CC BY
151
УДК 543.54:543.851
КЕДРОВОЕ МАСЛО (МАСЛО СЕМЯН PINUS SIBIRICA): АНАЛИЗ И УСТАНОВЛЕНИЕ ФАЛЬСИФИКАЦИИ МЕТОДОМ ВЭЖХ
© В.И. Дейнека , Л.А. Дейнека
Белгородский государственный университет, ул. Победы, 85, Белгород, 308015 (Россия) E-mail: [email protected]
В работе рассматриваются преимущества метода изократической обращенно-фазовой ВЭЖХ с рефрактометрическим детектированием при анализе растительных масел и установлении их фальсификации. Сопоставлены параметры удерживания растительных масел, образованных с участием радикалов октадекатриеновых кислот различного строения. Показана возможность прямой дифференциации таких масел по временам удерживания. Установлено, что соотношение индивидуальных видов триглицеридов может быть важнейшей, практически не поддающейся фальсификации характеристикой индивидуальности масел. Представлены результаты исследования кедровых масел ряда производителей. Обсуждаются дополнительные возможности анализа растительных масел, возникающие за счет использования УФ-детектирования.
Введение
В работе, опубликованной в 1998 году [1], авторы отмечали полное отсутствие на рынке продуктов переработки кедрового ореха, в том числе и кедрового масла. Потребовалось относительно немного лет, чтобы кедровое масло стало доступным продуктом: сегодня масло нескольких различных производителей продается в аптеках России (и других стран бывшего СССР). Большое количество разнообразной информации и предложений о продаже кедрового ореха и продуктов его переработки обнаруживается в настоящее время в Интернете. Однако достоверность этой информации весьма сомнительна. Например, относительно жирно-кислотного состава кедрового масла, к сожалению, не только в Интернете, но и в отечественной научной литературе имелись разночтения [2]. Даже в относительно недавней публикации в специализированном информационном издании «Масла и жиры» в статье, посвященной кедровому маслу, сообщается о накоплении в нем у-линоленовой кислоты, что якобы делает это масло аналогом масла энотеры [3]. Неудивительно, что и на сайте http://www.siberiagoldenherbs.com/, ориентированном на экспорт, в заглавной статье тиражируется утверждение о том, что кедровое масло является источником у-линоленовой кислоты. Поскольку полностью ^ис-5,9,12-октадекатриеновая (пиноленовая), а не полностью цис-6,9,12-октадекатриеновая (у-линоленовая) кислота признана таксономическим маркером семейства Pinaceae [4-6], то возникает вопрос о выборе надежного метода анализа при исследовании масел.
Целью данной работы было подтверждение потенциальных возможностей метода ВЭЖХ для анализа масел и установления их фальсификации на примере кедрового масла.
Экспериментальная часть
Для обращенно-фазовой ВЭЖХ использовали хроматографическую систему, составленную из насоса Altex 110A, крана дозатора Rheodyne 7100 с петлей объемом 20 мкл, детектора RI 401 Waters. Регистрацию и обработку хроматограмм проводили с помощью ПП Мультихром 1.5 (Ampersand Ltd. 2005). Хроматографи-ческие условия: колонка 250*4 мм; Диасфер-110-С18, 5 мкм; подвижная фаза ацетонитрил - ацетон (10 : 90 об.) и (20 : 80 об.), 1 мл/мин.
* Автор, с которым следует вести переписку.
Кедровые масла: БИАСК («Кедрон», ООО ТПК «Ароматы жизни», РФ, г. Москва), БиоКонтур (ЗАО «БиоКонтур» РФ, г. Мурманск), Эвалар («Сибирское», ЗАО «Эвалар», РФ, г. Бийск), Парус (БАД из кедрового ореха, ЧП ВУ ПКЦ «Парус» Украина, г. Харьков) и льняное масло приобретены в аптеках Белгорода и Горловки Донецкой обл. (Украина). Масло энотеры предоставлено ООО «Фармпромсож», Белгородская область. Масло аквилегии экстрагировали [2] из семян, собранных в 2004 г.
