CC BY
134. Григорьев Ю.С. Методика определения токсичности проб поверхностных пресных, грунтовых, питьевых, сточных вод, водных вытяжек из почвы, осадков сточных вод и отходов по изменению оптической плотности культуры водоросли хлорелла. — Красноярск: КТУ, 2004. — 19 с.
5. Жмур Н.С. Методика определения токсичности воды и водных вытяжек из почв, осадков сточных вод, отходов по смертности и изменению плодовитости дафний. — М.: Акварос, 2001. — 48 с.
6. Жмур Н.С. Методика определения токсичности воды и водных вытяжек из почв, осадков сточных вод, отходов по смертности и изменению плодовитости цериодафний. — М.: Акварос, 2001. - 52 с.
7. Зайцев С.В., Ефанов А.М., Сазанов Л.А. Общие закономерности и возможные механизмы действия биологически активных веществ в сверхма-
лых дозах // Рос. хим. журнал, 1999. - Т. XLIII. -№ 5. - С. 28-33.
8. Методика определения токсичности воды и водных вытяжек из почв, осадков сточных вод и отходов по изменению интенсивности бактериальной биолюминесценции тест-системой «Эко-люм». - М.: МПР РФ, 2004. - 16 с.
9. Методика определения токсичности проб вод (природных, хозяйственно-питьевых, промышленных сточных) экспресс-методом с применением прибора «Биотестер». - СПб: Спектр-М, 2005. — 13 с.
10. Davenas Е. et al. Human basophil degranulation triggered by very dilute antiserum against IgE // Nature, 1988. - V. 333. - № 6176. - P. 816-818.
Переработанный экз. материалов поступил в редакцию 16.05.07.
V.N.Chupis, Ye.A.Lushchay, I.N.Larin, A.A.Zagrekov, Ye.V.Ilyina, D.Ye.Ivanov TOXICOLOGICAL ASSESSMENT OF REACTION MASSES FORMED AT DETOXICATION OF LEWISITE
Institute of Industrial Ecology, Saratov
Acute and chronic toxicity of differently diluted reaction masses formed at the destruction of Lewisite in infusoria, luminescent bacteria, Chlorella, Daphnia, Ceriodaphnia was studied. The results presented showed that when the temperature of the cultivation medium rises, the sensibility of ceriodaphnia to the effect of toxicants increases. The effect of differently diluted reaction masses on Daphnia motor activity and Ceriodaphnia fertility was studied. A lethal and harmless dilution multiplicity factor of the reaction mass solutions was estimated for Daphnia and Ceriodaphnia.
УДК 615.9.036.11.07:616.153.074
Э.Р.Нагиев, М.С.Сейфаддинова, Ф.Э.Исмаилова
КАТАБОЛИЗМ И РЕУТИЛИЗАЦИЯ АДЕНИЛОВЫХ НУКЛЕОТИДОВ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ КРЫС ПРИ ОСТРОМ ОТРАВЛЕНИИ ГАЗОКОНДЕНСАТОМ
Дагестанская государственная медицинская академия, Махачкала
Представлены результаты исследований активности ключевых ферментов катаболизма и реутилизации адени-ловых нуклеотидов (АМФ-дезаминазы, 5'-нуклеотидазы и аденилаткиназы) в сыворотке крыс, подвергнутых однократному отравлению газоконденсатом. Наиболее выраженные изменения активности ферментов наблюдались на 5—10 сутки после отравления. Выявлено повышение активности АМФ-дезаминазы и прямой аденилаткиназы, активность 5'-нуклеотидазы снижалась.
Ключевые слова: адениловые нуклеотиды, АМФ-дезаминаза, 5' -нуклеотидаза, аденилаткиназа, газоконденсат.
Введение. Ежегодно в атмосферу выбрасывается 2,5 млн. тонн нефти и нефтепродуктов, около 6 млрд. м3 попутного нефтяного газа сжигается в факелах. Согласно экспертным данным, на нефтепромыслах теряется в общей сложности до 3,5% всей добываемой сырой нефти (с учетом нефтяных газов). Сейчас утилизируется в среднем около 70% газов, поступающих из скважин с нефтью, а остальные 30% сжигаются на факелах и частично испаряются в атмосферу [1, 6].
В связи с этим возрастает актуальность проблемы воздействия нефти, нефтепродуктов, в том числе и газового конденсата (в условиях массового загрязнения среды ими) на обменные процессы организма.
