CC BY
42
УДК 612.337
КАЛИЕВЫЕ КАНАЛЫ В ЭФФЕКТАХ СЕРОВОДОРОДА НА СОКРАТИТЕЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ТОНКОГО КИШЕЧНИКА КРЫСЫ
Г.И. Сабируллина1, М.У. Шафигуллин1, Н.Н. Хаертдинов1, Р.А. Зефиров2, Г.Ф. Ситдикова1
1 Казанский федеральный университет Республиканская клиническая больница Минздрава РФ,
г. Казань E-mail: [email protected]
Сероводород - эндогенно синтезируемый газ, обладает расслабляющим действием на гладкомышечные ткани. Целью нашего исследования было исследование участия калиевых каналов в эффектах сероводорода на спонтанную сократительную активность тощей кишки крысы в изометрических условиях. Наши результаты показали, что донор сероводорода - гидросульфид натрия (NaHS) - в концентрациях от 10 до 200 цМ оказывал ин-гибирующее влияние на амплитуду, тоническое напряжение и частоту сокращения кишечника. Аналогичным эффектом обладал его эндогенный донор L-цистеин, а блокаторы синтеза сероводорода показали обратный эффект. Полученные данные в совокупности свидетельствуют о наличии эндогенного синтеза в ткани кишечника. Исследовали роль Са-активируемых, потенциал-зависимых и АТФ-зависимых калиевых каналов в эффектах газа. Было показано, что Са-активируемые и потенциал-зависимые калиевые каналы не принимали участия в эффектах сероводорода на амплитуду, тонус и частоту спонтанных сокращений, а активация АТФ-зависимых калиевых каналов опосредует его эффекты на тоническое напряжение гладкомышечных клеток кишечника.
Ключевые слова:
Сероводород, гладкомышечные клетки, тощая кишка, калиевые каналы.
H2S является эндогенно синтезируемым газом, регулирующим разнообразные физиологические функции, в том числе двигательную активность желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). Ферменты синтеза H2S были обнаружены в слизистой желудка [5], энтеральной нервной системе [10], а также в интерстициальных клетках Кахаля [16]. Помимо участия в регуляции двигательной активности в желудочно-кишечном тракте, показано участие H2S в ноцицепции, секреторной функции слизистой, в развитии воспалительных процессов [7, 16]. Данные о влиянии H2S на двигательную активность неоднозначны, выявлено расслабляющее действие этого газомедиатора в различных отделах ЖКТ у разных видов животных [4, 6, 8, 10, 15, 18]. Например, H2S ингибирует спонтанное или вызванное ацетилхо-лином сокращение подвздошной кишки у некоторых животных, в том числе у кроликов и морской свинки [8]. Однако имеются данные и о двойственной роли H2S в регуляции двигательной активности ЖКТ в зависимости от концентрации [19]. Механизмы действия H2S по данным
Ситдикова Гузель Фаритовна, д-р
биол. наук, профессор, зав. каф. физиологии человека и животных Института фундаментальной медицины и биологии Казанского федерального (Приволжского) университета.
E-mail: [email protected] Область научных интересов: нейробиология, физиология висцеральных функций, газотрансмиттеры.
Сабируллина Гулия Ильнатов-
на, аспирант каф. физиологии человека и животных Института фундаментальной медицины и биологии Казанского федерального (Приволжского) университета. E-mail: [email protected] Область научных интересов: физиология висцеральных функций, газотрансмиттеры. Шафигуллин Марат Ульфато-вич, магистрант каф. физиологии человека и животных Института фундаментальной медицины и биологии Казанского федерального (Приволжского) университета. E-mail: [email protected] Область научных интересов: физиология висцеральных функций, газотрансмиттеры. Зефиров Руслан Андреевич, канд. мед. наук, врач отделения абдоминальной хирургии Республиканской клинической больницы Минздрава РФ, г. Казань. E-mail: [email protected] Область научных интересов: физиология висцеральных функций, газотрансмиттеры Хаертдинов Наиль Назимович, канд. биол. наук, ассистент каф. физиологии человека и животных Института фундаментальной медицины и биологии Казанского федерального (Приволжского) университета.
E-mail: [email protected] Область научных интересов: физиология висцеральных функций, газотрансмиттеры.
