CC BY
102
УДК 616.441-002-097-07
КАТАЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ АНТИТЕЛ К ДНК ПРИ АУТОИММУННОМ ТИРЕОИДИТЕ
Е.Ю. Подшивалина, Л.И. Анчикова, О.А. Коновалова , Г.Р. Вагапова, Т.А. Невзорова, Д.С. Налимов, Н.И. Акберова, З.И. Абрамова, М.Х. Салахов
Кафедра эндокринологии (зав. - проф. Л.И. Анчикова) Казанской государственной медицинской академии последипломного образования, кафедра оптики и нанофотоники (зав. - проф. М.Х. Салахов), кафедра биохимии (зав. - проф\В.Г. Винтер) Казанского государственного университета
На сегодняшний день аутоиммунный тиреоидит (АИТ) является одним из наиболее распространенных заболеваний щитовидной железы. Роль аутоиммунных нарушений в развитии заболевания очевидна [1, 4], вместе с тем до настоящего времени этиология и патогенез АИТ недостаточно ясны.
Исследования последних десятилетий в области биохимии открыли существование природных антител (АТ), обладающих уникальной функцией, — способностью катализировать различные реакции. Такие АТ получили название "абзимы" (от англ. "antibody", "enzyme"), или каталитические антитела. К настоящему времени описаны природные абзимы, проявляющие протеолитическую, оксидоредуктазную, ги-алуронидазную, амилолитическую, перок-сидазную, протеинкиназную, фосфатазную, ДНКазную, РНКазную активности [3, 10]. Обоснованный интерес представляют антитела с ДНК-гидролизующей активностью, поскольку повышенные концентрации антител к ДНК обнаруживаются в крови пациентов с такими аутоиммунными заболеваниями, как системная красная волчанка, аутоиммунный гепатит, полимиозит, рассеянный склероз, синдром Шегрена, болезнь Грейвса, а также при некоторых вирусных (вирусный гепатит, СПИД) и лим-фопролиферативных заболеваниях [9]. Природные абзимы к ДНК обнаруживают у 1-2% клинически здоровых доноров, и их появление рассматривают как ранний предвестник аутоиммунных нарушений, что в дальнейшем может привести к развитию клинической картины заболевания [3].
При аутоиммунных заболеваниях щитовидной железы в организме больных циркулируют антитела, проявляющие
ДНКазную, протеолитическую и перокси-дазную активности. Но наибольшие уровни всех выявленных видов активности проявляют АТ класса выделенные у больных с АИТ [10].
Г.А. Невинский и др. [9] провели исследования ДНК-гидролизующей активности АТ класса в сыворотке больных АИТ и нетоксическим узловым зобом. Было показано, что уровень каталитической активности абзимов к ДНК возрастает параллельно с увеличением концентрации в сыворотке крови тиреоглобулина (ТГ) и антител к ТГ [2, 9].
Таким образом, изучение каталитических АТ к ДНК может внести новые данные в понимание вопросов возникновения и развития аутоиммунных нарушений при АИТ, а также представить дополнительные возможности решения диагностических и лечебных задач.
Атомно-силовая микроскопия (АСМ) широко используется для исследования биологических макромолекул и их комплексов. По принципу специфического взаимодействия антиген-антитело с помощью АСМ можно непосредственно визуализировать образующиеся комплексы при сканировании образцов [7, 8]. При этом АСМ позволяет получать изображения с высоким разрешением в условиях, при которых макромолекулы не подвергаются жесткой обработке и проявляют свою природную активность.
Целью данного исследования являлось изучение методом АСМ характера взаимодействия АТ, выделенных из сыворотки больного АИТ, с ДНК.
Нами изучены антитела к нативной и денатурированной ДНК в сыворотке крови 300 больных АИТ и у 50 здоровых лиц,
сопоставимых по полу и возрасту. Диагноз АИТ подтверждался общепринятыми клиническими и лабораторно-инстру-ментальными методами.
В работе использовали целлюлозу микрокристаллическую, додецилсульфат натрия, набор белков-маркеров ("Serva", Германия), ДНК из эритроцитов цыплят, ак-рилекс Р-6 ("Reanal", Венгрия).
Выделение из сыворотки больных АИТ антител к нДНК заключалось в осаждении IgG сульфатом аммония, гель-фильтрации на акрилексе-Р6, аффинной хроматографии на микрокристаллической нДНК-целлюлозе, приготовленной по методу Litman в модификации, предложенной Т. А. Невзоровой и др. [7].
Электрофоретический анализ антител в полиакриламидном геле (ПААГе) в присутствии Ds-Na по методу Леммли проводили для оценки гомогенности препарата и принадлежности данных АТ к классу IgG. Содержание АТ к нДНК изучали методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием наборов для количественного определения АТ класса IgG фирмы "Orgentec" (Германия). Расчет результатов производился с помощью калибровочной кривой в линейно-логарифмических координатах (в Ед/мл).
