CC BY
13
DOI 10.29254/2077-4214-2018-4-2-147-313-319 УДК 618.19-006.04/.44:611.018 Айкян А. З., Кайдашев I. П.
К1ЛЬК1СНА ХАРАКТЕРИСТИКА CD68+ ТА CD163+ МАКРОФАГ1В В ПЕРВИННОМУ ВОГНИЩ1 ТА В МЕТАСТАТИЧНИХ УРАЖЕННЯХ РЕПОНАРНИХ Л1МФОВУЗЛ1В ПРИ ПОТР1ЙНО-НЕГАТИВН1Й 1НВАЗИВН1Й КАРЦИНОМ1 ГРУДНОТ ЗАЛОЗИ УкраТнська медична стоматологiчна академiя (м. Полтава)
Зв'язок nублiкацГí з плановими науково-дослщ-ними роботами. Робота являеться фрагментом на-уково-дослщноТ роботи НД1 Г1ОРПФ «Комплексне дослщження патогенетичноТ ролi субпопуляцiй М1 та М2 макрофагiв в розвитку хрошчного обструктив-ного захворювання легень для розробки та обг"рунту-вання персоналiзованоТ терапи з врахуванням маси тта» (№ державноТ реестраци 0117и005252).
Вступ. Тричi-негативна пiдгрупа раку грудноТ зало-зи (ТНРГЗ) (естроген-, прогестерон- i HER2-рецентор негативний) часто вражае молодших жiнок i звичай-но мае прший прогноз, порiвняно з шшими типами РГЗ. Нещодавно, комплексна роль iмунноТ системи у ростi, елiмiнацiТ i метастазуваннi постала як об'ект тдвищеноТ уваги, обiцяючи забезпечити клЫчними прогностичними маркерами прогресування, а також мiшенями для терапи широкого спектру пухлин, у т.ч. i ТНРГЗ. Недавнiй огляд [1] показав, що не дивлячись на iнтенсивне вивчення лейкоцилв, якi iнфiльтрують пухлину, та Тх пiдгруп (CD8+ i регуляторних Т-клп"ин), жоден з цих показнишв не пристосований до рутин-ноТ клЫчноТ практики, хоча ТНРГЗ вiдрiзняеться вiд iнших типiв РГЗ, зокрема, клп"инним складом iмунно-го шфтьтрату з прогностичною достовiрнiстю.
При РГЗ i у цiлому, i при ТНРГЗ зокрема, пухли-на-асоцiйованi макрофаги (ПАМ) головним чином пов'язаш iз гiршим прогнозом, але Тх склад, очевидно, рiзниться мiж шдивщуальними ТНРГЗ [1].
Отже, дослiдження ПАМ при ТНРГЗ е актуальни-ми, тому метою роботи стало дослщження кшьшс-них показникiв, особливостей локалiзацiТ CD68+ I CD163+М2-подiбних ПАМ, як iнфiльтрують ТНРГЗ у первинному вогнищi без метастазiв i у парних зраз-ках з метастазами у лiмфовузли, а також патоморфо-лопчних характеристик цього типу РГЗ для встанов-лення Тх внеску у метастазування.
Об'ект i методи дослiдження. Бiоптати та кли нiчнi дан були отриманi вiд пацiентiв, як проходили лiкування в Полтавському обласному ключному диспансерi. Дослiдження було схвалено комiсiею з етики УМСА.
Матерiалом дослiдження були штраоперацш-ш тканини пухлин та iпсiлатеральних лiмфовузлiв при радикальному видаленi молочних залоз без неоад'ювантного лiкування.
lмуногiстохiмiчнi (1ГХ) характеристики видалених пухлин (HER2, ER, PR, Кi67) використовували для ви-дiлення групи ТНРГЗ.
За даними метааналiзу [2] використання CD68 як бюмаркеру ПАМ для 1ГХ оцшки мае прiоритети, по-рiвняно з окремим визначенням CD163 або CD206.
Проаналiзовано 2 пiдгрупи ТНРГЗ, врiвноважених за N0/1 статусом, по 3 зразки у кожнш, i вщповщно 3 зразки MeTacTa3iB у лiмфовузли. Середнiй BiK паци енток становив 64 роки, вщ 52 до 76. Первинно-ме-тастатичний РГЗ спостеркався у вciх пацieнток 2Т, N1 групи. Морфолопчш та 1ГХ заключення були отрима-нi згiдно критерпв визначення молекулярно-бюло-гiчного пiдтипу.
1ГХ доcлiдження по визначенню ПАМ i М2-подiбних макрофагiв проводили за допомогою стрептавщин-пероксидазного методу. Парафiновi зрiзи, товщиною 5 мкм, отриманi за стандартною техшкою автоматизованого циклу патолого-анато-мiчноТ лаборатори, депарафiнували, дегiдратували, вщновлювали антигени у цитратному буферi (рН 6,0) у мтроволновш печi (при потужност =600 Вт, 3 цикли по 7 хв. з перервою 1 хв.), охолоджували 20 хв., вiдмивали у диcтводi та фосфатно-сольовому бу-ферi (ФСБ, рН 7,2-7,4) по 2 хв., блокували ендоген-ну пероксидазу реактивом з набору PolyVue HRP/ DAB Detection System (For Mouse & Rabbit Primary Antibodies, Diagnostic BioSystems, USA), вщмивали у ФСБ, 3 хв. ^сля чого зрiзи iнкубували при температу-рi 4°С протягом ночi з мишиними моноклональними антитiлами анти-CD68 (клон PG-M1, REF PD M065-S, Diagnostic BioSystems, USA) i анти-CD163 (клон 10D6, REF Mob460-01, у розведенш 1:100 у буферi для роз-ведення антитiл для 1ГХ-методики (Antibody Diluent, Dako, USA). Далi зрiзи обробляли у два кроки Mouse/ Rabbit PolyVue™ HRP/DAB Detection System (Diagnostic BioSystems, USA), детекторною системою з вiзуалiза-щею реакцп хромогеном ДАБ, дозабарвлювали ядра гематоксилшом Майера i заключали пiд покрiвне скло у кедровий бальзам. Буфер Antibody Diluent за-мicть первинних антитт використовували як негативний контроль, тканини лiмфовузлiв - як позитивний.