разных авторов также неоднозначны. Ряд исследований указывает на то, что H2S активирует АТФ-зависимые К-каналы (КАТФ-каналы) [3, 6, 11, 17, 19]. Также эффекты H2S на сократительную активность связывают с взаимодействием с системой оксида азота [3, 6] и влиянием на внутриклеточные ферменты, регулирующие сократимость [15]. Другие исследования показывают, что КАТФ-каналы не принимают участия в расслабляющем влиянии H2S в подвздошной кишке морской свинки [18]. В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что регулирование H2S в ЖКТ находится под контролем целого ряда механизмов, и даже в пределах одного вида эффекты и механизмы действия газа различаются. Целью работы было выявление влияния H2S на двигательную активность тощей кишки крысы и анализ роли калиевых каналов в эффектах газа.
Методика исследований
Эксперименты по анализу спонтанной сократительной активности проводили на изолированных полосках сегмента тощей кишки взрослых крыс Rattus norvegicus. Для регистрации изометрических сокращений кишечника использовали установку для работы с изолированными органами фирмы Biopac Systems, Inc. (США) Перед проведением эксперимента животное анестезировалось с использованием 5 % изофлурана (Abbott Laboratories, North Chicago, IL, USA). Крысу декапитировали и производили препаровку. Брюшную полость вскрывали от лонного сочленения до грудины при помощи ножниц и вырезали отрезки тощей кишки длиной 8 мм. Для исследования сегмент тощей кишки подвешивали вертикально в ванночке объемом 20 мл, нижний конец сегмента фиксировали к резиновому блоку, другой конец соединяли с тензомет-рическим датчиком (TSD125C, Biopac Systems, Inc., США). При проведении экспериментов после закрепления сегмента кишечника проводили стабилизацию сокращений в течение 60 минут, после чего добавлялись исследуемые вещества. Регистрация и последующий анализ параметров сокращения препарата проводилась с помощью программы AcqKnowledge 4.1. Анализировали амплитуду сокращения, тоническое напряжение и частоту сокращения сегмента тонкого кишечника. Силу сокращения выражали в граммах. Для оценки тонического напряжения использовали значения максимального расслабления между сокращениями.
В экспериментах использовался раствор Тирода следующего состава (мМ): NaCl 121,0; KCl 5,9; CaCl2 2,5; MgCl2 1,2; NaHCO3 25,0; NaH2PO4 1,2; glucose 8,0 (pH 7,2-7,4), t = 37 °С. Раствор постоянно аэрировался смесью O2 95 % и CO2 5 % (карбоген).
H2S в экспериментах получали с помощью донора гидросульфида Na (NaHS). NaHS широко используется в научных исследованиях в качестве донора H2S [1], так как в водных растворах диссоциирует до иона натрия (Na+) и гидросульфидного аниона (HS), который реагирует с протоном (Н+), образуя H2S. Известно, что в физиологическом растворе одна треть H2S находится в недиссоциированной форме, а остальные две трети существуют в виде HS- (Abe, Kimura, 1996).
В экспериментах также использовали тетраэтиламмоний (ТЭА), 4-аминопиридин (4-АП), глибенкламид, диазоксид, L-цистеин, бета-цианоаланин, пропаргилглицин, аминоокси-ацетиловую кислоту (Sigma, США). Вещества, не растворимые в воде, растворяли в диметил-сульфоксиде (DMSO), который в используемой концентрации (не более 0,01 %) не оказывал влияния на спонтанную сократительную активность препарата.
Результаты исследования и их обсуждение
В контроле регистрировались спонтанные сокращения отрезка тощего кишечника, средняя частота которых составила 0,45 ±0,01 Гц и амплитуда 0,57 ±0,50 г (n = 20). Кумулятивная аппликация NaHS в концентрациях 10, 50, 100, 200 мкМ приводила к дозозависимому снижению амплитуды сокращений по сравнению с исходным уровнем. Дальнейшее повышение концентрации NaHS приводило к полному блокированию сократительной активности. Эффект газа был обратим, и сократительная активность полоски кишечника быстро возвращалась к исходным значениям при отмывке. В концентрации 200 мкМ NaHS снижал амплитуду сокраще-
ний до 19,6 ±2,8 % (п = 20, p < 0,05), тоническое напряжение - до 87,7 ±2,5 % (п = 20, p < 0,05), частоту - до 90,08 ±2,17 % (п = 21, р < 0,05) по сравнению с контролем (рис. 1).