При выполнении атомно-силовой микроскопии исследуемые образцы разводили 25 мМ трис-НС1 буфером, рН 7,5, 5 мМ MgCl2 до конечной концентрации от 0,2 до 2,0 мкг/ мл ДНК эритоцитов цыпленка ("Reanal", Венгрия) и/или от 2,6 до 4,3 мкг/мл АТ. ДНК эритроцитов цыплят с внесенными АТ и без них (контроль 1) инкубировали при +37о С в течение 17 часов. Образец в объеме 5 мкл наносили на свежерасщепленную пластину слюды (1 х1 см) и инкубировали 5 минут при комнатной температуре, промывали 1 мл деионизованной стерильной водой и высушивали струей сжатого воздуха, а затем над силикагелем. С целью исключения влияния инкубации на длину ДНК в исследование включали образцы ДНК, не подвергшиеся инкубации (контроль 2).
Визуализацию проводили на АСМ Solver P47H кремниевыми кантилевера-ми NSG11 (ЗАО "НТ-МДТ", Россия) в полуконтактном режиме на воздухе при
комнатной температуре. Сканирование осуществляли с разрешением 1024х1024 точек. Обработку АСМ изображений производили с помощью программного обеспечения Nova RC1.0.26.878 компании ЗАО "НТ-МДТ" (Россия). Длину молекул ДНК подсчитывали с помощью программы DNA Processing Aplication 2.6. Статистическую обработку полученных результатов исследования проводили с помощью статистических пакетов Statistica и Statgraphics. Объем выборки контрольных групп составлял по 50 молекул ДНК, опытной — 100 молекул ДНК.
В процессе изучения абзимов нередко встает вопрос о принадлежности каталитических свойств собственно АТ, так как в сыворотке крови человека содержится значительное количество ДНКаз, которые могут присутствовать в препаратах выделенных АТ. Ig могут образовывать комплексы с различными белками и ферментами, которые могут совыделяться с АТ [9]. Наши предыдущие исследования показали, что после прогревания сыворотка крови здоровых доноров теряет ДНК-гидролизующую способность, тогда как сыворотка крови больных СКВ и выделенные АТ эту способность сохраняют [6, 8]. Поэтому все полученные препараты АТ к ДНК мы предварительно прогревали при +56о С в течение 40 минут для инактивации возможной примеси сывороточных ДНКаз.
В процессе выделения АТ к ДНК было получено несколько фракций, отличающихся сродством к нДНК-целлюлозе и количественным содержанием белка. Наибольшее количество АТ было во фракции, полученной при элюции АТ с аффинной колонки 1М NaCl, где содержание белка равнялось 6,7 мкг/мл. Все последующие исследования проводились с данной фракцией АТ к ДНК.
Электрофорез в ПААГе показал, что АТ данной фракции являются IgG с молекулярной массой 150 кДа. При проведении ИФА выделенные АТ взаимодействовали с нДНК, и их содержание составляло 12 ед/мл. Методом атомно-силовой микроскопии были получены изображения контрольных препаратов ДНК эритроцитов цыплят (рис.1) и выделенных АТ к нДНК класса IgG (рис.2). Ширина ДНК
9. «Казанский мед. ж.», № 2.
129
Рис.1. Локализация АТ к нДНК (показана стрелками) на молекулах ДНК эритроцитов цыплят после инкубации при +37оС в течение 17 часов.
Рис.2. Локализация АТ к нДНК (показана стрелками) на молекулах ДНК эритроцитов цыплят после инкубации при +37оС в течение 17 часов (длина отрезка — 200 нм).
на полученных изображениях варьирует в зависимости от зонда от 9,8 до 20,2 нм со средним значением 15,3 нм, а высота — от 0,38 до 1,05 нм со средним значением 0,71 нм. Молекулы АТ класса ^С имеют овальную или шаровидную форму с диаметром 9,8 — 24,4 нм и высотой от 0,77 до 1,6 нм со средним значением 1,1 нм. Известно, что реальный диаметр молекулы ДНК составляет около 2 нм. Искажение реальных размеров молекул типично для АСМ-изображений: завышение ширины происходит в результате наложения размеров зонда на изображение, занижение же высоты объектов — из-за деформации молекул под воздействием зонда. Кроме того, высота ДНК препаратов, сканируемых на воздухе, как правило, ниже, нежели при сканировании в жидкости, вследствие дегидратации образца [5].
При подсчете длины молекул ДНК в
2000 1800 1600 | 1400 1200 -
препаратах распределения данного показателя отличались выраженной асимметрией, поэтому мы использовали структурную характеристику — медиану. Достоверность различий оценивали с применением непараметрических критериев Крускалла —Уол-лиса и Дана. Медианы длин молекул ДНК двух контрольных препаратов, один из которых инкубировали при +37оС, а другой не подвергался инкубации, составили 665,75 нм (2,5 %о - 124,43 нм; 97,5 %0 — 1987,66 нм) и 806,0 нм (2,5% -172,45 нм; 97,5%—1941,5 нм) соответственно, и статистически значимого различия между контрольными образцами не выявлено (рис.3). Инкубация достоверно не влияла на изменение длины молекул ДНК.
