CC BY
4
УДК 615.281.9
Вяткина А.С., Ершов В.А.
КАРБОНАТ -СТАБИЛИЗИРОВАННЫЕ НАНОЧАСТИЦЫ СЕРЕБРА КАК ИНГИБИТОР РОСТА БАКТЕРИЙ
Вяткина Анна Сергеевна - студентка бакалавриата 4-го года обучения кафедры ЮНЕСКО «Зеленая химия для устойчивого развития»; [email protected]
Ершов Вадим Алексеевич - аспирант 3-го года обучения кафедры ЮНЕСКО «Зеленая химия для устойчивого развития»;
ФГБОУ ВО «Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева», Россия, г. Москва, 125047, Миусская площадь, дом 9.
Целью работы является установление ингибирующих концентраций наночастиц серебра, полученных фотохимическим восстановлением ионов серебра оксалат-ионами в водном растворе для грамотрицательной бактерии Escherichia coli и грамположительной Paenibacillus jami Для исследования ингибирующего действия полученных наночастиц серебра использовали метод оптической спектрофотометрии, а также диско-диффузионный метод. Было обнаружено, что наночастицы эффективно подавляют рост клеток бактерий Escherichia coli и Paenihacillus jamilae. В будущем карбонат-стабилизированные наночастицы серебра могут быть использованы в качестве антимикробного агента.
Ключевые слова: наночастицы серебра; оксалат-ионы; ингибитор роста; антибактериальное действие; зеленая химия.
CARBONATE-STABILIZED SILVER NANOPARTICLES AS A BACTERIAL GROWTH INHIBITOR
Vyatkina A.S., Ershov V.A.
Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russian Federation
The aim of the work was to establish inhibitory concentrations of silver nanoparticles obtained by photochemical reduction of silver ions by oxalate ions in aqueous solution on gram-negative Escherichia coli and gram-positive Paenibacillus jamilae cells. To study the inhibitory effect of the obtained silver nanoparticles, the method of optical spectrophotometry and the disc diffusion method were used. It was found that nanoparticles inhibit the growth of Escherichia coli and Paenibacillus jamilae bacteria cells. Carbonate-stabilized silver nanoparticles could be used as an antimicrobial agent in the future.
Keywords: silver nanoparticles; oxalate ions; growth inhibitor; antibacterial effect; green chemistry.
Введение
В настоящее время наночастицы (НЧ) металлов и их соединений нашли широкое применение в различных сферах деятельности. Особое внимание уделяется НЧ серебра, которые, в свою очередь, характеризуются высокой антибактериальной активностью, что связано с возможностью подавлять жизнедеятельность опасной для здоровья людей микрофлоры. При этом НЧ серебра являются гипоаллергенными [1].
НЧ, используемые в данной работе, имеют ряд преимуществ: высокая устойчивость, маленький размер - ~20-25 нм с учетом тонкого карбонатного стабилизирующего слоя. Для их получения используется нетоксичный восстановитель - оксалат-ионы. Применяемый чистый гидрозоль серебра содержит НЧ серебра и стабилизирующие их карбонат-ионы. При этом исключается воздействие токсичных примесей, поскольку в качестве стабилизатора выступают карбонат-ионы, входящие в состав природной воды. Полученная система может быть использована в качестве дезинфицирующего раствора, а способ ее получения отвечает принципам зеленой химии [2].
Ранее методами флуоресцентной микроскопии и ПЭМ было показано, что карбонат-стабилизированные частицы обладают антибактериальными свойствами по отношению к клеткам Escherichia coli [3]. Актуальным является изучение ингибирующей активности
карбонат-стабилизированных наночастиц серебра.
Цель работы - установление ингибирующих концентраций карбонат-стабилизированных
наночастиц серебра для клеток грамотрицательной бактерии Escherichia coli и грамположительной Paenibacillus jamilae.
Материалы и методы
Гидрозоль серебра получали ранее разработанным методом восстановления ионов серебра Ag+ карбоксильными анион-радикалами СОт , образующимися в результате распада оксалат-ионов C2O4- под воздействием УФ-света. Для этого смесь водных растворов перхлората серебра AgClO4 (З^Ю-4 моль/литр) и оксалата калия K2C2O4 (5Х10-4 моль/литр) подвергали УФ-облучению в присутствии кислорода воздуха. В результате были получены НЧ размером ~ 22 нм. Подробное описание метода получения и свойств наночастиц описаны в работе [3].
Для установления ингибирующего действия полученных НЧ серебра использовался метод оптической спектрофотометрии микробной культуры, основанный на измерении оптических спектров клеток, выращенных в присутствии и в отсутствие (контроль) наночастиц серебра в жидкой питательной среде. Растворы гидрозоля различных концентраций вносили во флакон с питательной средой одновременно с микробной суспензией. Выращивание клеток проводили при T = 298K. Через сутки была измерена оптическая плотность при X = 550 нм.