Наше исследование посвящено одной из актуальных проблем экологической и токсикологической биохимии — проблеме острой интоксикации. В настоящее время, в связи с возрастающим объемом промышленных выбросов углево-
дородов в окружающую среду на первый план выдвигается задача изучения реактивности организма. Изменение реактивности — и есть проявление начальных сдвигов возникающих в организме. Обнаружение этих сдвигов может помочь в ранней диагностике интоксикации. А это требует рассмотрения проблемы воздействия ксенобиотиков, в частности углеводородов, на физиологические и метаболические процессы, протекающие в организме животных и человека.
Возможно нарушение метаболических процессов в тканях, а также преобладание катабо-лических процессов над пластическими при воздействии токсикантов обусловлено нарушениями энергетического обмена.
Таким образом, несомненный интерес представляет изучение процессов катаболизма и реутилизации адениннуклеотидов в динамике острого отравления углеводородами, в частности газоконденсатом, представляющим собой смесь высококипящих углеводородов и углеводородов метан-бутановой фракции.
В связи с этим целью настоящего исследования было изучение ферментов лимитирующих катаболизм адениловых нуклеотидов — АМФ-дезаминазы и 5'-нуклеотидазы и ферментов реутилизации — прямой и обратной аденилаткина-зы в сыворотке крови крыс до и после отравления газоконденсатом.
Материал и методы исследований. Исследования проводили на половозрелых беспородных лабораторных крысах обоего пола, средней массой 190—200 г. Подопытных животных, как и контрольных, содержали в одинаковых стандартных условиях вивария на полноценном пищевом рационе [4]. Острое отравление газовым конденсатом вызывали путем однократного, пе-рорального введения токсиканта предварительно наркотизированным животным (калипсол). Газовый конденсат растворяли в дистиллированной воде 1:1 и вводили экспериментальным крысам в желудок через зонд в количестве 1 мл газоконденсата на 100 г массы животного. Контрольным крысам вводили эквивалентное количество дистиллированной воды.
Все процедуры (отравление, декапитация и взятие материала для исследования) выполняли спустя 14—16 ч после дачи корма. Забой животных во всех случаях исследований осуществляли между 12 и 16 ч дня. Опыты проводили через 1 час, 1, 5, 10 и 15 суток после введения токсиканта.
Подсчет количества эритроцитов и лейкоцитов производили под микроскопом в счетной камере Горяева с последующим пересчетом на 1 л крови, исходя из объема подсчитываемых квадратов и разведения крови [5]. Количество от-
дельных видов лейкоцитов (лимфоциты, моноциты и нейтрофилы) высчитывали по лейкоцитарной формуле. Лейкоцитарную формулу подсчитывали в окрашенных мазках крови под микроскопом с иммерсионной системой [2, 5].
Активность АМФ-дезаминазы определяли спектрофотометрическим методом, основанным на уменьшении оптической плотности раствора при 265 нм после дезаминирования АМФ до ИМФ [9]. Активность 5'-нуклеотидазы — фо-тоэлектроколориметрическим методом, оценивали по приросту неорганического фосфата при 630 нм [11]. Активность прямой аденилаткиназ-ной реакции определяли по интенсивности образования АДФ в системе, сопряженной с пиру-ваткиназной и лактатдегидрогеназной реакциями [12]; активность обратной аденилаткиназной реакции определяли по интенсивности образования АТФ в системе, сопряженной с гексоки-назной и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназной реакциями [13].
Количество белка в пробах определяли мик-робиуретовым методом [3], используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин. Результаты исследования подвергали статистической обработке при использовании методов вариационной статистики [10].
Результаты и обсуждение. Экспериментальные исследования проводили в двух основных направлениях: исследовали обмен адениловых нуклеотидов в сыворотке, а также общеклинические эффекты при воздействии на организм га-зоконденсатной смеси.
Наиболее выраженные изменения в поведении животных, летальности, изменении массы тела, гематологических показателей наблюдались в сроки с 5-х по 10-е сутки. К примеру, в эти сроки наиболее выраженно изменяется уровень форменных элементов крови, что проявляется в уменьшении количества эритроцитов и лейкоцитов. Вероятно, это связано с нарушением перераспределения лейкоцитов между циркулирующим и марганальным пулами на первых этапах, а в последующем — с усиленным разрушением клеток крови или с нарушением регуляции кроветворения под воздействием токсиканта (табл. 1).
Основываясь на этих наблюдениях, катаболизм и реутилизацию исследовали в те же сроки, когда наблюдались наиболее выраженные изменения интегральных показателей.