Оцшку iмуногicтохiмiчного забарвлення проводили шляхом шдрахунку CD68+nAM i CD163+M2-подiбних ПАМ пiд cвiтловим мтроскопом (Бiолам, ЛОМО, Роciя: об'ектив х40, окуляр х7) у 7-10-ти полях зору штенсивноТ 1ГХ-реакцп кожного зрiзу, обчислю-ючи середньоарифметичне, в межах пухлинних гшзд та пухлинноТ строми. У пщрахунок включали iмуно-позитивш клiтини з морфологiею макрофагiв. Мтро-фотографп отримували за допомогою мтроскопу Leica DM500, Leica, Нiмеччина, (об'ектив х4, 40).
Статистичний аналiз проводили за допомогою програми GraphPad Prism 5 з використанням непара-метричних, параметричних i cимуляцiйних методiв.
Результати дослщження та Тх обговорення. До-cлiдження органiзоване як описове патоморфо-
Таблиця 1. ступеню диференщювання, морфолопч-
Кiлькiснi характеристики пухлинно-асоцiйованих макрофагiв при тричинегативному раку грудноТ залози (середня кiлькiсть на поле зору великого збГльшення)
Перша група, N0 Друга група, N1 Метастази у л1мфовузли
CD68+nAM CD163+M2 CD68+nAM CD163M2 CD68+nAM CD163+M2
12,5 5,1 23,5 5,1 24,6 17,0
11,4 6,0 22,3 5,1 9,4 6,8
12,5 1,0 26,6 6,4 19,0 9,5
логiчне порiвняння мiж двома групами: N0 та N1, тричинегативного РГЗ, порiвняння кiлькiсних характеристик CD68+ i CD163+М2-подiбноУ фракци ПАМ, а також для перевiрки можливих кореляцмних вщно-син мiж шльшсними характеристиками макрофагiв у первиннiй пухлиш та у вiдповiдному метастазi в тси-латеральнi пахвовi лiмфовузли.
СD68 - маркерний протеУн ПАМ, i е загальним для всiх макрофапв маркер, який широко викорис-товують як прогностичний при багатьох пухлинах [3]. У дослщженш його використано з метою виявлення загальноУ популяцп ПАМ у бiоптатах РГЗ та метаста-тичних лiмфовузлiв. СD163 вважаеться маркером пропухлинних М2-подiбних макрофагiв [4], вщповщ-но його теж було використано.
Ктьшсш показники двох груп та метао^в подано у табл. 1.
Патоморфолопчна характеристика першоУ групи. Групу склали зразок швазивноУ протоковоУ карцино-ми ГЗ переважно трабекулярноУ будови, та 2 зраз-ки - солщноУ будови, як рiзнилися мiж собою G2-3 ступенями диференцювання, перший зразок мав ознаки лiмфовaскулярноУ iнвазiУ, третiй зразок харак-теризувався надзвичайно маленькими пухлинними гшздами, якi нагадують численнi емболи, як при запальному РГЗ. Дещо стльними описовими характеристиками для зразшв, окрiм ER- PR- HER2-, була строма з масивними фiбротичними змiнами, часом з крововиливами, ознаками некрозу у тш чи шшш мiрi, та виразною лiмфоплазмоцитарною Ыфтьтра-цiею.
СD68+ПАМ щiльно i рiзко нерiвномiрно розподн лялися на препаратах вах зрaзкiв, утворювали власн1 осередки у стром^ гнiздaх, та дтянках некрозу, де набували незвичайноУ зливноУ та/або вaкуолiзовaноУ форми (рис. 1). Особливий вигляд iмунопозитивних ПАМ може вщображати Ух надзвичайну aктивнiсть. У стромальних вщдтах ПАМ мали переважно видо-вжену форму.
СD163+М2-подiбних макрофапв на препаратах було помггно менше нiж СD68+ (рис. 2). Вщзначена Ух регулярна локaлiзaцiя у фiбрознiй стромi, навко-ло гнiзд серед лiмфоУдного iнфiльтрaту, у пухлинних гшздах та вогнищах некрозу.
Отже, СD163+М2 наближено повторювали чи-сельнiсть CD68+ПАМ у фiбрознiй стромi, а у гшздах i некротичних дiлянкaх були присутш у меншiй шль-косп, особливо на третьому препaрaтi, де Ух шльшсть обчислена як поодинок (0-1) на поле зору.
Патоморфолопчна характеристика другоУ групи. Групу склали 3 зразки швазивних протокових карцином солщноУ i солщно-альвеолярноУ морфологи, i 3 зразки вщповщних метaстaзiв у регiонaльнi, iпсилaтерaльнi, лiмфовузли. Зразки описaнi як G3
но та 1ГХ однорiднi (ER- PR- HER2- Ki67+) з обов'язковою присутшстю осередкiв некрозу, фiброзною та фiброзно-жировою стромою i щiльною лiмфоУдною Ыфтьтра-цiею.
