CC BY
20
ес
ая
УДК: 579.61
КАПСУЛООБРАЗОВАНИЕ КАК ФАКТОР СЕЛЕКЦИИ ФАГОРЕЗИСТЕНТНЫХ ШТАММОВ KLEBSIELLA SPP. У ДЕТЕЙ С ФУНКЦИОНАЛЬНЫМИ НАРУШЕНИЯМИ ОРГАНОВ ПИЩЕВАРЕНИЯ
Григорова Е. В.1, Немченко У. М.1, Ракова Е. Б.1-2, Савелькаева М.В1, Сердюк Л.В1.
1 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека»
2 Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Иркутский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации
CAPSULE FORMATION AS A SELECTION FACTOR OF PHAGORESISTENT KLEBSIELLA SPP. STRAINS AMONG CHILDREN HAVING FUNCTIONAL INTESTINAL DISORDERS
Grigorova E. V.1, Nemchenko U. M.1, Rakova E. B1- 2, Savel'kaeva M.V1, Serdyuk L.V1.
1 «The Scientific Center of Family Health and Human Reproduction Problems» of Siberian Brunch of RAMS
2 Irkutsk State Medical University
Григорова Екатерина Владимировна — м.н.с. лаборатории микроэкологии и микробиома Немченко Ульяна Михайловна — к.б.н., м.н. с. лаборатории микроэкологии и микробиома
Ракова Елена Борисовна — к.б.н., н.с. лаборатории микроэкологии и микробиома; доцент кафедры микробиологии вирусологии и иммунологии с курсом клинической лабораторной диагностики Савелькаева Марина Владимировна — гастроэнтеролог, врач педиатр высшей категории Сердюк Людмила Викторовна — к.б.н., н.с. лаборатории микроэкологии и микробиома
Резюме
В данной работе была изучена зависимость фагорезистентности к лечебным препаратам бактериофагов от капсуло-образования у штаммов Klebsiella spp., изолированных из кишечника 50-ти детей в возрасте до года. Выявлено, что 60,0% исследуемых штаммов бактерий имели капсулы, из которых 23 культуры принадлежали виду K.pneumoniae (46,0%), и 7 — K.oxytoca (14,0%). Анализ взаимосвязи между наличием капсулы и чувствительности к бактериофагам показал, что 71,4% штаммов K^xytoca и 69,6% штаммов K.pneumoniae резистентных к бактериофагам были капсуль-ными. Выявлена прямая, средняя достоверная корреляционная связь, отражающая увеличение фагорезистентности при образовании бактериями капсульных форм. Коэффициент корреляции (r) для фагорезистентных штаммов составил +0,355, для слабочувствительных —+0,491 при достоверности коэффициента корреляции (mr) p>95,0%. Показано, что у детей с функциональными нарушениями органов пищеварения выявлялся высокий процент капсульных штаммов клебсиелл, что способствовало формированию резистентности к лечебным бактериофагам
Ключевые слова: бактериофаги, капсульные типы, резистентность, Klebsiella spp. Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология 2016; 136 (12): 9-12
Summary
This research demonstrated phagoresistence dependency of bacteriophages depending on capsule formation of Klebsiella spp. strains isolated from 50 children's intestines that were younger than 1 year of age. It was identified that 60% of researched strains had capsules, 23 strains of which were K.pneumonia (46%), and 7 — K.oxytoca (14%). Analysis of interaction between capsule occurrence and bacteriophages sensitivity demonstrated that 71.4% of K.oxytoca strains and 69.6% of K.pneumoniae strains resistant to bacteriophages were capsular.Direct average reliable connection, demonstrating increase of phagoresistence while forming capsular forms by bacteria, had been identified. Correlation factor for phagoresistent strains was +0.335; for low
Григорова
Екатерина Владимировна
Grigorova Ekaterina V. buxarowa.ekaterina@yandex.ru
экспериментальная и клиническая гастроэнтерология | выпуск 136 | № 12 2016
клинические наблюдения | clinical case
sensitive strains- +0.491 (correlation factor authenticity (mr) p >95,0%. It was identified that children having functional intestinal disorders, demonstrated high percentage of capsular Klebsiella strains that led to forming of bacteriophages resistance.