В сыворотке крови крыс в норме активность 5'-нуклеотидазы выше активности АМФ-деза-миназы и активности аденилаткиназы. Активность прямой аденилаткиназы выше активности обратной в сыворотке крови крыс в норме. Внесение в среду инкубации АТФ способствовало
Таблица 1
Эритроциты, лейкоциты, нейтрофилы, лимфоциты и моноциты в крови крыс, отравленных газовым конденсатом (в 1 л крови; М±т; п = 10)
Время после отравления Эритроциты Лейкоциты Нейтрофилы Лимфоциты Моноциты
Контроль 4,17-1012±0,63 10,44-109±0,42 3,38-109±0,29 6,50-109±0,34 0,344-109±0,041
1 час 4,25-1012±0,09 9,69 1 09±0,13 3,44-109+0,08 4,61-109±0,07 0,333-109±0,011
5 сут 3,83-1012±0,03 4,81-109±0,22* 2,75-109±0,12* 3,84-109±0,17* 0,308-109+0,012
10 сут 3,38-1012±0,10* 6,46-109±0,21* 3,23-109±0,11 3,08-109±0,12* 0,328-109+0,014
15 сут 4,06-1012±0,14 8,50-109±0,44 3,27-109±0,88 4,46-109±0,33 0,352-109±0,024
30 сут 4,28-1012±0,21 11,44-109+0,43 3,76-109±0,14 7,34-109±0,46 0,401-109+0,013
Примечание: здесь и далее * — р < 0,05 по отношению к контролю
снижению активности АМФ-дезаминазы и повышению активности 5'-нуклеотидазы.
АМФ-дезаминазная активность в отсутствии АТФ повышается только на 5-е сутки после отравления почти в 1,4 раз по сравнению с контролем. В последующие сроки после отравления активность этого фермента спадает. В присутствии АТФ активность этого же фермента повышается уже на первые сутки после отравления газоконденсатом, максимальная активность, которой, приходится на 10-е сутки после отравления и превышает контрольных значений почти в 1,7 раз (рис.1, 2, табл. 2).
В противоположность АМФ-дезаминазе, активность 5'-нуклеотидазы при отравлении газоконденсатом, снижается. В отсутствии АТФ активность 5'-нуклеотидазы уже на первый час после отравления снижается на 37% по сравнению контролем, а в присутствии АТФ максимальное снижение активности наблюдается на 1-е сутки, почти на 38% ниже контрольных значений (рис. 1, 2, табл. 2).
В норме в печени крыс, так же как и в сыворотке крови активность вышеназванных ферментов иногда проявляет себя сходным образом. К примеру, в этих тканях в норме АМФ-дезами-назная активность значительно ниже активности 5'-нуклеотидазы [8]. При отравлении газоконденсатом наблюдается снижение 5'-нуклео-
тидазной активности во фракции митохондрий печени крыс и повышение в постмитохондри-альном супернатанте. Активность АМФ-дезами-назы в печени крыс при отравлении газоконденсатом повышается [7].
Активность прямой аденилаткиназы после отравления газоконденсатом повышается с максимумом активности на 1-е сутки после отравления, превышая величины контрольной активности почти в 2 раза (рис. 1). Активность обратной аденилаткиназы в динамике острого отравления газоконденсатом изменяется менее выраженно, чем активность других исследованных ферментов (рис. 2).
В более поздние сроки после отравления наблюдается тенденция к нормализации активности всех выше названных ферментов.
Угнетение 5'-нуклеотидазы на 1-й час после отравления может повлечь сначала накопление АМФ, который тут же будет вовлекаться в прямую аденилаткиназную реакцию для реутилизации АДФ, максимальная интенсивность которой наблюдается на 1-е сутки после отравления (на 86% превышая исходную интенсивность). Часть АМФ продолжает катаболизироваться через дезаминирование, интенсивность которого максимально увеличивается на 5-е сутки после отравления. Это может способствовать нако-
Таблица 2
Активность АМФ-дезаминазы, 5'-нуклеотидазы и аденилаткиназы в сыворотке крови
при отравлении газоконденсатом (мкг АМФ/мл сыворотки, мкг Р1/мл сыворотки, мкмоль НАДН (или НАДФ+)/мл сыворотки,М±т; п = 8)
Время после отравления АМФ-дезаминаза 5'-нуклеотидаза Аденилаткиназа
без АТФ с АТФ без АТФ с АТФ прямая обратная
Контроль 5,55+0,19 3,76+0,23 29,47+0,83 42,70+1,43 0,98+0,08 0,51+0,04
1 час 5,53+0,18 3,79+0,23 18,57+0,92* 29,88+1,57* 0,95+0,08 0,49+0,04
1 сут 5,55+1,02 5,28+0,63 21,82+2,05* 26,09+2,50* 1,83+0,21* 0,53+0,02
5 сут 7,70+0,91* 5,63+0,57 27,67+1,01 41,67+2,91 1,64+0,24* 0,50+0,03
10 сут 4,54+0,74 6,23+0,42 31,60+1,36 44,85+0,68 1,12+0,13 0,52+0,03
15 сут 4,59+0,12 5,91+0,40 33,16+1,32 41,93+2,11 1,03+0,09 0,54+0,04
1-е сутки
5-е сутки
10-е сутки 15-е сутки
□ АМФ-дезаминаза
время после отравления
□ 5'-вуклеотидаза
Рис. 1. Активность АМФ-дезаминазы (без АТФ), 5'-нуклеотидазы (без АТФ) и аденилаткиназы (прямая реакция) в сыворотке крови крыс
1-е сутки
5-е сутки
□ АМФ-дезаминаза
время после отравления
□ 5'-нуклеотидаза
Рис. 2. Активность АМФ-дезаминазы (с АТФ), 5'-нуклеотидазы (с АТФ) и аденилаткиназы (обратная реакция) в сыворотке крови крыс
плению ИМФ, являющимся предшественником самого АМФ и других пуриннуклеотидов. Возможно, этим и объясняется достаточно высокая интенсивность прямой аденилаткиназной реакции на 5-е сутки после отравления.