Используемые нами концентрации NaHS находятся в пределах концентраций, используемых другими исследователями (10-3000 мкМ) (6, 15, 18). Данные концентрации не являются токсичными, так как сокращения быстро восстанавливаются после отмывки и после повторных аппликаций даже более высоких концентраций NaHS. С учетом того, что в наших экспериментальных условиях (^ = 37 °С) только 18 % NaHS образует H2S, действующие концентрации составляют от 1,8 до 36 мкМ. Несмотря на то что концентрации H2S, определяемые в тканях, находятся в наномолярных пределах, локальные концентрации газа могут быть намного выше, чем в плазме или ткани, так как Н^ освобождается локально вблизи мишени действия [12].
Надо также отметить, что в начальный период после добавления в ванночку NaHS в концентрации 200 мкМ в части экспериментов (9 из 20) наблюдалось повышение амплитуды спонтанных сокращений. В течение первой минуты после добавления вещества сила сокращений увеличивалась до 121,9 ±3,6 % (п = 9, р < 0,05), тоническое напряжение до 125,51 ±10,86 %, частота не изменялась - 101,78 ±1,3 %{п = 9, р > 0,05) (рис. 1).
NaHS (200 мкМ)
30 с
0.5 г
Рис. 1. Механограмма спонтанной сократительной активности отрезка тощей кишки крысы при аппликации NaHS в концентрации 200 мкМ
Известно, что H2S может синтезироваться в различных отделах ЖКТ у разных видов животных в процессе метаболизма L-цистеина как с помощью ферментов, так и сульфат-редуцирующими бактериями, являющимися частью нормальной энтеробактериальной флоры [5, 8, 12, 13, 16]. Сульфатредуцирующие бактерии (СРБ) ЖКТ в процессе метаболизма производят H2S. Доказательством связи чрезмерного уровня H2S и патологии толстой кишки является роль СРБ при язвенном колите и, возможно, раке прямой кишки. Показано, что уровень H2S в просвете ободочной кишки у человека достигает 1,0-2,4 мМ [14].
Эндогенно H2S в тканях млекопитающих образуется в процессе метаболизма L-цистеина, его синтез катализируется тремя ферментами: цистатионин бета синтазой (CBS), цистатионин гамма лиазой (CSE) и 3-меркаптопируват сульфтрансферазой [2, 8]. Для выявления эндогенного синтеза H2S в клетках кишечника мы использовали его субстрат синтеза - L-цистеин, а также блокаторы фермента CSE пропаргилглицин и бета-циаоноаланин, блокатор CBS - аминооксиацетиловую кислоту (АОАК).
L-цистеин при кумулятивном добавлении 10, 50, 100, 200 мкМ и 1 мМ в конечной концентрации 1 мМ приводил к дозозависимому снижению амплитуды до 76,4 ±3,2 % (n = 7, p < 0,05), тонического напряжения до 78,8 ±7,5 % (n = 7, p < 0,05), не изменяя частоту спонтанных сокращений - 100,3 ±2,2 % (n = 7, p < 0,05) (рис. 2).
105п
Т
100-
95-
75-
*
*
70-
т-1—I—I I I |
1 I
10
100
1000
Lg [concentration], mkM
Рис. 2. Влияние субстрата синтеза сероводорода L-цистеина на параметры спонтанного сокращения сегмента тощей кишки крысы.
Представлены эффекты L-цистеина в условиях кумулятивной аппликации различных концентраций (10, 50, 100, 200 мкМ, 1 мМ) на амплитуду (квадрат), частоту (треугольник) спонтанных сокращений и тоническое напряжение (круг) относительно исходного уровня в % * - p<0.05 относительно исходных значений
Блокатор CSE пропаргилглицин в концентрации 1 мМ к 20-й минуте после добавления повышал амплитуду до 108,6 ±3,2 % (n = 6, p < 0,05) и тоническое напряжение до 110,5 ±2,4 % (n = 6, p < 0,05), не влияя на частоту - 99,6 ±0,7 % (n = 6, p < 0,05). Другой блокатор CSE - бета-цианоаланин (ß-ЦА) - в концентрации 500 мкМ повысил амплитуду до 121,76 ±6,3 % (n = 4, p < 0,05), частота и тонус сокращений достоверно не менялись. Ингибитор CBS аминооксиацети-ловая кислота (АОАК) не приводил к изменению амплитуды сокращения, незначительно снижая тонус и частоту, что, возможно, связано с неспецифическим влиянием данного блокатора.