Также использовали диско--диффузионный метод (ДДМ), основанный на определении наличия или отсутствия зоны подавления роста клеток, благодаря чему можно определить устойчивость бактерий к НЧ серебра. Для ДДМ использовали твердую питательную среду (агар). Растворы гидрозоля наносились сразу после заселения микробов. Время экспозиции - 24 часа.
В качестве тест-объекта выбраны грамотрицательная бактерия Escherichia coli, штамм К-12 MG1655, и грамположительная бактерия Paenibacillus jamilae. Для эксперимента на жидких питательных средах использовали среду Adkins [4] и ее модифицированные версии (М1 и М2) [3]. Состав сред представлен в таблице 1.
Таблица 1. Состав питательных сред
Вещество Adkins (г/л) Adkins M1 (г/л) Adkins M2 (г/л) Агар (г/л)
Пептон 1 1 1 5
Дрожжевой экстракт 1 1 1 2,5
Глюкоза 2 2 2 1
NH4NO3 - 1 1 -
NaHCOs - 0,4 0,4 -
NaNO3 1 1 1 -
Na2SO4 0,8 0,8 - -
MgSO4 0,1 0,1 - -
NH4C1 1 - - -
NaCl 0,8 - - -
KCl 0,1 - - -
KH2PO4 0,6 - - -
K2HPO4 1 - - -
Агар - - - 10
Результаты
На среде при данных концентрациях
ингибирование роста бактерий не наблюдалось (рис. 1).
1
80
ё 70
I-
(D
ц 60
О
ш 50 о
¥ 40
о 30 20 10 о
t I
1
1СГ7
106 10s log [Ад] моль/литр
1СГ4
Рис. 1. Влияние различных концентраций серебра на ингибирование роста количества клеток Escherichia coli на среде Adkins В составе используемой питательной среды присутствуют различные соли, в том числе хлориды (NaCl, KCl, NH4CI), с которыми в первую очередь связывается серебро и выпадает в осадок, в последствии, никак не реагируя на клетки бактерий, то
есть, практически не участвуя в ингибировании роста, как и было предположено.
На среде М1 и М2 с увеличением
концентрации гидрозоля, замедлялся рост клеток (рис. 2-3).
100-, 9080-е70:
jT
О
fe 60-
f
50 ■
о и
ё 40 т S
с о
302010-
10
10"6
10'5
log [Ад] моль/литр Рис. 2. Влияние различных концентраций серебра на ингибирование роста количества клеток Escherichia coli на модифицированной среде Adkins Ml
100 л
60-
Ф 60'
ü
Ф 40
с
£
20-
I- )
ю-'
10 10' log [Ад] моль/литр
Рис. 3. Влияние различных концентраций серебра на ингибирование роста количества клеток Escherichia coli на модифицированной среде Adkins M2
Были установлены концентрации
полумаксимального ингибирования, на Adkins М1 она составила 4*10-6 моль/литр, а на среде Adkins М2 -2*10-5 моль/литр. Данные результаты коррелируют с ранее полученными в других исследованиях результатами методом флуоресцентной микроскопии
[3].
Методом оптической спектрофтометрии было установлено, что в среде Adkins М1 концентрация полумаксимального ингибирования (IC50) роста клеток E. coli для карбонат-стабилизированных НЧ составляет 4*10-6 моль/литр, а в среде Adkins М2 - 2*10-5 моль/литр. В среде Adkins концентрация полумаксимального ингибирования достигнута не была. Для ингибирования роста клеток в среде Adkins
требуются гораздо большие концентрации НЧ серебра. Это обусловлено присутствием различных солей, с которыми связывается серебро, выпадающее при этом в осадок и, как следствие, не реагирующее с клетками. При концентрации 3*10-5 моль/литр наночастицы серебра в стандартной среде Adkins подавляют рост только на 25% по сравнению с контролем, в Adkins М1 - на 70%, в Adkins М2 на 85%.
Диско--диффузионным методом было установлено, что НЧ ингибируют рост клеток Escherichia coli и Paenibacillus jamilae при концентрациях в диапазоне 1Х10-4 - 1х10-5 моль/литр.
Исходя из полученных данных, можно сделать вывод о том, что у данного микроорганизма нет
Совокупность полученных данных показывает, что синтезированные гидрозоли серебра обладают высокой антибактериальной активностью. Наиболее эффективными являются НЧ серебра, представленные в исследовании А. Дрор-Эре и Шин Вун Ким, но, в свою очередь, они синтезируются с различными токсичными примесями, что существенно сужает область их применения в различных полезных для человека целях.