На всiх препаратах вщзначено високу щiльнiсть шфтьтрацп CD68+ПАМ (рис. 3), якi розмiщувaлися нерiвномiрно та утворювали скупчення у виглядi незвичайних круп-них зливних форм у гшздах, на межi з жировою тканиною, та в осередках некрозу. CD163+М2 макрофаги було помггно менше, спiвлокaлiзувaлися з CD68+ПАМ переважно у стромi (рис. 4) й осередках некрозу.
Патоморфолопчна характеристика метао^в у лiмфовузлaх. Метастази були представлен великими округлими свтлими атиповими ядрами, нiжною або помiрно розвиненою стромою, яку iз рiзною щiльнiстю iнфiльтрувaли лiмфоцити. 2 з 3х зрaзкiв мали частково пстолопчно збережену тканину лiм-фовузлiв. На всiх препаратах зaреестровaнi ознаки некрозу.
Рис. 1. lмуноriстохiмiчне виявлення ПАМ (С068+) у бiоптатi ТНРГЗ N0. ПАМ надзвичайноТ зливноТформи з вакуолiзацiею (1) серед кластеру пухлинних кл^ин поблизу некротичноТ дiлянки (2). Контрастування гематоксилш Майера, об.х40.
Рис. 2. 1мунопстох^чне виявлення М2 (CD163+) у бюптат ТНРГЗ N0. Клiтини розмщеш у стром (стрiлки). Контрастування гематоксилш Майера, об.х40.
СЭ68+ ПАМ щ1льно I нер1вном1рно шфтьтрува-ли метастази. Зосереджувалися у стром1 I в межах численних, некротично-змшених гн1зд. Найщ1льн1ш1 зосередження вщм1чен1 у зонах некрозу, на меж1 з л1мфатичною тканиною, або в синусах уздовж яких просуваеться пухлинний р1ст.
СЭ163+ М2 розм1щувалися у стром1 I гшздах, маючи видовжену форму, приблизно р1вном1рно, на пом1тно нижчому р1вн1, та, на третьому препарат!, нер1вном1рно, досягаючи в скупченнях - у зонах некрозу, - тих самих к1льк1сних показник1в, що I СЭ68+ ПАМ.
Отже, патоморфолопя метастаз1в в1др1знялася в1д первинного вогнища РГЗ I м1ж собою, сптьною озна-кою була обов'язкова присутшсть д1лянок некрозу в метастазах. ПАМ по р1зному 1нф1льтрували метастази, р1вень СЭ163+ М2 ор1ентовно зб1льшувався у метастазах, пор1вняно з первинним вогнищем.
Статистична обробка середшх показник1в к1ль-кост1 СЭ68+ПАМ I СЭ163+М2-под1бних макрофаг1в непараметричними методами (Манна-У1тн1 - для незалежних I Вткоксона, для парних перем1нних) м1ж двома групами, м1ж к1лькостями макрофапв у первинному вогнищ1 I парних метастазах не показало достов1рносп. Також, непараметрична кореляц1я Сп1рмена не показала достов1рних зв'язк1в м1ж кть-костями макрофаг1в у первинних вогнищах I метастазах. Тож для швелювання малоТ к1лькост1 пац1енток у групах, наступним кроком ми провели пор1вняння вс1еТ сукупност1 цифрових результат1в, п1драхованих по кожному полю зору високого розршення (в1д 7 до 10 на препарат). Встановлено достов1рне збтьшення к1лькост1 СЭ68+ПАМ та СЭ163+М2 в осередку РГЗ у грут з метастазами, зменшення СЭ68+ПАМ у метастазах, пор1вняно з первинним вогнищем та зворотн1 кореляц1йн1 вщношення м1ж СЭ163+М2 в первинних вогнищах I метастазах (табл. 2).
Наступним кроком ми вдалися до емтрично'Т оцшки через сер1ю комп'ютерних симуляцм, як1 за-безпечують наближення до справжнього розподту, який лежить в основ1 статистики. Результати пщ-твердили достов1рн1сть попередн1х результат1в (об-числення даних з ус1х пол1в зору, табл. 2), а також додали достов1рност1 у збтьшення чисельност СЭ163+М2 у метастазах, пор1вняно з первинним РГЗ, й перетворили зворотнм кореляцмний зв'язок м1ж к1льк1сними показниками СЭ163+М2 у первинних РГЗ та метастазах, на прямий (табл. 3).
Нами використано пщхщ дослщження у малих групах хворих вузького профтю, маючи за мету максимально персонал1зувати результати у межах 1ГХ пщтипу ГРЗ - тричинегативно-му РГЗ. 1ндивщуальне тлумачення результат1в досл1дження е актуальним I сучасним питан-ням, особливо в онкологи. Кр1м того, склад пщтитв макрофаг1в, як припускаеться, вщр1з-няеться при ТНРГЗ вщ 1нших РГЗ. Стюарт та ¡н. (2012) показали, що базально-под1бн1 кл1тини РГЗ мають б1льшу здатн1сть, шж менш агресив-ний тип РГЗ, стимулювати диференц1ювання макрофаг1в у кл1тинних культурах та 1ндукують поляризац1ю фенотитв М1 та М2, створюючи популяц1ю макрофаг1в, в1дм1нних в1д популя-цп, утвореноТ п1д впливом кл1тин РГЗ менш
Рис. 3. lMyHoricToxiMi4He виявлення ПАМ (CD68+) у 6ionTaTi ТНРГЗ N1. Щшьна iнфiльтрацiя CD68+nAM. Контрастування -гематоксилш Майера, об.х4.