Для математического моделирования хроматограмм использовали инкрементную модель [7]. По этой модели в качестве реперного использовали время удерживания трилинолеата (Л3) и два инкремента, соответствующих, соответственно, замене линолевой кислоты на олеиновую и олеиновой на пальмитиновую:
а = А(Л ^ О) = ^к(Л2О) -^к(Л3); (1)
Ь = А(О ^ П) = ^ к(Л2П) -^к(Л2О).
(2)
Время удерживания дилинолеата-олеата, Л2О, и дилинолеата-пальмитата, Л2П, составляющих вместе с трилинолеатом основные триглицериды подсолнечного масла, определяли экспериментально. В опорной формуле
Р (Г) = I
Рп
(
■ к ■ (к +1)
• ехр
(*Яп -1)
2 ^
2 ■ w ■ к ■ (к +1)
(3)
п =
суммируются гауссианы, моделирующие пики триглицеридов из таблицы, приведенной ниже, с соответствующим временем удерживания. В формуле для учета изменяющейся ширины пиков использовали положение о линейности соотношений «квадрат полуширины пика как функция к(к+1) [8]» с рассчитываемым в соответствии с эффективностью системы коэффициентом w. Численное значение относительного количества триглицерида, Рп, в смеси в соответствии с моделью равновероятного замещения положений в глицерине радикалами кислот рассчитывали по формулам, представленным в таблице, где 0Л, Оо и 0П - мольные доли линолевой, олеиновой и пальмитиновой кислот в масле.
Параметры пиков триглицеридов для моделирования хроматограммы
№ Триглицериды Время удерживания, Гк Логарифм фактора удерживания, к Р формула
Формула Состав Формула мин Формула Численное значение
?0 - 2,00* -
1 Л3 трилинолеат - 5,00* А = 1^) 0,176 1,50 Ол3
2 Л2О дилинолеат-олеат 5,73 А+а 0,270 1,86 3Ол2Оо
3 Л2П дилинолеат-пальмитат 5,96 А+а+Ь 0,296 1,98 3Ол2Оп
4 ЛО2 линолеат-диолеат 6,63 А+2а 0,364 2,31 3Оо2Ол
5 ЛОП линолеат-олеат-пальмитат 6,91 А+2а+Ь 0,390 2,46 6ОлОохОп
6 ЛП2 линолеат-дипальмитат о 7,21 А+2а+2Ь 0,416 2,61 3Оп2Ол
7 О3 триолеат ср 7,74 А+3а 0,458 2,87 Оо3
8 О2П диолеат-пальмитат 8,10 А+3а+Ь 0,484 3,05 3Оо2Оп
9 ОП2 олеат-дипальмитат 8,47 А+3а+2Ь 0,510 3,24 3ОоОп2
Примечание. к - фактор удерживания; а и Ь - инкременты, рассчитываемые по формулам (1) и (2).
Обсуждение результатов
Предварительные замечания. При анализе растительных масел в аккредитованных лабораториях может быть использован только один метод - по ГОСТ 30418-96. Масла растительные. Метод определения жирнокислотного состава. Он включает омыление масла, экстракцию жирных кислот, получение метиловых эфиров с последующим определением эфиров методом ГЖХ. Следовательно, в методе используется, по крайней мере, две стадии, выход продуктов на которых может быть не стопроцентным. Поскольку в подав-
Кедровое масло (масло семян Pinus sibirica)
23
ляющем большинстве случаев результат определения по ГОСТу не может быть сопоставлен с заведомо известными данными, то достоверность получаемых данных не очевидна. Свидетельство тому - поразительные расхождения в сведениях о составах масел, полученных разными авторами, даже не по относительному соотношению составляющих компонентов, но по качественному составу (достаточно познакомиться с обширной базой данных на сайте http://www.bagkf.de/sofa/).
Метод обращенно-фазовой ВЭЖХ является достойной альтернативой, имеющей целый ряд преимуществ перед методом определения жирнокислотного состава по ГОСТ 30418-96. Прежде всего, в методе нет особой пробоподготовки: перед вводом в хроматограф достаточно просто растворить исследуемое масло в элюенте, т.е. нет стадий, которые могли бы внести ненужные коррективы в состав образца. В методе ВЭЖХ также необходимо использование стандартов [7], но в большинстве случаев поиск этих стандартов не вызывает особых затруднений - они могут быть найдены в ближайшем продуктовом магазине, аптеке или на прилавках с семенами для садоводов-любителей. Установление фальсификации - еще одно из направлений, в котором методы с использованием ВЭЖХ имеют преимущество перед методами с использованием ГЖХ [9, 10].