Механизм действия объясняется теорией, согласно которой НЧ и ионы серебра действуют комплексно. Ионы серебра нарушают биохимические процессы, подавляя тем самым жизнедеятельность клеточных структур, а также при электрохимическом окислительном растворении НЧ, помимо выхода ионов серебра, также образуются активные формы кислорода, которые могут индуцировать окислительный стресс.
Гидрозоль, представленный в данной работе, представляет собой экологически безопасный материал, содержащий НЧ серебра и анионы угольной кислоты (в основном бикарбонат-анионы), то есть не включает использование посторонних токсичных примесей и максимально соответствуют по своему составу природной воде. Благодаря этому, область их применения существенно расширяется. Например, их можно применять для создания антимикробного материала, который также будет иметь широкое применение. Также их можно использовать для создания препаратов, применяемых для борьбы с инфекциями, представляющими опасность для человека. В этом плане НЧ серебра представляют большой интерес, поэтому необходимо изучать различные стороны их действия, например, как они будут реагировать с различными компонентами окружающей среды, попав в нее, их токсичность и безопасность для природы и человека в том числе. В
устойчивости к НЧ серебра.
Обсуждение
Результаты многих исследований показывают, что НЧ серебра обладают ингибирующими свойствами. Анализ данных о влиянии серебра на жизнедеятельность бактерий, представленных в таблице 2, указывает на то, что ингибирующие концентрации НЧ серебра составляют 2-10 мкг/мл. Данные в публикациях разнятся, что объясняется использованием наночастиц различных размеров, стабилизаторов и прочих экспериментальных условий. Полученные значения для карбонат-стабилизированных наночастиц в целом согласуются с данными полученными другими авторами.
Таблица 2. Ингибирующие концентрации НЧ серебра
данном исследовании было продемонстрировано, что в более богатых средах, т.е. содержащих большее количество солей, наночастицы серебра показывали меньшую эффективность, ввиду связывания с солями.
Исследование направлено на достижение Цели устойчивого развития №3: Обеспечение здорового образа жизни и содействие благополучию для всех в любом возрасте.
Список литературы
1. Sohrabnezhad S. et al. Study of antibacterial activity of Ag and Ag2CO3 nanoparticles stabilized over montmorillonite // Spectrochim. Acta Part A Mol. Biomol. Spectrosc. 2015. Vol. 136. P. 1728-1733.
2. Anastas P., Eghbali N. Green Chemistry: Principles and Practice // Chem. Soc. Rev. 2010. Vol. 39, № 1. P. 301312.
3. Ershov V. et al. Photochemical Synthesis of Silver Hydrosol Stabilized by Carbonate Ions and Study of Its Bactericidal Impact on Escherichia coli: Direct and Indirect Effects // Int. J. Mol. Sci. 2022. Vol. 23, № 2. P. 949.
4. Leonov K., Astashkina A., Bakibayev A. Gas Chromatographic Investigation of Oil Biodegradation Degree // Procedia Chem. 2014. Vol. 10. P. 504-507.
5. Dror-Ehre A. et al. Silver nanoparticle-E. coli colloidal interaction in water and effect on E. coli survival // J. Colloid Interface Sci. 2009. Vol. 339, № 2. P. 521-526.
6. Le A.-T. et al. Synthesis of oleic acid-stabilized silver nanoparticles and analysis of their antibacterial activity // Mater. Sci. Eng. C. 2010. Vol. 30, № 6. P. 910-916.
7. Li W.-R. et al. Antibacterial activity and mechanism of silver nanoparticles on Escherichia coli // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2010. Vol. 85, № 4. P. 1115-1122.
8. Kim S.W., Baek Y.-W., An Y.-J. Assay-dependent effect of silver nanoparticles to Escherichia coli and Bacillus subtilis // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2011. Vol. 92, № 5. P. 1045-1052.
Средний размер, нм Способ синтеза Эффект Автор исследования
7 Восстановление боргидридом МИК = 6 мкг/мл А. Дрор-Эре и др. [5]
9-10 Восстановление глюкозой МИК = 2 мкг/мл Ань-Туан Ле и др. [6]
5 AGS-WMB1000C МИК = 10 мкг/мл Вэнь-Ру Ли и др. [7]
10 Цитратный EC50 = 3 мкг/мл Шин Вун Ким и др. [8]
22 ± 3 Карбонатный IC25 = 3 мкг/мл (Adkins) IC70 = 3 мкг/мл (Adkins М1) IC85 = 3 мкг/мл (Adkins М2) Данные настоящей работы
