Кинетические исследования взаимодействия бактериальных липополисахаридов с полимиксином биолюминесцентным методом Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ХИМИЧЕСКИЕ НАУКИ

Ученые записки Таврического национального университета им. В. И. Вернадского Серия «Биология, химия». Том 27 (66). 2014. № 4. С. 100-108.

УДК 577.181.5+615.076.7+615.281.9

КИНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ С ПОЛИМИКСИНОМ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫМ МЕТОДОМ

Кацев А.М.

Крымский государственный медицинский университет имени С. И. Георгиевского, Симферополь, Россия Е-mail: katsev@mail.ru

Изучено взаимодействие липополисахаридов (эндотоксинов) бактерий S. minnesota и E. coli K235 с полимиксином В. Кинетические исследования проводили с использованием биолюминесцентного метода, основанного на измерении интенсивности свечения морских тест-бактерий в зависимости от концентрации ингибитора. В работе использовали штамм Photobacterium leiognathi Sh1, выделенный из вод Азовского моря автором. Показано, что при связывании липополисахаридов с антибиотиком ингибиторные свойства последнего снижаются, что выражается в восстановлении интенсивности биолюминесцентного сигнала. С использованием такого подхода расчетным и графическим методами определены константы ассоциации полимиксина и липополисахарида, которые варьировали в пределах 4,77 106-1,81 107 М-1. Анализ литературных данных показал, что полученные значения констант совпадают с данными других физико-химических методов. Ключевые слова: люминесцентные бактерии, липополисахарид, полимиксин.

ВВЕДЕНИЕ

Липополисахарид (ЛПС, эндотоксин) - термостабильный компонент наружной части клеточной мембраны всех грамотрицательных микроорганизмов. Он обеспечивает структурную целостность бактериальной клетки и защищает мембрану от агрессивных воздействий окружающей среды. Макромолекулы ЛПС включают три ковалентно связанных компонента: липид А; центральный олигосахарид и О-антиген. Липид А, самый консервативный элемент ЛПС, обеспечивает связь молекулы с бактериальной мембраной. После разрушения бактериальной клетки липид А высвобождается в кровь и может вызывать тяжёлые токсические последствия. Бактериальные ЛПС являются основной причиной сепсиса, а присутствие их следов в воде или лекарственных препаратах, в особенности для парентерального введения, могут обуславливать пирогенный и другие биологические эффекты [1, 2].

Действие многих антибиотиков, активных против грамотрицательных бактерий, направлено на нейтрализацию или повреждение ЛПС. Одним из таких лекарственных средств является полимиксин (ПмВ), антибиотик полипептидной природы, высокоспецифично взаимодействующий с ЛПС и нейтрализующий его токсические свойства. Связывание ПмВ с ЛПС достаточно хорошо изучено с применением различных физико-химических методов, что отражено в работах [1, 3, 4].

Целью данной работы было изучение количественного взаимодействия ЛПС с ПмВ с использованием нового бактериального биолюминесцентного метода.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для проведения кинетических исследований взаимодействия ПмВ с ЛПС использовали биолюминесцентный метод, основанный на использовании морских светящихся тест-бактерий Photobacterium leiognathi Sh1, выделенных из вод Азовского моря [5]. Общий дизайн эксперимента показан на рис. 1. На первом этапе изучали действие ПмВ на биолюминесценцию светящихся бактерий с установлением временных и концентрационных зависимостей (рис. 1, А). Линейные участки кривых ингибирования использовали в качестве калибровочных зависимостей для нахождения концентрации свободного антибиотика в растворе (R2>0,9).

На втором этапе изучали действие ЛПС на светящиеся бактерии, определяя интервалы времени воздействия и концентрации, при которых не происходило ингибирования свечения (рис. 1, Б). Далее, для оценки связывания в кюветах люминометра или в 24-луночных планшетах смешивали ПмВ и ЛПС в присутствии буферного раствора и/или раствора 3% NaCl. Реакционную смесь инкубировали в течение 20-30 мин для установления равновесия, после чего прибавляли суспензию светящихся бактерий. В результате взаимодействия с ЛПС концентрация свободного ПмВ снижалась, что приводило к восстановлению свечения бактерий (рис. 1, В). Полученные данные использовали для определения констант ассоциации ПмВ-ЛПС расчетным и графическим (в координатах Скетчардта) методами.

В работе использовали препараты ЛПС S. minnesota (Sigma, USA), а также E. coli K235, который получали в лабораторных условиях по методу Вестфаля [6].