Рис. 4. lмуногiстохiмiчне виявлення М2 (СР163+) у бiоптатi ТНРГЗ N1. М2 округлоТ форми з розгалуженнями цитоплазми (стрiлки), розмiщенi у стромi. Контрастування - гематоксилш Майера, об.х40.
агресивного типу [5]. Тому важливо анал1зувати цей 1ГХ-тип РГЗ окремо.
В обговорены I пщсумках ми базувалися на результатах статобробки первинних результат1в з кожного поля зору, як1 пщтвердили емп1ричною оцшкою статистичного моделювання. При ТНРГЗ ми встано-вили достов1рне зб1льшення ктькосп СЭ68+ПАМ та СЭ163+М2 в бюптатах РГЗ за умов метастазування у регюнальш л1мфовузли, що узгоджуеться з результа-
Таблиця 2.
Пщсумки статистичноТ обробки повного цифрового масиву результалв дослiдження
Показники як пор1внюють Результат та достовiрнiсть Статистичний метод
СЭ68+ПАМ у межах РГЗ групи N1 пор1вняно з групою N0 Збтьшення*, р<0,0001 Манна-У^ш
СЭ163+М2 у межах РГЗ групи N1 пор1вняно з групою N0 Збтьшення*, р<0,0005
СЭ68+ПАМ у метастазах, по-р1вняно з первинними РГЗ Зменшення*, р=0,0473 Парний метод Вiлкоксона
СЭ163+М2 у метастазах, пор1в-няно з первинними РГЗ Недостовiрнi змiни, р=0,2961
Кореляц1я м1ж к1лькостями СЭ68+ПАМ у первинних РГЗ 1 метастазах Недостовiрна, р=0,375, r=0,204 Кореляцiя Стрмена
Кореляц1я м1ж к1лькостями СЭ163+ПАМ у первинних РГЗ 1 метастазах Зворотна*, помiрна, p=0,0024, r=-0,627
Таблиця 3.
Результати емшрично! оцiнки статистично-симульованих даних
Показники як1 пор1внюють Достов1рн1сть Статистичний метод Сила ефекту (95% дов1рчий 1нтервал)
СD68+ПАМ ГРЗ групи N1 пор1вня-но з N0 Зб1льшення*, р<0,0001 Т-тест -12,4 - (-11,59)
СD163+М2 РГЗ групи N1 пор1вняно з N0 Зб1льшення*, р<0,0001 -2,21 - (-1,24)
СD68+ПАМ у метастазах, пор1вня-но з первинними вогнищами РГЗ Зменшення*, р<0,0001 Парний Т-тест 5,328 - 7,916
СD163+М2 у метастазах, пор1вня-но з первинними вогнищами РГЗ Зб1льшення*, р<0,0001 -6,517 - (-4,516)
Кореляц1я м1ж к1лькостями СD68+ПАМ у первинних вогнищах РГЗ 1 метастазах Недостов1р-на, р=0,086, r=0,17 Кореляц1я П1рсона -0,03 - 0,36
Кореляц1я м1ж к1лькостями СD163+ПАМ у РГЗ 1 метастазах Достов1рна*, пряма, слабка, р=0,019, r=0,23 0,039 - 0,412
тами досл1джень цього напрямку 1з 61льшим числом учаснишв, I п1дтверджуе роль ПАМ, зокрема Ух шд-розд1лу - М2-под1бних макрофапв, як сприятливих для розвитку пухлини [6]. Несприятливий прогноз при ТНРГЗ пов'язаний з високою щмьшстю шфшь-трацп ПАМ [7], та з вищим ризиком дистантних мета-стаз1в [8]. Отже, вс1 разом ц1 дан1 пщтверджують, що пщвищення чисельност1 CD68+ПАМ, як м1н1мум за рахунок CD163+М2-фрaкцN, сприяе метастазуванню ТНГРЗ.
Анaлiз локaлiзaцií визначив поеднане розмЦен-ня СD68+ПАМ i СD163+М2 у фiбрознiй стромi i не-кротичних дтянках. Вщповщно, у гнiздaх розмЦу-валися переважно М1-подiбнi ПАМ. У першш групi, N0, схоже, саме ц клiтини утворювали влaснi осе-редки у гнiздaх (враховуючи, що на одному iз зрaзкiв СD163+М2 були лише поодинокi), i набували злив-ноУ та/або вaкуолiзовaноУ форми (рис. 1), що може вщображати Ух фагоцитарну актившсть. Анaлогiчнa картина вiдмiченa i при N1 ТНРГЗ, у 2й групi. Контакт пухлинних клп"ин з макрофагами сприяе швазп: як показано, цi клiтини мiгрують разом, уздовж волокон матриксу, i iнтрaвaзують також разом, що доводить поеднання ендотелiоцитa, макрофага i пухлинноУ клiтини [9]. Пiдхiд функцюнальноУ морфологи дозво-ляе припустити, що саме М1-подiбнi ПАМ нaйбiльше контактують з пухлинними гшздами, що ми вважае-мо передумовами просування, або метастазування пухлини у первинному вогнищi, хоча у якост про-гностичного, Ух значення ще необхiдно прояснити.