Таким образом, субстрат синтеза H2S L-цистеин вызвал снижение силы сокращения и тонуса гладких мышц как и донор H2S, а блокаторы CSE вызывали обратный эффект, что, по-видимому, свидетельствует о возможности эндогенного синтеза газа в ткани кишечника. Отсутствие эффекта блокатора CBS может указывать на меньшую экспрессии этого фермента в тканях тощей кишки или отсутствие его тонической активности. Действительно, показаны различия в экспрессии ферментов синтеза H2S и эндогенных концентраций газа в различных отделах ЖКТ. Так, экспрессия CSE одинаково выражена в стенке желудка и тощей кишки крысы, тогда как экспрессия CBS преобладает в желудке, а синтез H2S в стенке желудка выше, чем в тощей кишке [13].
Известно, что К-каналы играют ключевую роль в поддержании тонуса гладких мышц, принимают участие в контроле сокращения гладкой мускулатуры ЖКТ, оказывая влияние на потенциал покоя, медленные волны деполяризации, длительность потенциала действия [9]. К-каналы могут являться мишенью действия NaHS в различных тканях. В нашем исследовании мы рассмотрели роль Ca2+-активируемых, потенциал-зависимых и АТФ-зависимых К-каналов в расслабляющем эффекте H2S на гладкие мышцы кишечника. Неспецифический блокатор Ca2-активируемых и потенциал-зависимых калиевых каналов - ТЭА в концентрации 10 мМ вызывал повышение амплитуды сокращений до 151,98 ±9,46 % (n = 9, p < 0,05) и тонического напряжения до 107,9 ±3,57 (n = 10, p < 0,05) относительно контроля, при этом частота сокращений
достоверно не изменялась. Повышение амплитуды сокращения при ингибировании К-каналов связано с увеличением длительности реполяризации потенциалов действия гладкомышечных клеток и усилением входа ионов Са2+, запускающих процесс сокращения. В условиях блокирования К-каналов ТЭА эффекты NaHS на амплитуду, тоническое напряжение и частоту сокращений полностью сохранялись.
По проводимости различают Са2 -активируемые калиевые каналы большой (ВК-каналы) и малой проводимости ^К-каналы). SK-каналы слабо чувствительны к ТЭА, поэтому для выявления роли SK-каналов в эффектах Н^ использовали ингибитор NS 8593 в концентрации 4 мкМ, аппликация которого не приводила к достоверному изменению параметров спонтанного сокращения. На фоне действия NS 8593 эффекты NaHS на амплитуду, частоту и тоническое напряжение полоски сохранялись - 26,11 ±5,76 %, 92,84 ±2,26 % и 88,04 ±3,7 % (п = 6, р < 0,05) соответственно.
Блокатор потенциал-зависимых К-каналов 4-АП в концентрации 200 мкМ приводил к повышению амплитуды до 121,4 ±4,8 % (п = 6, р < 0,05) относительно контроля, при этом частота сокращений и тоническое напряжение не изменялись. На его фоне эффект NaHS на амплитуду и мышечный тонус сохранялся, тогда как на частоту сокращения не проявлялся. Полученные результаты указывают, что кальций-активируемые калиевые каналы не принимают участия в эффектах Н^ на сократимости гладких мышц кишечника, тогда как активирующий эффект NaHS на потенциал-зависимые К-каналы пейсмекерных клеток может опосредовать его эффекты на частоту сокращений.
Известно, что в сосудистых гладкомышечных клетках эффекты NaHS опосредуются через активацию КАТФ-каналов [6, 3, 19]. Для выявления роли КАТФ-каналов рассматривали эффекты донора Н^ на фоне блокирования и активации этих каналов. Ингибитор КАТФ-каналов глибенкламид в концентрации 50 мкМ приводил к понижению амплитуды сокращений до 63,84 ±5,93 % (п = 10, р < 0,05) и частоты до 90,73 ±1,91 % (п = 10, р < 0,05), тоническое напряжение при этом не менялось - 103,52 ±3,07 %{п= 10, р > 0,05) (рис. 3).