Key words: bacteriophag, capsular types, Klebsiella spp., resistans Eksperimental'naya i Klinicheskaya Gastroenterologiya 2016; 136 (12): 9-12
Бактерии рода Klebsiella spp. сем. Enterobacteria-ceae являются представителями факультативной микрофлоры толстого кишечника и довольно часто в значительном количестве (104-105 микробных клеток на 1 г фекалий) выделяются как у здоровых детей, так и при дисбиозах кишечника [1,2, 3].
Дети первого полугодия жизни особенно подвержены дисбиотическим изменениям в составе микрофлоры кишечника, что обусловлено транзиторной ферментной недостаточностью (в основном лактазы), незрелостью вегетативной нервной системы, регулирующей моторику кишечника, незрелостью иммунных механизмов. Дисбиоз кишечника, приводя к нарушению микроэкологического баланса, является одним из ведущих звеньев патогенеза функциональных нарушений (ФН) пищеварения детей раннего возраста. У детей с ФН желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) отмечаются нарушения в составе микрофлоры кишечника с высокой частотой индикации условно-патогенной микрофлоры (УПМ) семейства Enterobacteriacea на фоне дефицита бифидобакте-рий и лактобацилл [4,5]. По мнению исследователей [6], при увеличении плотности популяции клебсиелл необходима элиминирующая терапия. Применение для этой цели антибиотиков, особенно в детской практике, неоправданно ввиду
подавления нормальной микрофлоры и других побочных эффектов. Использование для элиминации условного патогена бактериофагов, которые, обладая высокой специфичностью, не подавляют нормальную микрофлору и не нарушают естественный баланс внутренней среды организма, явилось бы одним из путей решения этой проблемы [7]. Являясь безвредным биологическим методом лечения, фаготерапия может применяться у детей раннего возраста [8]. Однако по нашим данным региональные штаммы клебсиелл обладают низкой чувствительностью к лечебным бактериофагам [9]. Одним из препятствий для реализации рецептор-ного взаимодействия фагов с микробной клеткой является капсулообразование у представителей рода Klebsiella. Клебсиеллы способны образовывать серотипоспецифический гликополимер — капсуль-ный полисахарид, называемый K-антигеном, окружающий клетку, противодействующий активации системы комплимента, затрудняющий фагоцитоз макрофагами и препятствующий проникновению лечебных препаратов в клетку.
Таким образом, цель работы состояла в изучении резистентности капсульных и бескапсульных штаммов клебсиелл, изолированных из кишечника детей с функциональными нарушениями органов пищеварения, к лечебным бактериофагам.
Материалы и методы
Материалом для исследования служили фекалии 50 — ти детей первого года жизни с ФН ЖКТ при индикации в них клебсиелл в титре >104 КОЕ/г. Диагноз ФН ЖКТ был установлен врачом-гастроэнтерологом. Клинически отмечались расстройства дефекации (запоры, разжиженный стул), колики, срыгивания, продолжительностью не менее двенадцати недель за период наблюдения.
Исследования микрофлоры кишечника проводились по стандартной методике, оценка результатов — в соответствии с ОСТ 91 500.11.0004-2003. Выделенные микроорганизмы идентифицировали по морфологическим, тинкториальным, культуральным и биохимическим свойствам с использованием АР1-систем.
Литическая активность специфических бактериофагов в отношении клебсиелл определялась
с использованием коммерческих препаратов — очищенному бактериофагу клебсиелл пневмонии, очищенному бактериофагу клебсиелл поливалентному и пиобактериофагу поливалентному «Секста» российского производства. Оценка чувствительности проводилась методом «крестов» согласно Методическим указаниям [10]. В работе были протестированы культуры двух клинически значимых видов: K.pneumoniaе и K^xytoca.
Для выявления капсулы был использован специальный метод окраски Бурри — Гинса.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы Excel из пакета MS Office 2003. Вычисляли коэффициент корреляции (r) и оценку его достоверности (mr).