.Жмфатичш метастази можуть бути переважним способом поширення для РГЗ, а лiмфaтичнi шляхи е не лише пасивними мапстралями, але i полегшують активний вiдбiр пухлинних клiтин до мкцевих та дис-тальних лiмфaтичних вузлiв за допомогою сигнaлiзa-цп CCL21-CCR7; сприяють виживанню метастазуючих ракових стовбурних клiтин за рахунок сигнaлiзaцiУ CXCL12-CXCR4, та змiнюють запальну вiдповiдь господаря, яка порушуе iмунний нагляд за пухлиною [10]. Порiвняно з первинним вогнищем, у вщповщ-них метастазах ми виявили доах^рш зменшення ктьшсних покaзникiв СD68+ПАМ, та кореляцшш спiввiдношення кiлькостей CD163+М2. lншi автори встановили, що у лiмфовузлaх з метастазами РГЗ вза-гaлi чисельшсть ПАМ знижуеться, порiвняно з парни-
ми лiмфовузлaми без метаста-зiв, що може пiдтверджувaти взаемозв'язок ктьмсних характеристик ПАМ з метастазуван-ням, але припускае iншу роль ПАМ у самих метастазах [11]. В основi кореляци може лежати сумкна мiгрaцiя пухлинних кли тин i мaкрофaгiв [9].
У лiмфовузлaх з метастазами ми вiдзнaчили досить точну, у т.ч. i в кiлькiсному вщношен-нi, спiвлокaлiзaцiю CD68+ПАМ i CD163+М2 у зонах некрозу. В шших вiддiлaх масивного представництва CD68+ПАМ: пухлиннiй стромi, гнiздaх, та на межi iз залишками лiмфaтичноУ тканини, CD163+М2 було рiзко менше. Це означае, по перифе-рп метастазу зосереджуються М1-подiбнi макрофаги, вони ж переважають у стром1 i гнiздaх, а в некротичних дiлянкaх - баланс змще-ний в бт М2-подiбних. Не виключено, що в лiмфо-вузлах функцiя М1 ПАМ (фагоцитоз та антигенпре-зентащя) пригнiченi, цьому не заперечуе Ух кшьмсне зменшення порiвняно з первинним вогнищем i при-пущення шших aвторiв [11]. Серед виявлених нами CD163+М2-подiбних мaкрофaгiв у метастазах можли-во домiнувaли проaнгiогеннi TIE2+/CD31+ макрофаги, як це дослщили [12], з пропухлинним потенщалом. Всi разом, ц дaнi вкладаються у загальноприйняту думку, що М1 ПАМ мають антипухлинний потенщал, а М2 - пропухлинний, що ми спостеркали у метаста-тичних лiмфовузлaх.
Пaтоморфологiчно, зразки РГЗ мали своУ ушкаль-нi особливост тaкi як протяжнiсть строми, щтьшсть представництва у нiй резидентних непухлинних та шфшьтруючих клiтин, а також деяк риси морфоло-г1Т пухлинних кл^ин, якi не обчислювали ктьтсно, внaслiдок обмеженого числа учасниць дослщжен-ня. Достовiрнi вiдмiнностi перерахованих патомор-фологiчних характеристик дослiджувaлися i рашше [13]. Спiльнi описовi характеристики включали дес-мопластичну реaкцiю, виразну запальну реак^ю (у виглядi щiльноУ лiмфоплaзмоцитaрноУ iнфiльтрaцiУ) та ознаки некрозу у тш чи iншiй мiрi. Також, ва зразки метaстaзiв характеризувалися обов'язковою при-сутнiстю дiлянок некрозу. Нещодавнш iмпозaнтний огляд лiтерaтури розглядае масову шфшьтра^ю та вловлювання ПАМ у ппоксичш/некротичш област1 пухлин, через ряд хемокЫв (CCL2, CCL5, VEGF, CSF-1, семафорин 3А (SEMA3A), ендотелш, еотаксин та он-костатин М), з наступними пропухлинними функ^я-ми через фактор транскрипцГУ HIF1a, який викликае експреаю великого набору гешв, пов'язаних з aнгi-огенезом, такими як VEGF [14], що передбачае М2-подiбну поляризaцiю. З шшого боку, експеримен-тальне дослiдження карциноми легень на моделi у мишей по збшьшенню оксигенацГУ пухлини, не зми нювало у нiй ш кiлькостi, нi спiввiдношення М1/М2, але специфiчно знижувало експресiю генiв, чутливих до ппокаУ та aнгiогенну актившсть М2 ПАМ (МН^П (1о). [15]. Це пояснюе нaшi знaхiдки при опиа локaлi-зацГУ CD68+ПАМ i спiвлокaлiзaцiУ з ними CD163+М2-
подiбних мaкрофaгiв у гiстологiчно-вiзуaлiзовaних зонах некрозу, де прослщковуеться присутнiсть i М1, i М2-подiбних ПАМ.
Одне з головних спостережень дослщження -частина гнiзд/пухлинних комплексiв у первинних вогнищах ТНРГЗ i метастазах були шфшьтроваш скупченнями тiльки CD68+ПАМ (ям не повторювали CD163+М2) а отже були М1-подiбними макрофагами (рис. 1), разом iз збiльшенням чисельност обох фрaкцiй мaкрофaгiв при метастазах, це може свщ-чити що саме iз збiльшенням не ттьки М2, але i М1 макрофапв пов'язaнi первинно пропухлиннi ефекти.
Отримаш результати не надають точнi кшьшсш ди aгностичнi або прогностичнi показники ПАМ М1- чи М2 типу для використання у кл^чнш практик, хоча Ух значення i ктьмсш коливання достовiрнi, але до-повнюють вщомосп щодо патогенетичного внеску. Недавш дослiдження iз створенням комп'ютерноУ обчислювальноУ моделi ТНРГЗ [16] продемонструва-ли, що вщносно мала кiлькiсть макрофапв (щоправ-да без розподiлу на М1/М2) посилюе рiст пухлини [17,18], а велика - може нав^ь гальмувати. Ц дан1 додатково ставлять запитання про кiлькiснi характеристики субтитв ПАМ вцiлому при РГЗ.