Для подтверждения последнего утверждения используем простую модель. Пусть имеется два растительных масла, триглицериды которых содержат радикалы олеиновой, линолевой и пальмитиновой кислот в количествах: 75, 15 и 10 (масло А) и 15, 75 и 10 (масло Б) моль %. Распределение радикалов линолевой и олеиновой кислот в триглицеридах обычно не слишком отличается от статистического [11]. Это позволяет выполнить компьютерное моделирование триглицеридного состава и хроматограмм масел А и Б (рис.1).
Пусть существует некоторое масло В, по жирнокислотному составу среднее между маслами А и Б (45 моль % олеиновой кислоты, 45 моль % линолевой кислоты и 10 моль % пальмитиновой кислоты). Очевидно, для его фальсификации, которая не может быть установлена методом ГЖХ, достаточно смешать масла А и Б в соотношении 1 : 1. Но по триглицеридному составу масло В и фальсификация (А+Б) (с учетом распределения радикалов кислот) различаются настолько значительно, что нет необходимости в выполнении расчетов (рис. 2).
Приведенный пример не лишен смысла, поскольку масла А, Б и В - упрощенные аналоги, например, подсолнечного, оливкового и персикового масел.
Сопоставление масел, содержащих радикалы октадекатриеновых кислот. Среди растительных масел с октадекатриеновыми кислотами наиболее распространены четыре изомера со следующим положением и конфигурацией двойных связей: 92,122,152-а-линоленовая, 62,92,122-у-линоленовая, 5E,9Z,12Z-ранункуленовая [12] или колумбиновая (columbinic [13]), и 5Z,9Z,12Z-пиноленовая (pinolenic [13]) кислоты. Отметим, что только одна из указанных кислот является ю-3-кислотой, а остальные относятся к ю-6-типу. В литературе также имеется упоминание об обнаружении редкой 3Z,12Z,15Z-октадекатриеновой кислоты [14], а кислоты с конъюгированными тройными связями входят в состав масел, отличительной особенностью которых является возможность использования УФ-детектирования при ВЭЖХ [15].
Разделение триглицеридов масел: льняного, содержащего радикалы а-линоленовой кислоты, масла «примулы вечерней», Oenothera biennis, содержащего радикалы у-линоленовой кислоты, масла семян аквилегии, как источника ранункуленовой кислоты, и кедрового масла, образованного с участием пиноленовой кислоты, выполняли в элюенте, содержащем 10 об. % ацетонитрила в ацетоне. С использованием инкрементного подхода [7] были рассчитаны Д(Х ^ Л) - разности десятичных логарифмов факторов удерживания пар триглицеридов, в которых один радикал октадекатриеновой (X) кислоты заменен на линолевую (Л).
В результате получены следующие значения: 0,100, 0,074, 0,064 и 0,070 для X = 9Z,12Z,15Z-, 6Z,9Z,12Z-, 5E,9Z,12Z- и 5Z,9Z,12Z - С18:3 соответственно. Отсюда следует, что по времени удерживания триглицеридов, содержащих радикалы октадекатриеновых кислот, заметно выделяются а-линоленовые масла. Различия инкрементов достаточно для дифференциации остальных масел, но только по образцам триглицеридов, содержащих по 2 X-радикала. Однако для кедрового масла триглицериды, содержащие больше одного радикала пиноленовой кислоты, не характерны (рис. 3). Поскольку основной триглицерид кедрового масла имеет состав XЛ2, то неравновероятность заполнения всех положений глицерина пиноленовой кислотой очевидна. Это не только не противоречит выводам работы [16], но и дает новую информацию, полученную методом, не сопоставимым по затратам времени и реактивов с методом, примененным в цитируемой работе.