При исследовании взаимодействия препарата АТ к нДНК с ДНК эритроцитов цыплят обнаружено увеличение количества низкомолекулярных фрагментов ДНК
& 1000
95 перцентиль
/
5 перцентиль
ДНК инкубированные при ДНК инкубированные при 37 С без АТ 37 С с добавлением АТ
ДНК эритроцитов цыплят Рис.3. Медианы длин молекул ДНК эритроцитов цыплят (контроль и опыт).
Рис. 4. Локализация АТ к нДНК (показана стрелками) на молекулах ДНК эритроцитов цыплят после инкубации при +37оС в течение 17 часов.
по сравнению с контрольными образцами (р<0,05). При инкубации ДНК с выделенными антителами к нДНК медиана длины молекул ДНК уменьшалась до 295,15 нм (2,5 %о—102,25 нм; 97,5 %0-1171,27 нм). Этот факт свидетельствует о гидролизующем характере действия АТ на молекулы ДНК. На диаграммах (рис. 3) представлены 95% доверительные интервалы для истинных медиан.
После инкубации АТ класса с ДНК было обнаружено, что антитела располагаются на молекулах ДНК и локализуются на концах коротких и средних по длине молекул ДНК, а также в центре длинных и средних по длине ДНК (рис. 4). Участок взаимодействия АТ-ДНК характеризовался большими размерами, чем свободная молекула ДНК: диаметр составлял 11,4 — 39,7 нм, высота — 0,47—1,9 нм. Образовавшиеся иммунные комплексы АТ-ДНК отличались высокой стабильностью, т. е. после осуществления гидролиза освобождения АТ от молекулы ДНК не происходит. Впервые подобный характер действия абзимов к ДНК методом АСМ был показан при СКВ [5] и охарактеризован как непроцессивный. Полученный эффект может быть связан с наличием в активном центре абзимов к ДНК двух участков, один из которых ответственен за связывание с молекулой ДНК, а другой — за проявление каталитической активности [6, 8].
Таким образом, методом атомно-силовой микроскопии показано присутствие антител
к ДНК в сыворотке крови больных АИТ и доказан их гидролизующий характер действия на молекулы ДНК. Возможно, обнаружение абзимов к ДНК в сыворотке крови пациентов с АИТ позволит на ранних сроках болезни устанавливать аутоиммунный характер заболевания и даст возможность выявлять лиц с факторами риска развития аутоиммунного процесса.
ЛИТЕРАТУРА
1. Александрова Г.Ф., Внотченко С.Л. // Пробл. эндокринол. -1980. - № 3.- С.78-85.
2. Бреусов А.А., ГальвитаА.В., Бензо Е.С. и др. // Russ. J. of Immunol. - 2001.- Т. 6. - С. 18-28.
3. Генералов И.И. // Иммунопатол., аллергол., инфектол. - 2002. - № 2. - С. 19-37.
4. Епишин А.В., Декайло И.Н., Епишина Н.А. // Клин. мед. - 1986. - № 3. -С.27-32.
5. Невзорова Т.А Автореф. дисс. ... канд. биол. наук.-Казань, 2005.
6. Невзорова Т.А., Темников Д.А., Винтер В.Г. // Биохимия. - 2003. - Т. 65.- Вып.12.- С. 1616-1623.
7. Невзорова Т.А., Винтер В.Г., Коновалова О.А., Салахов М.Х. // Доклады АН. - 2005. — № 3. -С.409-411.
8. Невзорова Т.А., Винтер В.Г., Коновалова О.А., Салахов М.Х. // Биохимия. - 2006. - Т.71. - Вып.11. -С.1524-1533.
9. Невинский Г.А., Канышкова Т.Г., Бунева В.Н. // Биохимия. - 2000. - Т. 65. - Вып. 11. - С. 1473-1487.
10. Сидорская Е.В., Генералов ИИ, Окороков А.Н.// Иммунопатол., аллергол., инфектол.- 2000.- № 1.-С. 57-61.
Поступила 09.04.07.
CATAMNESTIC ACTIVITY OF ANTIBODIES TO DNA IN AUTOIMMUNE THYROIDITIS
E.Y u. Podshivalina, L.I. Anchikova, O.A. Konovalova, G.R.Vagapova, T.A Nevzorova, D.C. Nalimov, N.I. Akberova, Z.I. Abramova, M.Kh. Salakhov
Summary
Interaction between pu rified serum antibodies IgG (IgG-Ab) to native double-stranded DNA (dsDNA) received from patient with autoimmune thyroiditis and molecules of chicken's erythrocytes dsDNA have been investigated using atomic force microscopy (AFM). Typical AFM-images of IgG-Ab and dsDNA molecules have been obtained. It was shown that incubation of dsDNA with IgG-Ab causes significant dsDNA length decrease with IgG-Ab fixation on tips of short and middle and also in central part of long and middle length fragments of dsDNA molecules. Conclusion about the presence of IgG-Ab to dsDNA with DNA-hydrolyzing activity in the serum of patient with autoimmune thyroiditis was made.