Таким образом, клетка стремится восполнить запас АТФ, израсходованной при воздействии токсиканта, через реутилизацию в прямой аде-нилаткиназной реакции.
Список литературы
1. Грачев В.А., Ахметханов С.М. Основные экологические проблемы нефтегазового комплекса России //Доклады международного экологического конгресса «Новое в экологии и безопасности жизнедеятельности». — СПб.: Изд-во БГТУ, 2000. — С. 418-421.
2. Кост Е.А. Справочник по клиническим лабораторным методам исследования. — М.: Медицина, 1975. — 382 с.
3. Кочетов ГА. Практическое руководство по энзимологии. — М.: Высшая школа, 1980. — 272 с.
4. Западнюк И.П., Западнюк В.И., За-хария Е.А. и др. Лабораторные животные. Разведение, содержание, использование в эксперименте. — Киев: Вища школа, 1983.
- 383 с.
ВАденилатюшаза 5. Луговская С.А., Морозова В.Т., Поч-
тарь М.Е. Лабораторная гематология. — М.: ЮНИМЕД, 2002. — 116 с.
6. Мелконян Р.Г. Экологические проблемы восстановления нефтегазового комплекса Чеченской республики // Защита окружающей среды в нефтегазовом комплексе, 2001. — № 3—4. — C. 39—42.
7. Нагиев Э.Р., Евсеева С.Н., Сейфадди-нова М.С. Воздействие экстремальных факторов на метаболизм и некоторые пути направленной коррекции // Экология промышленного производства — межотр. науч. -практ. журнал, 2005. — Вып. 1. — С. 49-51.
8. Нагиев Э.Р., Сейфаддинова М.С., Сыпченко В.И. Активность ключевых ферментов обмена адениловых нуклеотидов в печени крыс//Материалы VII-й междунар. конф. «Циклы». — Ставрополь, 2005. — Т. 3.
— С. 162-164.
9. Пеккель В.А. Аденилатдезаминаза тканей животных // Успехи современной биологии, 1980. — Т. 89. — № 3. — С. 377-393.
10. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. — М: Издательство Медиа Сфера, 2002. — 312 с.
11. Скулачев В.П. Соотношение окисления и фосфорилирования в дыхательной цепи. — М.: Изд. АН СССР, 1962. — 152 с.
12. Шестакова С.А. Содержание компонентов адениловой системы и активность аденилаткина-зы в лейкоцитах экссудата кроликов // Укр. био-хим. журнал, 1972. — Т. 44. — № 3. — С. 369-371.
13. Lamprechtet W, Trautschold I. Methods of Enzymatic Analysis. — London: Acad. Press, 1963. — 543p.
Материал поступил в редакцию 23.03.07.
10-е сутки 15-е сутки
В Аденилаткиназа
1 час
контроль
1 час
контроль
E.R.Nagiyev, M.S.Seyfadinova, F.E.Ismailova
CATABOLISM AND REUTILIZATION OF ADENILE NUCLEOTIDES IN RATS BLOOD SERUM AT ACUTE POISONING BY GAS CONDENSATE
State Medical Academy of Dagestan, Makhachkala
Are presented results of the study on activity of key enzymes of catabolism and reutilization of adenile nucleotides (AMP-deam-inase, 5'-nucleotidase, adenylate kinase)in the serum of rats one-time poisoned by the gas condensate. The most expressive changes in the activity of enzymes were noticed on the 5th to 10th days after poisoning. An increasing activity of AMP-deaminase and direct adenylate kinase were observed, while the activity of 5'-nucleotidase lowered.