mV
tR, min
Рис. 1. Компьютерная модель масел А и Б
mV
tR, min
Рис. 2. Компьютерная модель масла В и смеси масел А+Б
mV
200
100
0
5
10
Рис. 3. Разделение триглицеридов масел семян растений:
А - Кедровое масло БИАСК; Б - кедровое масло БиоКонтур; В - смесь кедрового масла с маслом энотеры; Г - масло энотеры. 1 - Х2Л; 2 - ХЛ2; 3 - Л3; 4 - ХЛО; 5 - ХЛП; 6 - Л2О; 7 - Л2П; 8 - ХО2; 9 - ХОП; 10 - О2Л. Подвижная фаза: ацетонитрил - ацетон (20 : 80 об.), 1 мл/мин. X - радикалы пиноленовой, Л - линолевой, О - олеиновой и П - пальмитиновой кислот в составе триглицеридов
мин
Кедровое масло (масло семян ртж 8тшсл) ...
25
Напомним, что информация о соотношении различных типов триглицеридов может быть использована для установления фальсификации. Так, по результатам наших исследований, найденное для пиноленовой кислоты непропорциональное преобладание триглицерида ХЛ2 повторяется в маслах семян других растений семейства Ргпасвав. Для масел, образованных с участием у-линоленовой кислоты, это не характерно. В случае масла энотеры (рис. 3) небольшое количество триглицерида Х2Л является следствием малого соотношения количеств триглицеридов ХЛ2 и Л3; при увеличении доли у-линоленовой (переход к маслу бораго) пик триглицерида Х2Л становится значительным [7]. Отличить кедровое масло от у-линоленовых масел можно и при минимальном различии в удерживании триглицеридов ХЛ2 - по заметному уширению соответствующего пика для смеси двух масел (рис. 3).
На рисунке 4 представлены хроматограммы кедровых масел различного происхождения. Масло, полученное экстракцией (элюентом) из семян кедрового ореха в нашей лаборатории (А), отличалось от масла фирм БИАСК (Б) и Эвалар (В) только присутствием слабоудерживаемых примесей, от которых указанные фирмы, вероятно, избавляются в процессе очистки. Однако БАД из кедрового ореха украинского производства (Г), скорее всего, получена экстракцией кедровых орехов подсолнечным маслом.
Отметим, что исследования [17], выполненные нами в условиях УФ-детектирования, позволили предложить еще один вариант установления фальсификации кедрового масла. Известно, что непредельная С=С - связь имеет максимум поглощения в вакуумной ультрафиолетовой области, точное положение максимума (максимумов) зависит от ближайшего окружения (изолированных в нашем случае) двойных связей, что может сказаться и на остаточном поглощении в диапазоне детектирования триглицеридов (204-210 нм). Отметим, что а- и у-линоленовые кислоты имеют эквивалентное ближайшее окружение, отличающееся от строения хромофоров в пиноленовой и ранункуленовой кислотах. Исследуя хроматограммы масел, записанные при 210 и 205 нм, мы находили отношение площадей пика триглицерида состава ХЛ2: Я(ХЛ2) = 8205/8210. Были получены соотношения: 2.06, 2.08. 2.40 и 2.35 для Х = 92,122,152-, 62,92,122-, 5Е,92,122- и 52,92,122 - С18:3 соответственно, при относительной погрешности определения Я порядка 5 %. Следовательно, различие пиноленовых и у-линоленовых масел может быть обнаружено даже в условиях микроколоночной ВЭЖХ с двухволновым детектированием, при котором различие времени удерживания триглицеридов не может быть достоверно обнаружено.
шУ
160
80
0
(
Рис. 4. Хроматограммы растворов кедровых масел
А - неочищенный экстракт кедровых орехов, масла производства: Б - Эвалар; В - БИАСК; Г - Парус
Выводы
В работе сопоставлены параметры удерживания растительных масел, образованных с участием некоторых октадекатриеновых кислот различного строения, при использовании обращенно-фазовой ВЭЖХ с рефрактометрическим детектированием. Показана возможность прямой дифференциации таких масел по времени удерживания. Установлено, что соотношение индивидуальных видов триглицеридов может быть важнейшей практически не поддающейся фальсификации характеристикой индивидуальности масел. Представлены результаты исследования кедровых масел ряда производителей. Обсуждаются дополнительные возможности анализа растительных масел, возникающие за счет использования УФ-детектирования.
