частично очищенных препаратов энзима является актуальной задачей.
В тирозиназном катализе участвуют два субстрата: молекулярный кислород и фенольное соединение. Известно, что в процессе катализа энзим полностью насыщен кислородом, о чем свидетельствуют значения Км по кислороду, составляющие для различных фенольных субстратов 0,04-55,6 мкмоль/дм3 [16], что значительно ниже растворимости кислорода в воде (1,3 ммоль/дм3 при 25 °С) [17], поэтому изучение кинетических особенностей катализа осуществляли по фенольному субстрату.
При окислении фенола, катализируемого ти ро зи на зой, бы ло по ка за но на ли чие лаг-периода, обусловленного тем, что в условиях in vivo большая часть энзима существует в мет-форме (85%), не способной связы -вать молекулярный кислород. Эта форма не катализирует окисление монофенолов, однако обладает высоким сродством к ним и связывает их без протекания реакции, что и при во дит к воз ник но ве нию лаг-пе ри о да [2].
Кривая окисления фенола имеет S-образный вид, что согласуется с данными, представленными в [11], величина лаг-периода составила 1,22 мин (рис. 3).
лимитирующей в процессе тирозиназного окисления, тогда как для пирокатехина эта стадия отсутствует [2].
В результате иммобилизации выделенного препарата тирозиназы в гель альгината кальция получен высокоактивный стабильный биокатализатор реакции окисления фенолов многоразового использования [10].
Исследование влияния иммобилизации ти ро зи на зы на ки не ти чес кие па ра мет ры показало, что величина лаг-периода окисления фенола, катализируемого иммобилизованным энзимом, увеличилась до 1,83 мин (рис. 3).
Выявлено, что включение тирозиназы в матрицу существенно не влияет на Кm по пирокатехину. Однако по фенолу заметно увеличивается (в 6,3 раза), что, вероятно, обусловлено уменьшением сродства энзима к субстрату в результате конформационных изменений глобулы протеина (табл. 2).
Показано, что Умакс окисления фенола, катализируемого иммобилизованным препаратом, снижается в 2,9 раза по сравнению со свободным, в то время как скорость окисления пирокатехина с использованием иммобилизованной тирозиназы уменьшается всего в 1,2 раза.
Полученные результаты подтверждают большую стабильность дифенолазной актив-нос ти ти ро зи на зы [2].
При изучении окисления пирокатехина, катализируемого свободной и иммобилизованной тирозиназой, наблюдали ингибирование
Таблица 2. Кинетические параметры окисления пирокатехина и фенола с использованием свободной и иммобилизованной тирозиназы
Энзим Пирокатехин Фенол
К^ ммоль/дм3 Умакс, мкмоль/мг протеина в 1 мин Кп1, ммоль/дм3 Умакс, мкмоль/ мг протеина в 1 мин
Свободная тирозиназа 0,160 39,2 0,154 1,69
Иммобилизованная тирозиназа 0,182 32,3 0,970 0,592
Таблица 3. Субстратное ингибирование сво бод ной и им мо би ли зо ван ной ти ро зи на зы
Субстрат Энзим Кі, ммоль/дм3 ІЗопт., ммоль/дм3 Уопт., мкмоль/мг протеина в 1 мин
Пирокатехин Свободная тирозиназа 23,44 1,88 35,90
Иммобилизованная тирозиназа 108,60 3,33 27,25
Фенол Свободная тирозиназа 2,0 0,55 1,33
Иммобилизованная тирозиназа - - -
ф 0,45 -3 0,4
О" 0.35 - Г
0,3 - /
0,25 - /
0,2 -
0,15 - ! 'ґ*
0,1 - ! х
0,05 -
0 - 1 , т , ,
0 2 4 6 8 10 12 Время, мин
—Свободная тирозиназа Иммобилизованная тирозиназа
Рис. 3. Зависимость количества образующегося о-хинона от времени в реакции тирозиназного окис ле ния фе но ла
Полученные значения Кm и Vмакс представлены в табл. 2. Показано, что величины Кш^ (0,15 и 0,16 ммоль/дм3 для фенола и пирокатехина) соответствуют данным, представленным в литературе — 0,16-4,0
ммоль/дм3 [18, 19] и 0,15-0,17 ммоль/дм3 [16, 20], со от ве т ствен но.