Висновки
1. Пщвищення рiвня шфтьтраци первинного вог-нища ТНГРЗ CD68+ПАМ та CD163+М2-подiбними макрофагами достовiрно пов'язане з метастазуванням. Припускаеться, що саме М1-подiбнa субпопуляцiя
ПАМ найбшьше контактуе з пухлинними гнiздaми при ТНРГЗ, що може бути передумовами поширення пухлини, або метастазування.
2. 1з збтьшенням не тiльки М2, але i М1 макрофапв можуть бути пов'язaнi первинно прометастатичн1 ефекти ТНРГЗ.
3. У метастатичних лiмфовузлaх кшьмсть СD68+ПАМ була достовiрно менше, порiвняно з пер-винним ТНРГЗ, а ктьшсш показники CD163+М2 ко-релювали. Разом з локaлiзaцiею i спiвлокaлiзaцiею CD68+ i CD163+М2-подiбних ПАМ, отримаш результати вкладаються у загальноприйняту парадигму, що М1 ПАМ мають антипухлинний але знижений потен-щал, а М2 - пропухлинний, але це показано для ме-таа^в у репональних лiмфовузлaх при первинно-метастатичному ТНРГЗ.
4. Точнi ктьмсш показники ПАМ для використання у кл^чнш прaктицi не розроблеш, хоч Ух патоге-нетичне значення i кiлькiснi коливання достовiрнi вщповщно до метастазування та iнших клЫчних даних ТНРГЗ.
Перспективи подальших дослщжень. Розробити застосування в клiнiчнiй прaктицi кiлькiсних показ-никiв ПАМ як показник прогнозу захворювання раку молочноУ залози.
Подяка. Автори висловлюють подяку к.б.н. Ма-монтовш Т.В. за техшчну допомогу в проведеннi iму-ногiстохiмiчного дослiдження.
flrrepaTypa
1. Stovgaard ES, Nielsen D, Hogdall E, Balslev E. Triple negative breast cancer - prognostic role of immune-related factors: a systematic review. Acta Oncol. 2018 Jan;57(1):74-82. DOI: 10.1080/0284186X.2017.1400180. Epub 2017 Nov 23.
2. Zhao X, Qu J, Sun Y, Wang J, Liu X, Wang F, et al. Prognostic significance of tumor-associated macrophages in breast cancer: a meta-analysis of the literature. Oncotarget. 2017 May 2;8(18):30576-86. DOI: 10.18632/oncotarget.15736
3. Ruffell B, Au A, Rugo HS, Esserman LJ, Hwang ES, Coussens LM. Leukocyte composition of human breast cancer. Proc Natl Acad Sci USA. 2012;109:2796-801. [PMC free article] [PubMed].
4. Yoshihiro Komohara, Koji Ohnishi. Possible functions of CD169-positive sinus macrophages in lymph nodes in anti-tumor immune responses. Motohiro Takeya Cancer Sci. 2017 Mar;108(3):290-5. Published online 2017 Mar 7. DOI: 10.1111/cas.13137
5. Stewart DA, Yang Y, Makowski L. Basal-like breast cancer cells induce phenotypic and genomic changes in macrophages. Mol Cancer Res. 2012;10:727-38.
6. Yang M, Li Z, Ren M, Li S, Zhang L, Zhang X, et al. Stromal Infiltration of Tumor-Associated Macrophages Conferring Poor Prognosis of Patients with Basal-Like Breast Carcinoma. J Cancer. 2018 Jun 6;9(13):2308-16. DOI: 10.7150/jca.25155. eCollection 2018.
7. Yang M, Ma B, Shao H, Clark AM, Wells A. Macrophage phenotypic subtypes diametrically regulate epithelial-mesenchymal plasticity in breast cancer cells. MC Cancer. 2016 Jul 7;16:419. DOI: 10.1186/s12885-016-2411-1.
8. Klingen TA, Chen Y, Aas H, Wik E, Akslen LA. Tumor-associated macrophages are strongly related to vascular invasion, non-luminal subtypes, and interval breast cancer. Hum Pathol. 2017 Nov;69:72-80. DOI: 10.1016/j.humpath.2017.09.001. Epub 2017 Sep 18
9. Chen H, Chen X, Lin H. Expression of Tumor-Related Macrophages and Cytokines After Surgery of Triple-Negative Breast Cancer Patients and its Implications. Wang J, Med Sci Monit. 2016 Jan 11;22:115-20.
10. Yuan ZY, Luo RZ, Peng RJ, Wang SS, Xue C. High infiltration of tumor-associated macrophages in triple-negative breast cancer is associated with a higher risk of distant metastasis. Onco Targets Ther. 2014 Aug 21;7:1475-80. DOI: 10.2147/OTT.S61838. e Collection 2014
11. Harney AS, Arwert EN, Entenberg D, Wang Y, Guo P, Qjan BZ, et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA. Cancer Discov. 2015 Sep;5(9):932-43. DOI: 10.1158/2159-8290. CD-15-0012. Epub 2015 Aug 12.