Рис. 3. Эффекты сероводорода на параметры спонтанной активности сегмента тощей кишки крысы на фоне блокатора КАТР-каналов глибенкламида.
Представлены эффекты глибенкламида (50 мкМ) на параметры относительно контроля (белый столбик), NaHS (200 мкМ) на фоне глибенкламида (серый столбик) и NaHS (200 мкМ) в контроле (темно-серый столбик).
Снижение базовой спонтанной активности под действием глибенкламида наблюдалось и в подвздошной кишке крысы, что указывает на роль этих каналов в модуляции спонтанной активности [15]. На фоне действия глибенкламида эффект NaHS на амплитуду и частоту сокращений полностью сохранялся (22,60 ±4,39 % и 86,88 ±1.99 % соответственно), тогда как тоническое напряжение достоверно повысилось до 111,65 ±3,83 % (п = 10, р < 0,05) (рис.3). При этом в первую минуту аппликации КаН8 на фоне глибенкламида эффект активирующий эффект на амплитуду сокращения был выражен больше, чем в контроле, однако тоническое напряжение не изменялось. Данные представлены в табл. 1.
Таблица 1. Влияние гидросульфида натрия на амплитуду и тонус гладко-мышечных клеток кишечника в начале и в конце аппликации
Время аппликации 1 мин 20 мин
Параметры сократительной активности МаШ глибенкламид + МаШ МаШ глибенкламид + МаШ
Амплитуда 122 + 3,6* 182,5 + 30,3*# 19,6 ±2,8* 22,6 ±4,4*
Тоническое напряжение 125,5 + 10,8* 103,6 + 3,3# 87,7 ±2,5* 111,65 ±3,8*#
* - р < 0,05 относительно исходных значений
# - р < 0,05 относительно эффекта
Роль данных типов каналов также подтверждают и исследования механизмов действия NaHS в тонком и толстом кишечнике, где апамин и глибенкламид частично снимали ингиби-торные эффекты NaHS [6]. Для активации КАТФ-каналов использовали диазоксид (100 мкМ). Диазоксид вызывал снижение силы сокращения сегмента тощей кишки до 68 ±8 % (п = 4, р < 0,05) от контрольных значений, не изменяя частоты спонтанных сокращений и тонического напряжения (рис. 4). Добавление NaHS на фоне диазоксида приводило к снижению частоты сокращений такому же, как и в контроле, эффект NaHS на тоническое напряжение не проявлялся, а снижение амплитуды сокращений было выражено в меньшей степени, чем в контроле (рис. 4).
Рис. 4. Эффекты сероводорода на параметры спонтанной активности сегмента тощей кишки крысы.на фоне активатора КАТР каналов диазоксида.
Представлены эффекты диазоксида (100 мкМ) на параметры относительно контроля (белый столбик), NaHS (200 мкМ) на фоне диазоксида (серый столбик) и (200 мкМ) в контроле
(темно-серый столбик)
Таким образом, результаты нашего исследования показали, что как экзогенный, так и эндогенный H2S вызывали дозозависимое снижение параметров сократительной активности тощей кишки крысы. При этом эффекты NaHS на тоническое напряжение гладкомышечных клеток кишечника могут опосредоваться активацией АТФ-зависимых К-каналов, однако, влияние на амплитуду сокращения связано с другими механизмами действия.
Работа поддержана гратом РФФИ № 14-04-31661
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Abe K. The possible role of hydrogen sulfide as an endogenous neuromodulator / K. Abe, H. Kimura // J. Neurosci. - 1996. - V. 16. - P. 1066-1071.
2. Beauchamp R.O. A critical review of the literature on hydrogen sulfide toxicity / R.O. Beauchamp, J.S. Bus, J.A. Popp, C.J. Boreiko, D.A. Andjelkovich // Critical Reviews in Toxicology. - 1984. - V. 13. - P. 25-97.
3. Distrutti E. 5-Amino-2-hydroxybenzoic acid 4-(5-thioxo-5H-[1,2]dithiol-3yl)-phenyl ester (ATB-429), a hydrogen sulfide-releasing derivative of mesalamine, exerts antinociceptive effects in a model of postinflammatory hypersensitivity / E. Distrutti, L. Sediari, A. Mencarelli et al. // J Pharmacol Exp Ther. - 2006. - V. 319(1). - P. 447-458.