Следует отметить, что при окислении пирокатехина максимальная скорость (39,2 мкмоль/мг протеина в 1 мин) значительно выше по сравнению с таковой для фенола (1,69 мкмоль/мг протеина в 1 мин), что обусловлено наличием стадии введения ОН-группы в о-поло-жение молекулы фенола, являющейся
субстратом: Кі иммобилизованной тирозиназы пирокатехином (108,б ммоль/дм3) увеличилась в 4,б раза по сравнению со свободным энзимом (23,44 ммоль/дм3) (табл. 3). К тирозиназы, катализирующей окисление фенола, составила 2,0 ммоль/дм3; в присутствии им мо би ли зо ван но го эн зи ма в изученных концентрациях установлено отсутствие ингибирования фенолом. Полученные результаты свидетельствует о стабилизирующем влиянии включения в альгинат кальция. Рассчитанные значения концентраций фенольных субстратов и скоростей
реакций, учитывающие субстратное ингибирование (табл. 3), позволяют оптимизировать процессы окисления фенола и пирокатехина, катализируемые тирозиназой.
Таким образом, согласно модифицированному методу осуществлено выделение частично очищенного препарата тирозиназы, изучен его протеиново-фракционный состав, кинетические особенности окисления монофенол ьного и дифенол ьного субстратов, катализируемого свободной и иммобилизованной тирозиназой.
ЛИ ТЕ РА ТУ РА
1. Kameda E., Langone M. A., Coelho M. A. Tyrosinase extract from Agaricus bisporus mushroom and its in natural tissue for specific phenol removal // Environm. Technol. — 200б. — V. 11, N Т. — Р. 1209-1215.
2. Halouli S., Aster M., Sigoillot I.-C. et al. Fungal tyrosinases: new prospects in molecular characteristics, bioengineering and biotechnological application // J. Appl. Microbiol. — 200б. — V. 100. — P. 219-232.
3. Duran N., Rosa M. A., D’Annibale A et al. Application of laccase and tyrosinase (phenoloxidases) immobilized on different supports: a review // Enz. Microb. Technol. — 2002. — V. 31. — P. 90Т-931.
4. Романовська І. І., Осійчук О. В., Шестеренко Ю. А., Севастьянов О. В. Ферментативні методи елімінації фенольних полютантів // Мікроб. біотехнол. — 2008. — № 1(2). — С. Т2-Т8.
5. Hartree E. F. Determination of protein: a modification of the Lowry method, that gives a linear photometric response // Anal. Biochem. — 19Т2. — V. 48, N 1. — P. 422-42Т.
6. Stark G. R., Dawson C. R. Spectrophotometric microdetermination of copper in copper oxidases using oxalyldihydrazide // Anal. Chem. — 1958. — V. 30, N 2. — P. 191-194.
Т. Ikehata K., Nicell J. Color and toxicity removal following tyrosinase-catalyzed oxidation of phenols // Biotechnol. Progr. — 2000. — V. 1б, N 4. — P. 533-540.
8. Ермаков А. И., Арасимович В. В., Ярош Н. П. Методы биохимического исследования растений. — Л.: Агропромиздат, 198Т. — 430 с.
9. Rodriguez-Lopez J. N., Escribano J., Garcia-Canovas F. A. Continuous spectropho-tometric method for the determination of monophenolase activity of tyrosinase using 3-methyl-2-benzothiazolinone // Anal. Biochem. — 1994. — V. 21б, N 1. — P. 205-212.
10. Романовская И. И., Шестеренко Ю.А., Севастьянов О. В. и др. Способ элиминации
фенола с использованием тирозиназы Agaricus bisporus, иммобилизованной в альгинат // Химия и технология воды. — 2010. — Т. 32, № 1. — С. 107-115.
11. Гукасян Г. С. Исследование кинетики окисления монофенолов тирозиназой. Влияние восстановителей // Биохимия. — 2002. — Т. 67, № 2. — С. 332-336.
12. Келети Т. Основы ферментативной кинетики. — М.: Мир, 1990. — 348 с.
13. Schurink M., van Berkel W. J., Wichers H. J. et al. Novel peptides with tyrosinase inhibitory activity // Peptides. — 2007. — V. 28, N 3. — Р. 485-495.
14. Flurkey W. H., Inlow K. Proteolytic processing of polyphenol oxidase from plants and fungi // J. Inorg. Biochem. — 2008. — V. 102, N 12. — Р. 2160-2170.