Измерения биолюминесценции проводили на биолюминометре БЛМ-8801 (СКТБ «Наука», Россия)

О

О

А. Определение острого действия ПмВ

ПмВ

1,%4 Линейный

5-15 мин

100 50 1"

участок

Б. Определение острого действия ЛПС

ЛПС

5-15 мин

1,%

100

50

В. Оценка связывания ПмВ с ЛПС

С

С

ПмВ+ЛПС

20-30 мин

1,%

100 -50

С

Рис. 1. Методика биолюминесцентного кинетического анализа связывания ПмВ-ЛПС.

РЕЗУЛЬТАТЫ И обсуждение

Как было показано в работах [7, 8], биотестирование с использованием светящихся бактерий может применяться не только для определения токсичности водных сред, но и в качестве кинетического метода для оценки комплексообразования (связывания) веществ - ингибиторов свечения бактерий, с веществами, которые не влияют на их биолюминесценцию. Одной из таких комбинаций может быть пара полимиксин-липолисахарид. Реакция между ними происходит за счет взаимодействия антибиотика с консервативным элементом ЛПС, липидом А, что и приводит к частичной или полной инактивации биологических эффектов эндотоксина [1, 3].

Ранее было показано, что антибиотик ПмВ является сильным ингибитором биолюминесценции с действующей концентрацией ЭК80=0,2 мкг/мл (1,67-10-8 моль/л). Связывание ПмВ с ЛПС приводило к снижению его активности,

что сопровождалось восстановлением интенсивности бактериальной люминесценции. Так, если в присутствии ПмВ, через 20 минут биолюминесценция бактерий снижалась до 10%, то внесение ЛПС от 0,3 до 2,6 мкг/мл приводило к восстановлению свечения до 25-78% от контрольных значений [7, 8].

Так как интенсивность свечения бактерий при биотестировании пропорциональна концентрации свободного антибиотика (в линейной области зависимости, рис. 1 А), то использование биолюминесцентного метода дает возможность быстрого определения параметров связывания. Как показано на рис. 2, при увеличении концентрации ПмВ, разность относительных значений биолюминесценции в присутствии и в отсутствии ЛПС возрастает и после достижения максимума снижается. Стадия нарастания связана со снижением антибитической активности ПмВ при связывании с ЛПС, а фаза спада вызвана нарастанием концентрации свободного антибиотика, после достижения предельного связывания с ЛПС. Таким образом, ЛПС E. coli K235 и S. minnesota связывают 8,33-10-8 моль ПмВ на 1 мг ЛПС, независимо от происхождения. Полученное значение является молярным показателем количества липида А в ЛПС, который стехиометрически (1:1) взаимодействует с молекулой антибиотика. Поскольку из-за высокой гетерогенности препаратов ЛПС определить точную величину их молекулярной массы довольно трудно, полученное соотношение связывания было использовано для выражения молярной концентрации ЛПС.

С(ПмВ), моль/л

Рис. 2. Зависимость биолюминесценции бактерий от концентрации ПмВ в присутствии липополисахарида: 1 - E. coli K235; 2 - S. minnesota.

Анализ равновесного связывания ПмВ с ЛПС и определение констант ассоциации проводили расчетным способом (таблица 1 и 2). Равновесные концентрации ПмВ (Lp) определяли по интенсивности бактериальной

биолюминесценции (I, %), используя зависимость I от С в качестве калибровочной. Равновесную концентрацию комплекса ЛПС-ПмВ (Bp) определяли по формуле:

где La - общая концентрация ПмВ.

Равновесную концентрацию ЛПС оценивали как

Qp=Qa-Bp,

где Qa - начальная концентрация ЛПС.

Принимая, что взаимодействие ПмВ с ЛПС (липидом А) можно представить в виде уравнения

ПмВ+ЛПС^ ЛПС-ПмВ,

то константы связывания могут быть рассчитаны по известной формуле закона действующих масс:

K - Bp

Ka = T~Q

pp

Полученные расчетным путем значения Ка для ЛПС E. coli K235 и S. minnesota были практически одинаковы и составляли в среднем 9,86-10б±3,66-10б М-1 и 8,72-106±б,22-106 М-1 соответственно.