4. Dhaese I. Mechanisms of action of hydrogen sulfide in relaxation of mouse distal colonic smooth muscle / I. Dhaese, I. Van Colen, R.A. Lefebvre // European Journal of Pharmacology. - 2009. -V. 628.- P. 179-186.
5. Fiorucci S. The emerging roles of hydrogen sulfide in the gastrointestinal tract and liver / S. Fiorucci, E. Distrutti, G. Cirino, J.L. Wallace // Gastroenterology. - 2006.- V. 131.- P. 259-271.
6. Gallego D. The gaseous mediator, hydrogen sulphide, inhibits in vitro motor patterns in the human, rat and mouse colon and jejunum / D. Gallego, P. Clave, J. Donovan et al. // Neurogatroenterol Motil. - 2008. - V. 20. - P. 1306-1316.
7. Hennig B. Actions of hydrogen sulphide on ion transport across rat distal colon / B. Hennig, M. Diener // Br J Pharmacol. - 2009. - V. 158(5). - P. 1263-1275.
8. Hosoki R. The possible role of hydrogen sulfide as an endogenous smooth muscle relaxant in synergy with nitric oxide / R. Hosoki, N. Matsuki, H. Kimura // Biochem Biophys Res Commun.
- 1997. - V. 237. - P. 527-531.
9. Horowitz B., Ward S.M., Sanders K M. // Annu. Rev. Physiol. - 1999. - V. 61. - P.19-43.
10. Kasparek M.S. Hydrogen sulfide modulates contractile function in rat jejunum / M.S. Kasparek, D R. Linden, G. Farrugia, M.G. Sarr // J Surg Res. - 2012. - V. 175. - P. 234-242.
11. Kubo S. Hydrogen sulfide causes relaxation in mouse bronchial smooth muscle / S. Kubo, I. Doe, Y. Kurokawa, A. Kawabata // J. Pharmacol. Sci. - 2007. - V. 104. - P. 392-396.
12. Linden D.R. Endogenous production of H2S in the gastrointestinal tract: still in search of a physiologic function / D.R. Linden, M.D. Levitt, G. Farrugia, J.H. Szurszewski // Antioxidants & redox signaling. - 2010. - V. 12. - P. 1135-1146.
13. Martin G.R. Hydrogen sulphide synthesis in the rat and mouse gastrointestinal tract / G.R. Martin, G.W. McKnight, M.S. Dicay et al. // Digestive and Liver Disease. - 2010. - V. 42. - P. 103-109.
14. Mekki M. Emerging role of hydrogen sulfide in colonic physiology and pathophysiology / M. Mekki, D. Collins, N. Docherty et al. // Inflammatory Bowel Diseases. - 2011. - V.17. -P.1620-1625.
15. Nagao M. Role of hydrogen sulfide as a gasotransmitter in modulating contractile activity of circular muscle of rat jejunum / M. Nagao, J.A. Duenes, M.G. Sarr // J Gastrointest Surg. - 2012.
- V.16. - P. 334-343.
16. Schicho R. Hydrogen sulfide is a novel prosecretory neuromodulator in the Guinea-pig and human colon / R. Schicho, D. Krueger, F. Zeller et al. // Gastroenterology. - 2006. - V. 131(5). - P. 1542-1552.
17. Tang C.S. Hydrogen sulfide as a new endogenous gaseous transmitter in the cardiovascular system / C.S.Tang, X.H.Li, J.B.Du // Curr. Vasc. Pharmacol. - 2006. - V. 4. - P. 17-22.
18. Teague B. The smooth muscle relaxant effect of hydrogen sulphide in vitro: evidence for a physiological role to control intestinal contractility / B. Teague, S. Asiedu, P.K. Moore // Br. J. Pharmacol. - 2002. - V. 137. - P. 139-145.
19. Zhao W. The vasorelaxant effect of H2S as a novel endogenous gaseous KATP channel opener / W.Zhao, J.Zhang, Y.Lu, R.Wang // EMBO J. 20. - 2001. - P. 6008-6016.
Поступила 20.01.2015 г.