Результаты исследования их и обсуждение
Результаты исследования показали, что высокий уровень чувствительности (3Х — 4Х) у штаммов Klebsiella spp. к моновалентному и поливалентному бактериофагам наблюдался лишь в 8,0±5,4% случаев. Слабую чувствительность (2Х) регистрировалась
в 24,0±8,5% случаев к бактериофагу поливалентному (K.оxytoca) и в 16,0±7,3% к фагу клебсиелл пневмонии (K.рneumoniaе). 68,0±9,3% K.оxytoca и 76,0±8,5% K.рneumoniaе были не чувствительны (0-1Х) к бактериофагу поливалентному и фагу клебсиелл пневмонии.
капсулообразование как фактор селекции фагорезистентных штаммов klebsiella spp. | capsule formation as a selection factor of phagoresistent klebsiella spp.
Рисунок 1.
Характеристика чувствительности штаммов Klebsiella spp. к лечебным бактериофагам (%)
Капсульные варианты
Чувствительность к бактериофагу Бактериофаг поливалентный Бактериофаг клебсиелл пневмоний Бактериофаг Секста
Klebsiella oxytoca Klebsiella pneumoniae Klebsiella oxytoca Klebsiella pneumoniae
0-1Х 71,4 78,3 71,4 60,9
2Х 14,3 13,0 14,3 26,1
3-4Х
Таблица 1
Чувствительность бактерий рода Klebsiella к лечебным бактериофагам в зависимости от капсулообразования (%)
14,3
8,7
14,3
13,0
Уровень чувствительности к бактериофагам бактерий Коэффициент Достоверность коэффициента
рода Klebsiella при условии наличия у них капсул (n=30) корреляции (r) корреляции (mr)
0-1Х +0,355* p>95,0%
2Х +0,491* p>99,9%
3-4Х +0,058** p<95,0%
Более чем половина штаммов K.oxytoca и K. pneumoniae были фагоустойчивы (не чувствительны) к секстафагу (60,0±9,8% и 56,0±9,9% случаев соответственно). Слабый уровень чувствительности наблюдали у четверти исследуемых штаммов K.oxytoca и K^neumoniae (20,0±8,0% и 28,0±8,9% случаев соответственно).
Отмечен более высокий уровень чувствительности выделенных культур к секстафагу: высокий уровень чувствительности показали 20,0±8,0% штаммов K.oxytoca, и 16,0±7,3% штаммов K.pneumoniae (рис.1).
Примечание: 0-1Х — отсутствие литической активности или низкая активность; 2Х — образование зоны лизиса с большим количеством колоний вторичного роста бактерии; 3Х — зона лизиса с единичными колониями вторичного роста; 4 Х — прозрачная зона лизиса без колоний вторичного роста.
Параллельно все штаммы тестировались на наличие капсулы. Капсулы были обнаружены у 60,0% исследуемых штаммов бактерий, из которых 23 культуры принадлежали виду K.pneumoniae (46,0%), и 7 — K.oxytoca (14,0%).
Анализ взаимосвязи между наличием капсулы и чувствительности к бактериофагам показал, что 71,4% нечувствительных к бактериофагу поливалентному и секстафагу (0-1Х) штаммов K^xytoca имели капсулу. А резистентные к фагу клебсиелл пневмонии штаммы K.pneumoniae обладали капсулой в 78,3%, к секстафагу в 60,9% случаев.
При слабом уровне чувствительности к фагам (2Х) процент встречаемости капсульных форм был
равен 14,3% у штаммов K.oxytoca и 13,0% у штаммов K.pneumoniae (к бактериофагу клебсиелл пневмонии). При уровне 2Х к секстафагу капсулы были обнаружены у 26,1% штаммов K.pneumoniae.
При высоком уровне чувствительности к воздействию бактериофагов поливалентного и секста капсулы определяли у 14,3% у штаммов K^xytocay штаммов K^neumoniae капсулы выявили в 8,6 и 13,0% случаев (фаг клебсиелл пневмонии и секста соответственно) (Табл. 1).