Таблица 1

Расчет констант связывания (Кас) ЛПС с ПмВ

Показатели ЛПС E. coli K235 ЛПС S. minnesota

Ьа (моль/л) 8,33E-08

I, % 63 85,2 58 92

Ьр (моль/л) 5,20E-08 2,08E-08 5,95E-08 1,13E-08

Вр (моль/л) 3,14E-08 6,25E-08 2,38E-08 7,20E-08

Qa (моль/л) 8,45E-08 4,25E-07 8,50E-08 4,25E-07

Qp (моль/л) 5,37E-08 3,63E-07 6,12E-08 3,53E-07

Ка 1,12E+07 8,30E+06 6,54E+06 1,80E+07

Ка (среднее) 9,75 106±2,05106 1,23 107±8,10106

Ьа (моль/л) 1,67E-07

I, % 55 76,7 51,6 76,9

Ьр (моль/л) 1,14E-07 5,91E-08 1,32E-07 6,30E-08

Вр (моль/л) 5,25E-08 1,08E-07 3,46E-08 1,04E-07

Qa (моль/л) 8,45E-08 4,25E-07 8,50E-08 4,25E-07

Qp (моль/л) 3,25E-08 3,17E-07 5,04E-08 3,21E-07

Ка 1,42E+07 5,73E+06 5,21E+06 5,12E+06

Ка (среднее) 9,97 106±5,99106 5,17106±6,36104

Таблица 2

Результаты графического метода определения констант связывания ЛПС с ПмВ

Показатель E. coli K235 S. minnesota

1 2 1 2

X (La) 1,25E-07 7,50E-08 1,70E-07 1,10E-07

Y (Ka La) 2,85 1 0,85 0,5

Ка 2,28E+07 1,33E+07 5,00E+06 4,55E+06

Также для определения констант связывания был использован графический метод с представлением результатов в координатах Скетчардта (рис. 3, 4). При этом уравнение закона действующих масс может быть представлено в линейном виде:

Bp

Q - Ka ' La - Ka ' Bp

Построение такой зависимости в координатах BP/QP от BP при разных концентрациях La дает возможность получить значения Ка по тангенсу угла наклона прямых к оси Х (отношение отрезков, отсекаемых прямыми по оси Y и X), таблица 2.

Таким образом, средние значения констант связывания ПмВ с ЛПС E. coli K235 и S. minnesota, полученные графическим методом составили, соответственно, 1,81-107±6,69-106 М-1 и 4,77-106±3,21-105 М-1, что близко к расчетным результатам (Таблица 1).

Результаты данной работы свидетельствуют о том, что взаимодействие ПмВ с ЛПС E. coli K235 и S. minnesota происходит практически одинаково. Значения Ка, определенные с помощью биолюминесцентного метода, практически совпадают с имеющимися в литературе данными, полученными другими методами. Так, по данным калориметрического титрования значения Ка для различных грамотрицательных бактерий варьировали от 1,2^ 106 до 8,53^ 106 M-1 [1, 3]. Близкие результаты были получены и методом флуоресцентной спектроскопии [1]. Сходные значения параметров ассоциации антибиотика с липополисахаридами различных грамотрицательных бактерий свидетельствуют о том, что связывание ПмВ происходит действительно с самым консервативным элементом эндотоксина -липидом А, который имеет незначительные вариации в зависимости от родовой и видовой принадлежности бактерий [1, 2, 6].

Рис. 3. Анализ связывания ЛПС E. coli K235 с ПмВ в координатах Скетчардта при концентрации ПмВ: 1 - 0,2 мкг/мл (1,67-10-7 моль/л); 2 - 0,1 мкг/мл (8,33-10-8 моль/л).

Рис. 4. Анализ связывания ЛПС S. minnesota с полимиксином В в координатах Скетчардта при концентрации ПмВ: 1 - 0,2 мкг/мл (1,67-10-7 моль/л); 2 - 0,1 мкг/мл (8,33-10-8 моль/л).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

1. Изучено взаимодействие полимиксина В с ЛПС S. minnesota и E. coli K235 с применением нового биолюминесцентного метода.

2. Показано, что в равновесии 1 мг ЛПС, независимо от происхождения, связывает 8,33-10"8 моль ПмВ.

3. С использованием расчетного и графического методов определены константы ассоциации ПмВ и ЛПС, которые варьировали в пределах 4,77-106-1,81-107 М-1 и совпадали с имеющимися литературными данными.

Список литературы

1. Bhor V.M. Polymyxin B: an ode to an old antidote for endotoxic shock / V.M. Bhor , C.J. Thomas, N. Surolia, A. Surolia // Mol. Biosyst. - 2005. - Vol. 1, №3. - P. 213-222.

2. Endotoxin-neutralizing capacity of serum from cardiac surgical patients / E. Bennett-Guerrero, G.R. Barclay, P.L. Weng [et al.] // J. Cardiothorac. Vasc. Anesth. - 2001. - Vol. 15, № 4. - P. 451-454.

3. Srimal S. Titration calorimetric studies to elucidate the specificity of the interactions of polymyxin B with lipopolysaccharides and lipid A / S. Srimal, N. Surolia, S. Balasubramanian, A. Surolia // Biochem J. - 1996. - Vol. 315, Pt 2. - P. 679-686.

4. Endotoxin assay by bioluminescence using mutant firefly luciferase / K. Noda, H. Goto, Y. Murakami [et al.] // Anal. Biochem. - 2010. - Vol. 397, № 2. - Р.152-155.

5. Кацев А. М. Новые термофильные люминесцентные бактерии, выделенные из Aзовского моря // Таврический медико-биологический вестник. - 2014. - Т. 17, № 2. - С. 59-64.