15. Espin J. C.,Wichers H. J. Activation of a latent mushroom (Agaricus bisporus) tyrosinase isoform by sodium dodecylsulfate (SDS). Kinetic properties of the SDS-activa-ted isoform // J. Agr. Food. Chem. — 1999. — V. 47, N 9. — P. 3518-3525.
16. Munoz-Munoz J. L., Garcia-Molina F., Garcia-Ruiz P. A. et al. Phenolic substrates and suicide inactivation of tyrosinase: kinetics and mechanism // Biochem. J. — 2008. — V. 416, N 3. — P. 431-440.
17. Rodriguez-Lopez J. N., Ros J. R., Varon R. et al. Oxygen Michaelis constants for tyrosinase // Ibid. — 1993. — V. 293. — P. 859-866.
18. Sharina A. H., Lee Y. H., Musa A. Effects of gold nanoparticles on the response of phenol biosensor containing photo curable membrane with tyrosinase // Sensors. — 2008. — V. 8, N. 10. — Р. 6407-6416.
19. Gu B. X., Xu C. X., Zhu G. P. et al. Tyrosinase immobilization on ZnO nanorods for phenol detection // J. Phys. Chem. — 2009. — V. 113, N 1. — Р. 377-381.
20. Jiuhong Y., Huangxian J. Pure organic phase phenol biosensor based on tyrosinase entrapped in a vapor deposited titania sol-gel membrane // Electroanalysis. — 2004. — V. 16, N 16. — Р. 1305-1310.
КІНЕТИЧНІ ОСОБЛИВОСТІ ОКИСНЕННЯ ФЕНОЛУ І ПІРОКАТЕХІНУ ВІЛЬНОЮ ТА ІММОБІЛІЗОВАНОЮ ТИРОЗИНАЗОЮ
Ю.А. Шестеренко
О. В. Севастьянов 1.1. Романовська
PHENOL AND PYROCATECHIN OXIDATION CATALYZED BY FREE AND IMMOBILIZED TYROSINASE
Yu. A. Shesterenko O. V. Sevastyanov
I. I. Romanovskaya
Bogatsky Physico-Chemical Institute of National Academy of Sciences of Ukraine, Odesa
Фізи ко-хімічний інсти тут ім. О. В. Богатського НАН України,
Оде са
E-mail: romairina@gmail.com
Із грибів Agaricus bisporus виділено частково очищений препарат тирозинази. Із використанням електрофорезу за нативних умов знайдено 17 протеїнових фракцій, 12 з яких мають виражену фенолоксидазну активність і становлять 92,5% загального протеїну. Методом SDS-електрофорезу в ПААГ виявлено 9 протеїнових фракцій, основними з яких є фракції з молекулярною масою 12 і 41-48 кДа.
Вивчено кінетичні параметри окиснення фенолу і пірокатехіну, що каталізується вільною й іммобілізо ва ною ти ро зи на зою. По ка за -но, що вклю чен ня ен зи му в мат ри цю істот но не впливає на Km і Vмакc окиснення пірокатехіну, однак під час біоконверсії фенолу Km збільшується в б,3 раза за помітного зниження V^^. Встановлено інгібування субстратом у процесі вивчення окиснення пірокатехіну, що каталізується вільною й іммобілізованою тирозиназою, та фенолу в присутності вільного ен зи му.
Клю чові сло ва: ти ро зи на за, елект ро фо рез, окиснення фенолів, кінетичні параметри, іммобілізація.
E-mail: romairina@gmail.com
According to modified method, partially purified tyrosinase preparation from Agaricus bisporus mushroom was isolated. Using the native electrophoresis, 17 protein fractions were found, 12 of which demonstrated well-marked phenoloxidase activity, accounting for 92.5% of total protein. By the SDS-PAGE method, 9 protein fractions were revealed; the main of them were fractions with molecular masses of 12 and 41-48 kDa.
The kinetic parameters of phenol and catechol oxidation catalyzed by free and immobilized tyrosinase were studied. Et was shown that absence of enzyme entrapment in matrix significantly influences on Km and Vmax of catechol oxidation, but at phenol bioconversion the Km increased 6.3-fold along with appreciable decreasing of Vmax. During the investigation of catechol oxidation, catalyzed by free and immobilized tyrosinase, as well as phenol by free enzyme, the substrate inhibition was revealed.
Key words: tyrosinase, electrophoresis, phenol oxidation, kinetic parameters, immobilization.