Нами было проанализировано наличие корреляционной связи между наличием капсулы у клебсиелл и уровню чувствительности к бактериофагам. Выявлена прямая, средняя и достоверная корреляционная связь, отражающая увеличение фагорезистентности при образовании бактериями капсульных форм (табл. 2).
В настоящее время уже доказано, что капсула является основным фактором вирулентности K.pneumoniae и капсульные типы вызывают более тяжелые инфекции. Мониторинг распространенности капсульных типов K.pneumoniae в каждом связанном с болезнью случае может иметь решающее значение для лечения и профилактики. Выявлено существование 79 капсульных сероваров, показано сходство капсульных антигенов кишечной палочки и K. рneumoniaе, что свидетельствовало о горизонтальном переносе генов между этими двумя близкородственными видами [11,12].
В нашем исследовании показано, что у детей, страдающих ФН ЖКТ, выявлялся высокий процент капсульных штаммов клебсиелл. Наличие капсулы коррелировало с резистентностью к лечебным
Таблица 2
Корреляционная связь между наличием капсулы у клебсиелл и уровню чувствительности к бактериофагам.
Примечание:
+г — прямая связь; * — от +0,699 до +0,3 (средняя сила корреляционной связи); ** — от +0,299 до 0 (слабая сила корреляционной связи).
экспериментальная и клиническая гастроэнтерология | выпуск 136 | № 12 2016
клиническая гастроэнтерология | clinical gastroenterology
бактериофагам, что требовало внимательного подхода к выбору препаратов для селективной деконтаминации. Особенно устойчивыми к действию бактериофагов были штаммы К.рпеитотае (до 76,0±8,5% культур), из них капсулой обладали 46,0%. Штаммы K.оxytoca, которые, по данным литературы, находятся на втором месте по частоте встречаемости у госпитализированных пациентов и вирулентные свойства которых ещё мало изучены [13], обладали капсулой только в 14% случаев и были более чувствительны к действию бактериофагов. Резистентность и слабый уровень чувствительности к бактериофагам (0-1Х, 2Х) были характерны, как правило, для капсульных штаммов (от 14,3% у K.oxytoca до 78,3% у K.pneumoniae).
Фагорезистентные клебсиеллы уже выявлены в ряде регионов нашей страны [2,6]. По мнению Завгородней Е. Ф.(2013) можно с большой долей вероятности полагать, что инфицирование клеб-сиеллами происходит в период пребывания детей в родильном доме, где циркулируют госпитальные фагорезистентные штаммы. Это обстоятельство и приводит к дальнейшей селекции резистентных бактерий. Этот вопрос требует должной проработки и активной деятельности по включению в состав лечебных препаратов новых региональных рас фагов [2,14].
Развитие резистентности к определенной расе фага, в основном, отражает потерю микробом специфического рецептора в результате мутации, и эта потеря часто оказывает отрицательное действие на саму бактерию, не защищая ее от многих других фагов, использующих иные рецепторы. Более того, вновь появляющиеся резистентные бактерии лишаются капсулы и становятся менее вирулентными.
Бактерии не имеют общих механизмов устойчивости к антибиотикам и фагам, следовательно, в тяжёлых случаях могут применяться комбинации «антибиотик + бактериофаг», что особенно эффективно для разрушения микробных биопленок. Кроме того, в эксперименте убедительно показано, что комбинированное применение антагонистов железа и бактериофага препятствовало формированию биопленки K.pneumoniae. При этом отмечалось достоверное уменьшение численности микробной популяции и уменьшение числа «молодых» клеток [15].
Таким образом, учитывая, что фаготерапия является наиболее безопасным методом коррекции дисбиотических нарушений у детей с ФН ЖКТ, необходимо детальное изучение фагочувствитель-ности представителей условно-патогенной микрофлоры с учетом индивидуальных особенностей каждого конкретного пациента, основываясь на принципах персонифицированной медицины.
Список литературы
1. Николаева И. В., Анохин В. А., Халиуллина С. В. Референтные значения состава кишечной микрофлоры у детей раннего возраста. Практическая медицина. — 2012. № 7(62). С. 114-117.