12. Chitty JL, Filipe EC, Lucas MC, Herrmann D, Cox TR, Timpson P. Recent advances in understanding the complexities of metastasis. F1000Research. 2018;7:F1000 Faculty Rev-1169. DOI: 10.12688/f1000research.15064.1
13. Ju Yang, Xiaojing Li, Xiuping Liu, Yongjuan Liu. The role of tumor-associated macrophages in breast carcinoma invasion and metastasis. Int J Clin Exp Pathol. 2015;8(6):6656-64.
14. Kim O-H, Kang G-H, Noh H. Proangiogenic TIE2+/CD31+ Macrophages Are the Predominant Population of Tumor-Associated Macrophages Infiltrating Metastatic Lymph Nodes. Molecules and Cells. 2013;36(5):432-8. DOI: 10.1007/s10059-013-0194-7
15. Heba Sailem, Faraz K. Mardakheh, Mar Arias Garcia, Christopher J. Tape, Mitch Dowsett. A Histology-Genomic Integration Analysis Rachael Natrajan, Microenvironmental Heterogeneity Parallels Breast Cancer Progression. PLoS Med. 2016 Feb;13(2):e1001961. Published online 2016 Feb 16. DOI: 10.1371/journal.pmed.1001961 PMCID: PMC4755617 PMID: 26881778
16. Aras S, Zaidi MR. TAMeless traitors: macrophages in cancer progression and metastasis. British Journal of Cancer. 2017;117(11):1583-91. DOI: 10.1038/bjc.2017.356
17. Laoui D, Van Overmeire E, Di Conza G, Aldeni C, Keirsse J, Morias Y, et al. Tumor hypoxia does not drive differentiation of tumor-associated macrophages but rather fine-tunes the M2-like macrophage population. Cancer Res. 2014 Jan 1;74(1):24-30. DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-13-1196. Epub 2013 Nov 12.
18. Norton KA, Jin K, Popel AS. Modeling trip, fibroblasts and tumor vasculature. J Theor Biol. 2018 Sep 7;452:56-68. DOI: 10.1016/j. jtbi.2018.05.003. Epub 2018 May 8.
К1ЛЬК1СНА ХАРАКТЕРИСТИКА CD68+ ТА CD163+ МАКРОФАГ1В В ПЕРВИННОМУ ВОГНИЩ1 ТА В МЕТАСТА-ТИЧНИХ УРАЖЕННЯХ РЕГЮНАРНИХ Л1МФОВУЗЛ1В ПРИ ПОТР1ЙНО-НЕГАТИВН1Й 1НВАЗИВН1Й КАРЦИНОМ1 ГРУДНОТ ЗАЛОЗИ
Айкян А. З., Кайдашев I. П.
Резюме. Особливостi локалiзацií ПАМ у вiддiлах РГЗ, та Тх щiльнiсть пов'язанi з iмуногiстохiмiчними характеристиками пухлин, Тх злояшсним фенотипом та прогнозом. Тричинегативна пiдгрупа раку грудноТ залози (ТНРГЗ) часто вражае молодших жiнок i звичайно мае гiрший прогноз, порiвняно з iншими типами РГЗ. Наше дослщження органiзоване як описове патоморфолопчне порiвняння мiж двома групами: N0 та N1, тричине-гативного РГЗ, порiвняння кiлькiсних характеристик CD68+ i CD163+М2-подiбноí фракцп ПАМ, а також для пе-ревiрки можливих кореляцшних вiдносин мiж кiлькiсними характеристиками макрофапв у первиннiй пухлин1 та у вщповщному метастазi в iпсилатеральнi пахвовi лiмфовузли. При ТНРГЗ ми встановили дослодрне збшь-шення кiлькостi CD68+nAM та CD163+M2 в бiоптатах РГЗ за умов метастазування у регюнальш лiмфовузли, що узгоджуеться з результатами дослщжень цього напрямку iз бтьшим числом учасникiв, i пiдтверджуе роль ПАМ, зокрема Тх шдроздту - М2-подiбних макрофагiв, як сприятливих для розвитку пухлини. Несприятливий прогноз при ТНРГЗ пов'язаний з високою щтьшстю шфшьтрацп ПАМ, та з вищим ризиком дистантних мета-стазiв. Отже, вс разом цi данi пщтверджують, що пiдвищення чисельностi CD68+ПАМ, як мЫмум за рахунок CD163+М2-фракцií, сприяе метастазуванню ТНГРЗ.
Ключовi слова: пухлинно-асоцшоваш макрофаги, iмуногiстохiмiчнi дослiдження, CD68+ i CD163+, тричи негативна пiдгрупа, рак грудноТ залози.
КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА CD68+ И CD163+ МАКРОФАГОВ В ПЕРВИЧНОМ ОЧАГЕ И В МЕТАСТАТИЧЕСКИХ ПОРАЖЕНИЯХ РЕГИОНАРНЫХ ЛИМФОУЗЛОВ ПРИ ВТРОЙНЕ ОТРИЦАТЕЛЬНОЙ ИНВАЗИВНОЙ КАРЦИНОМЕ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
Айкян А. З., Кайдашев И. П.