6. Вестфаль О. Бактериальные липополисахариды / О. Вестфаль , К. Янн // Методы химии углеводов. - 1967. - С. 325-332.

7. Биолюминесцентный метод определения липополисахаридов / А. М. Кацев, И. Г. Онучина, А.И. Гордиенко, В. А. Белоглазов // Таврический медико-биологический вестник. - 2001. - Т.4, № 1-2. - С. 120-123.

8. Изучение связывания бактериальных липополисахаридов с полимиксином биолюминесцентным методом / А. М. Кацев, И. Г. Онучина, А. И. Гордиенко, В. А. Белоглазов // Украшський бю^чний журнал. - 2002. - Т. 74, № 6. - С. 103-107.

KINETIC STUDIES OF BACTERIAL LIPOPOLYSACCHARIDES INTERACTION WITH POLYMYXIN BY A BIOLUMINESCENT METHOD

Katsev A.M.

Crimean State Medical University named after S.I. Georgievskiy, Simferopol, Crimea, Russia

E-mail: katsev@mail.ru

Lipopolysaccharides (endotoxin), thermostable components of cell outer membrane of Gram-negative organisms, exhibit a wide range of biological functions including toxic properties. A lot of antibiotics active against gram-negative bacteria, are directed to the neutralization or damage of lipopolysaccharides. One of those drugs is a polymyxin, a polypeptide antibiotic, highly specific interacting with endotoxins and counteracting their toxic properties. Thus the aim of this study was a quantitative study of the interaction of lipopolysaccharide with polymyxin B using bacterial bioluminescent method. New marine

luminescent bacteria Photobacterium leiognathi Sh1, isolated from the Sea of Azov, was used as a test-strain to study kinetic characteristics of the binding.

Under the action of polymyxin, bioluminescence of test-bacteria was shown to reduce with effective concentration EC80=0.2 mcg/ml (1,67-10-8 mol/l). Binding of the antibiotic with lipopolysaccharides resulted in a decrease in its activity and recovery of bacterial luminescence intensity. Endotoxins from E. coli K235 and S. minnesota were determined to bind the same amount of polymyxin - 8,33-10-8 mol/mg, regardless of the origin. This value then was used as an indicator of the amount of lipid A of LPS in the determination of association constants (Ka) by means of calculation and graphical methods. The calculated Ka of polymyxin and LPS from E. coli K235 and S. minnesota were almost the same and averaged 9,86-106±3,66-106 M-1 and 8,72-106±6,22-106 M-1 respectively. The binding constants determined by graphical method were equal to 1,81-107±6,69-106 M-1 and 4,77-106±3,21-105 M-1.

It was noted that similar values of association constants for polymyxin and lipopolysaccharides from E. coli K235 and S. minnesota meant that the binding did occur with lipid A, the most conserved element of endotoxins, which has minor variation depending on the genus and the species of bacteria.

Keywords: luminescent bacteria, lipopolysaccharide, polymyxin.

References

1. Bhor V.M., Thomas C.J., Surolia N., Surolia A. Polymyxin B: an ode to an old antidote for endotoxic shock, Mol. Biosyst, 1(3), 213 (2005).

2. Bennett-Guerrero E., Barclay G.R., Weng P.L. [et al.] Endotoxin-neutralizing capacity of serum from cardiac surgical patients, J. Cardiothorac. Vasc. Anesth., 15(4), 451 ( 2001).

3. S. Srimal, N. Surolia, S. Balasubramanian, A. Surolia Titration calorimetric studies to elucidate the specificity of the interactions of polymyxin B with lipopolysaccharides and lipid A, Biochem J., 315(2), 679 (1996).

4. Noda K., Goto H., Murakami Y. [et al.] Endotoxin assay by bioluminescence using mutant firefly luciferase, Anal. Biochem, 397(2), 152 (2010).

5. Katsev A.M. New thermophilic luminescent bacteria isolated from Azov sea, Tavricheskiy Mediko-Biologicheskiy Vestnik, 13(2), 59 (2014).

6. Westphal O., Jann K. Bacterial lipopolysaccharides, Methods of carbohydrates chemistry, 325 (1967).

7. Katsev A.M., Onuchina I.G., Gordienko A.I., Beloglazov V.A. Bioluminescent method for lipopolysaccharides assay, Tavricheskiy Mediko-Biologicheskiy Vestnik, 4(1-2), 120 (2001).

8. Katsev A.M., Onuchina I.G., Gordienko A.I., Beloglazov V.A. Study of the binding between bacterial lipopolysaccharides and polymyxin by a bioluminescent method, Ukrainskii biokhimicheskii zhurnal 74 (6), 103 (2001).

Поступила в редакцию 12.11.2014 г