Список литературы
1. Лебедева О.И., Рубчевская Л.П., Ушанова В.М., Репях С.М. Об экстракции липидных компонентов из семян сосны сибирской // Химия раститительного сырья. 1998. №2. С. 25-29.
2. Дейнека В.И., Дейнека Л.А. Исследование триглицеридного состава масла Pinus sibirica Du Tour // Химия природных соединений. 2003. №2. С. 126-128.
3. Жукова Е.Е., Будаева В.В., Егорова Е.Ю., Ерохина Г.В., Бизюкова А.В. Масло кедрового ореха и его возможности использования // Масла и жиры. 2005. №2. С. 9.
4. Медведев Ф.А., Кулакова С.Н., Левачев М.М. Особенности жирно-кислотного состава кедровых орехов Сибири и Дальнего Востока // Вопросы питания. 1992. №2. С. 70-71.
5. Wolff R.L., Marpeau A.M. Delta5-Olefinic Acids in the Edible Seeds of Nut Pines (Pinus cembroides edulis) from the United States // J. Amer. Oil Chem. Soc. 1997. V. 74. P. 613-614.
6. Wolff R.L., Lavialle O., Pédrono F., Pasquier E., Deluc L.G., Marpeau A.M., Aitzetmüller K. Fatty acid composition of Pinaceae as taxonomic markers // Lipids. 2001. V. 36. P. 439-451.
7. Дейнека В.И., Фофанов Г.М., Хлебников В.А., Балятинская Л.Н. Инкрементный подход в расчете жирнокис-лотного состава триглицеридов // Хранение и переработка сельхозсырья. 2002. №11. С. 20-23.
8. Дейнека В.И., Григорьев А.М. Исследование удерживания антоцианов в элюентах системы ацетонитрил - муравьиная кислота - вода // Журнал физической химии. 2005. Т. 79. №5. С. 900-903.
9. Рудаков О. Б. Развитие метода интерпретации хроматограмм при идентификации растительных масел // Химия растительного сырья. 2001. №4. С. 77-82.
10. Рудаков О.Б., Любарь А.В. Развитие метода обнаружения фальсификации растительных масел // Масла и жиры. 2003. №9. С. 1-4.
11. Дейнека В.И. Триглицеридный состав масел семян некоторых растений // Химия природных соединений. 2003. №6. С. 433-436.
12. Фрейман Р.Э., Маркман А.Л. Триеновая кислота из масел растений Ranunculaceae // Химия природных соединений. 1970. №2. С. 167-169
13. Longman A.J., Michaelson L.V., Sayanova O., Napier J.A., Stobart A.K. An unusual desaturase in Aquilegia vulgaris // Biochem. Soc. Transact. 2000. V. 28. P. 641-643.
14. Tsevegsuren N., Fujimoto K., Christie W.W., Endo Y. Occurrence of a novel cis,cis,cis-octadeca-3,9,12-trienoic (Z,Z,Z-octadeca-3,9,12-trienoic) acid in Chrysanthemum (Tanacetum) zawadskii Herb. (Compositae) seed oil // Lipids. 2003. V. 38. P. 573-578.
15. Дейнека В.И. Обращенно-фазовая ВЭЖХ в анализе масел с радикалами конъюгированных октадекатриеновых кислот // Сорбционные и хроматографические процессы. 2005. Т.5(4). С. 507-517.
16. Blaise P., Tropini V., Farines M., Wolff R.L. Positional Distribution of Delta5-Acids in Triacylglycerols from Conifer Seeds As Determined by Partial Chemical Cleavage // J. Amer. Oil Chem. Soc. 1977. V. 74. P. 165-168.
17. Дейнека В.И., Дейнека Л.А. Анализ растительных масел методом микроколоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии // Журнал аналитической химии. 2004. Т. 59. №9. С. 895-898.
Поступило в редакцию 7 сентября 2006 г. После переработки 14 сентября 2006 г.