Резюме. Особенности локализации ПАМ в отделах РГЖ, и их плотность связанные с иммуногистохими-ческими характеристиками опухолей, их злокачественным фенотипом и прогнозом. Трижды-отрицательная подгруппа рака грудной железы (ТОРГЖ) часто поражает молодых женщин и обычно имеет худший прогноз по сравнению с другими типами РГЖ. Наше исследование организовано как описательное патоморфологи-ческое сравнение между двумя группами: N0 и N1, трижды-негативного РГЖ, сравнение количественных характеристик CD68+ и CD163+ М2-образной фракции ПАМ, а также для проверки возможных корреляционных отношений между количественными характеристиками макрофагов в первичной опухоли и в соответствующем метастазе в ипсилатеральные подмышечные лимфоузлы. При ТОРГЖ мы установили достоверное увеличение количества CD68 + ПАМ и CD163 + М2 в биоптатах РГЗ в условиях метастазирования в региональные лимфоузлы, что согласуется с результатами исследований этого направления с большим числом участников, и подтверждает роль ПАМ, в частности их подразделения - М2-подобных макрофагов, как благоприятных для развития опухоли. Неблагоприятный прогноз при ТНРГЖ связан с высокой плотностью инфильтрации ПАМ, и с высоким риском дистантных метастазов. Итак, все вместе эти данные подтверждают, что увеличение численности CD68 + ПАМ, как минимум за счет CD163 + М2-фракции, способствует метастазированию ТНГРЗ.
Ключевые слова: опухоль-ассоциированные макрофаги, иммуногистохимические исследования, CD68+ и CD163+, трижды-отрицательная подгруппа, рак грудной железы.
QUANTITATIVE CHARACTERISTICS OF CD68+ AND CD163+ MACROPHAGES IN THE PRIMARY FOCUS AND IN METASTATIC LESIONS OF REGIONAL LYMPH NODES IN TRIPLE-NEGATIVE INVASIVE BREAST CARCINOMA
Aikian A. Z., Kaidashev I. P.
Abstract. The triple-negative subgroup of breast cancer (TNBC) (estrogen, progesterone-, and HER2-receptor negatives) often affects young women and usually has a worse prognosis as compared to other types of BC. Recently, a complex role of the immune system in the growth, elimination and metastasis became an object of increased attention, promising to provide clinical prognostic markers of progression, as well as targets for the treatment of a wide range of tumors, including TNBC. In BC in general and in TNBC in particular, tumor-associated macrophages (TAM) are mainly associated with a worse prognosis, but their composition, apparently, varies between individual cases of TNBC. Thus, the research of TAM in TNBC is relevant, and therefore the aim of this study was to examine the quantitative parameters and features of localization of CD68+ and CD163+M2-like TAMs, which infiltrate TNBC in the primary focus without metastases and in paired samples with metastases in the lymph nodes, as well as the pathomorphological characteristics of this type of BC to determine their contribution to metastasis.
Biopsy samples and clinical data were obtained from patients undergoing treatment at Poltava Regional Clinical Dispensary. The study was approved by the Ethics Commission of Ukrainian Medical Stomatological Academy. Materials of the study were intraoperative tumor tissues and ipsilateral lymph nodes in radically removed mammary glands without neoadjuvant treatment. Immunohistochemical (IHC) characteristics of the removed tumors (HER2, ER, PR, Ki67) were used to distinguish the TNBC group. According to the meta-analysis, the use of CD68 as a biomark-er for TAM for IHC evaluation has its priorities, as compared with the individual definition of CD163 or CD206. We analyzed two subgroups of TNBC, balanced by the N0/1 status, 3 samples in each, and 3 samples of metastases in the lymph nodes, respectively. The average age of patients was 64 years, from 52 to 76. Primary-metastatic BC was observed in all patients in the 2nd, N1 group. Morphological and IHC findings were obtained according to the criteria for determining the molecular and biological subtype. IHC studies for determining TAM and M2-like macrophages were performed using the streptavidin-peroxidase method. The evaluation of immunohistochemical coloring was
performed by counting CD68+TAM and CD163+M2-like TAMs under the light microscope (Biolam, LOMO, Russia: lens x40, eyepiece x7) in 7-10 fields of view of the intensive ICH-reaction of each section, calculating the arithmetic mean, within the tumor nests and tumor stroma. The count included immunopositive cells with macrophage morphology. Microphotographs were obtained using the Leica DM500 microscope, Leica, Germany (lens x 4, 40). The statistical analysis was carried out using the GraphPad Prism 5 software, using nonparametric, parametric and simulation methods.
The study is organized as a descriptive pathomorphological comparison between the two groups: N0 and N1, triple-negative BC, comparison of quantitative characteristics of CD68+ and CD163+M2-like fraction of TAM, as well as for verification of possible correlation relations between the quantitative characteristics of macrophages in the primary tumor and in the corresponding metastasis in the ipsilateral axillary lymph nodes. Increased level of infiltration of the primary focus of TNBC with CD68+TAM and CD163+M2-like macrophages is reliably associated with metastasis. It is assumed that the M1-like subpopulation of TAM most closely contacts with tumor nests in TNBC, which may be a prerequisite for the spread of the tumor, or metastasis. Primary premetastatic effects of TNBC may be related to the increase of not only M2, but also M1 macrophages. In metastatic lymph nodes, the amount of CD68+TAM was significantly lower than that of primary TNBC, whereas the quantitative indices of CD163+M2 correlated. Along with the localization and co-localization of CD68+ and CD163+M2-like TAMs, the results conform with the generally accepted paradigm that M1 TAM has an anti-tumoral but lower potential and M2 - the protumoral one, but this is shown for metastases in the regional lymph nodes in primary-metastatic TNBC. Precise quantitative TAM indices for the use in clinical practice have not been developed, although their pathogenetic significance and quantitative variations are reliable according to metastasis and other clinical data of TNBC.
Key words: tumor-associated macrophages, immunohistochemical studies, CD68+ and CD163+, triple-negative subgroup, breast cancer.
Рецензент - проф. Старченко 1.1.
Стаття наджшла 25.11.2018 року