2. Завгородняя Е. Ф., Сташкевич Л. А., БитусЕ. А. Характеристика кишечных микробиоценозов у детей с дисбиотическими нарушениями. Дальневосточный Журнал Инфекционной Патологии. —2010. № 17. С. 148-152.
3. Ракова Е. Б. Современная структура кишечного микробиоценоза у детей Иркутской области: дис... канд. биол.наук: 03.02.03; Ракова Елена Борисовна. Иркутск. —2010. 192 с.
4. Немченко У. М., Попкова С. М., Горбунова Е. Л., Петрова И. В., Ракова Е. Б., Иванова Е. И., Шабанова Н. М., Савелькаева М. В. Микроэкологический пейзаж кишечного биоценоза у детей с функциональными нарушениями желудочно-кишечного тракта. Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра Сибирского отделения Российской академии медицинских наук. — 2011. № 5. С. 89-93.
5. Васечкина Л. И., Тюрина Т. К. Функциональные нарушения органов пищеварения у детей — алгоритмы диагностики и подходы к лечению. Альманах клинической медицины. 2012. № 27. С. 3-8.
6. Зинин-Бермес Н.Н., Кочемасова О. И., Муратова Р. Н., Ильина Н. А., Вязьмина Г. И. Взаимодействие клебсиелл с коммерческим бактериофагом в кишечнике детей. Журн. Мать и дитя в Кузбассе. —2005. № 3 (22). С. 30-31.
7. Красильников И. В., Лыско К. А., Отрашевская Е.В, Лобастова А. К. Препараты бактериофагов: краткий обзор современного состояния и перспектив развития. Сибирский медицинский журнал. —2011. Том 26, № 2. Выпуск 2. С. 33-37.
8. Щербенков И. М. Бактериофаги. Что мы знаем о них? Современные возможности фаготерапии в практике
врача-педиатра. Медицинский Совет. —2013. № 2. С. 56-62.
9. Бухарова Е. В., Долгих В. В., Попкова С. М., Ракова Е. Б., Шабанова Н. М., Немченко У М., Иванова Е. И., Сердюк Л. В. Патогенный потенциал Klebsiella spp. и Staphylococcus aureus при ассоциативном симбиозе у детей первого года жизни. Успехи современного естествознания. —2014. № 12-2. С. 20-24.
10. Асланов Б. И., Зуева Л. П., Кафтырева Л. А., Бойцов А. Г., Акимкин В. Г., Долгий А. А., Брусина Е. Б., Дроздова О. М. Рациональное применение бактериофагов в лечебной и противоэпидемической практике. Федеральные клинические (методические рекомендации). — Москва, 2014 г.
11. Yi-Jiun Pan, Tzu-Lung Lin, Yen-Hua Chen, Chun-Ru Hsu, Pei-Fang Hsieh, Meng-Chuan Wu, Jin-Town Wang. Capsular Types of Klebsiella pneumoniae Revisited by wzc Sequencing. PLOS ONE //www.plosone. —2013. № 8 (13). Р.1-13.
12. Pan YJ, Lin TL, Chen CT, Chen YY, Hsieh PF, Hsu CR, Wu MC, WangJT. Genetic analysis ofcapsular polysaccharide synthesis gene clusters in 79 capsular types of Klebsiella spp. Scientific Reports 5, Article number: 15573 (2015).
13. Ishihara Y., Yagi T., Mochizuki M., Ohta M. Capsular types, virulence factors and DNA types of Klebsiella oxytoca strains isolated from blood and bile. Kansenshogaku Zasshi. The Journal of the Japanese Association for Infectious Diseases. — 2012, 86(2). Р.121-126.
14. Завгородняя Е. Ф., Сташкевич Л. А. Чувствительность к бактериофагам и некоторые другие свойства условно-патогенной микрофлоры в структуре дисбиотических нарушений кишечника у детей и взрослых. Дальневосточный Журнал Инфекционной Патологии. — 2013. № 23. С. 46-50.
15. Захаренко С. М. Бактериофаги: современные аспекты применения, перспективы на будущее. Медицинский швет. —2013. № 10. С. 72-74.
